生化技術(shù)-電泳技術(shù)課件

一電泳的基本原理電泳分離：移動(dòng)方向：帶電性質(zhì)決定泳動(dòng)度：帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的移動(dòng)速度。

μ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt影響μ的因素：1顆粒本身：帶電、大小、形狀2外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度E、pH、離子強(qiáng)度I、電滲、緩沖液粘度及溫度等。

牛牛文庫(kù)文檔分享一電泳的基本原理電泳分離：牛牛1二紙電泳以濾紙為支持體的電泳技術(shù)操作要點(diǎn)：1選擇緩沖液對(duì)顯色劑和紫外光吸收等觀察區(qū)帶的方法無(wú)影響A分離蛋白質(zhì)，pI≈5，選pH8.6的緩沖液（巴比妥緩沖液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)B分離氨基酸：鄰苯二甲酸氫鈉、磷酸—醋酸，pH5.9C分離核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，檸檬酸pH2~3D分離糖類：HAC-NaAC,pH3~5

牛牛文庫(kù)文檔分享二紙電泳以濾紙為支持體的電泳技術(shù)22濾紙的選擇與處理層析用濾紙，紙寬2～3cm/樣品組分，長(zhǎng)短影響電場(chǎng)強(qiáng)度。3點(diǎn)樣點(diǎn)圓點(diǎn)（量少）、點(diǎn)條狀（一般），點(diǎn)中間（未知樣品）、點(diǎn)一邊（已知樣品）干法、濕法4電泳電橋水平、加蓋、電壓穩(wěn)定、注意時(shí)間5顯色及分析蛋白：溴酚蘭、氨黑10B、偶氮胭脂紅BAa：茚三酮、靛紅核酸：紫外光下觀察一般洗脫定量

牛牛文庫(kù)文檔分享2濾紙的選擇與處理牛牛文庫(kù)文檔3三薄膜電泳支持體：薄膜優(yōu)點(diǎn)：分辨力較高、簡(jiǎn)便、快速、區(qū)帶清晰、易于定量、便于保存廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和同工酶等的分離分析操作1薄膜的處理與放置2點(diǎn)樣平衡3電泳：E10~25V/cm，0.5～2h4顯色

牛牛文庫(kù)文檔分享三薄膜電泳支持體：薄膜牛牛文庫(kù)4四薄層電泳將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳。常用支持物：淀粉、瓊脂、纖維素粉、硅膠等操作：1緩沖液選擇離子強(qiáng)度較高的緩沖液2支持物處理精制品3薄層板制作4加樣：挖溝、混合樣品、填埋5電泳6分析：印染法

牛牛文庫(kù)文檔分享四薄層電泳將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳。w5五凝膠電泳支持物：多孔凝膠聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等具有電泳和分子篩的雙重作用，分辨力高最常用聚丙烯酰胺凝膠，原因：機(jī)械強(qiáng)度好，透明有彈性，穩(wěn)定，無(wú)吸附作用和電滲作用，可制成不同孔徑的凝膠。分類：垂直管型盤(pán)狀電泳、垂直板型電泳；連續(xù)、不連續(xù)、梯度、SDS凝膠電泳

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牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享81聚丙烯酰胺凝膠的制備丙稀酰胺（單體）＋N,N-甲叉雙丙稀酰胺（交聯(lián)劑）→（催化劑）→聚合催化劑：（1）過(guò)硫酸銨＋四甲基乙二胺（TEMED）（2）核黃素（VitB2）＋光改變單體濃度可改變凝膠孔徑交聯(lián)劑對(duì)孔徑有影響：5％最小根據(jù)要分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量選擇合適的單體濃度。

牛牛文庫(kù)文檔分享1聚丙烯酰胺凝膠的制備牛牛文庫(kù)92不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理不連續(xù)電泳含兩層或三層不同孔徑的凝膠，用不同pH值的緩沖液：樣品膠：大孔徑，pH6.7～6.8Tris-HCl緩沖液濃縮膠：與樣品膠相同分離膠：小孔徑，pH8.8～8.9Tris-HCl緩沖液

牛牛文庫(kù)文檔分享2不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理10樣品壓縮成層原理：電極緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸HCl→(解離）→Cl－，Cl－泳動(dòng)速度最快（快離子）CH2(NH2)COOH→(樣品膠、濃縮膠pH6.7~6.8）→CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳動(dòng)速度最慢（慢離子）蛋白質(zhì)（P）泳動(dòng)速度介于快慢離子之間電泳時(shí)，Cl－超過(guò)P走在最前面，其后形成一個(gè)離子濃度較低的低電導(dǎo)區(qū)→較高電位梯度→P和慢離子加速移動(dòng)→P壓縮成層樣品進(jìn)入分離膠后，pH為9.5（電泳過(guò)程實(shí)測(cè)），CH2(NH2)COO－增加，泳動(dòng)速度增大，很快超過(guò)P，P在均一的電位梯度和pH條件下分離

牛牛文庫(kù)文檔分享樣品壓縮成層原理：牛牛文庫(kù)文檔分11SDS-凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，P電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無(wú)關(guān)。加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使P二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到P分子上，形成P-SDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長(zhǎng)橢圓形，短軸一定，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度正比于P分子量。分離測(cè)定：測(cè)分子量（與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較）鑒定樣品純度（條帶數(shù)目）測(cè)定樣品P含量：掃描定量（比色）

牛牛文庫(kù)文檔分享SDS-凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，P電泳遷12凝膠電泳的操作要點(diǎn)1凝膠制備2電極緩沖液3樣品處理及加樣4電泳5染色與固定6脫色7分析

牛牛文庫(kù)文檔分享凝膠電泳的操作要點(diǎn)1凝膠制備牛13

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牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享15煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化

牛牛文庫(kù)文檔分享煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化www.niuwk.16六等電點(diǎn)聚焦電泳電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通已直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。P進(jìn)入時(shí)，不同的P移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的P得以分離。優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測(cè)定P或多肽的等電點(diǎn)。缺點(diǎn)：需無(wú)鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的P。

牛牛文庫(kù)文檔分享六等電點(diǎn)聚焦電泳電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通已直流電171穩(wěn)定的pH梯度的形成2兩性電解質(zhì)載體要求：由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備（有不同pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體）3支持pH梯度的介質(zhì)密度梯度溶液（用于自由電泳）凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠）4操作要點(diǎn)

pH梯度支持介質(zhì)的制備聚焦電泳檢測(cè)兩性電解質(zhì)載體的除去

牛牛文庫(kù)文檔分享1穩(wěn)定的pH梯度的形成牛牛文庫(kù)18電泳技術(shù)思考題1名詞解釋電泳、電泳分離技術(shù)、泳動(dòng)度、電滲、區(qū)帶電泳、相對(duì)遷移率、不連續(xù)凝膠電泳2影響泳動(dòng)度的主要因素有哪些？3區(qū)帶電泳的操作步驟一般有哪些？4如何制備聚丙烯酰胺凝膠？5不連續(xù)電泳樣品壓縮成層原理。6SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。7采用電泳技術(shù)如何測(cè)定蛋白質(zhì)分子量？如何測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)？

牛牛文庫(kù)文檔分享電泳技術(shù)思考題1名詞解釋牛牛文庫(kù)19一電泳的基本原理電泳分離：移動(dòng)方向：帶電性質(zhì)決定泳動(dòng)度：帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的移動(dòng)速度。

μ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt影響μ的因素：1顆粒本身：帶電、大小、形狀2外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度E、pH、離子強(qiáng)度I、電滲、緩沖液粘度及溫度等。

牛牛文庫(kù)文檔分享一電泳的基本原理電泳分離：牛牛20二紙電泳以濾紙為支持體的電泳技術(shù)操作要點(diǎn)：1選擇緩沖液對(duì)顯色劑和紫外光吸收等觀察區(qū)帶的方法無(wú)影響A分離蛋白質(zhì)，pI≈5，選pH8.6的緩沖液（巴比妥緩沖液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)B分離氨基酸：鄰苯二甲酸氫鈉、磷酸—醋酸，pH5.9C分離核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，檸檬酸pH2~3D分離糖類：HAC-NaAC,pH3~5

牛牛文庫(kù)文檔分享二紙電泳以濾紙為支持體的電泳技術(shù)212濾紙的選擇與處理層析用濾紙，紙寬2～3cm/樣品組分，長(zhǎng)短影響電場(chǎng)強(qiáng)度。3點(diǎn)樣點(diǎn)圓點(diǎn)（量少）、點(diǎn)條狀（一般），點(diǎn)中間（未知樣品）、點(diǎn)一邊（已知樣品）干法、濕法4電泳電橋水平、加蓋、電壓穩(wěn)定、注意時(shí)間5顯色及分析蛋白：溴酚蘭、氨黑10B、偶氮胭脂紅BAa：茚三酮、靛紅核酸：紫外光下觀察一般洗脫定量

牛牛文庫(kù)文檔分享2濾紙的選擇與處理牛牛文庫(kù)文檔22三薄膜電泳支持體：薄膜優(yōu)點(diǎn)：分辨力較高、簡(jiǎn)便、快速、區(qū)帶清晰、易于定量、便于保存廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和同工酶等的分離分析操作1薄膜的處理與放置2點(diǎn)樣平衡3電泳：E10~25V/cm，0.5～2h4顯色

牛牛文庫(kù)文檔分享三薄膜電泳支持體：薄膜牛牛文庫(kù)23四薄層電泳將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳。常用支持物：淀粉、瓊脂、纖維素粉、硅膠等操作：1緩沖液選擇離子強(qiáng)度較高的緩沖液2支持物處理精制品3薄層板制作4加樣：挖溝、混合樣品、填埋5電泳6分析：印染法

牛牛文庫(kù)文檔分享四薄層電泳將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳。w24五凝膠電泳支持物：多孔凝膠聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等具有電泳和分子篩的雙重作用，分辨力高最常用聚丙烯酰胺凝膠，原因：機(jī)械強(qiáng)度好，透明有彈性，穩(wěn)定，無(wú)吸附作用和電滲作用，可制成不同孔徑的凝膠。分類：垂直管型盤(pán)狀電泳、垂直板型電泳；連續(xù)、不連續(xù)、梯度、SDS凝膠電泳

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牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享271聚丙烯酰胺凝膠的制備丙稀酰胺（單體）＋N,N-甲叉雙丙稀酰胺（交聯(lián)劑）→（催化劑）→聚合催化劑：（1）過(guò)硫酸銨＋四甲基乙二胺（TEMED）（2）核黃素（VitB2）＋光改變單體濃度可改變凝膠孔徑交聯(lián)劑對(duì)孔徑有影響：5％最小根據(jù)要分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量選擇合適的單體濃度。

牛牛文庫(kù)文檔分享1聚丙烯酰胺凝膠的制備牛牛文庫(kù)282不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理不連續(xù)電泳含兩層或三層不同孔徑的凝膠，用不同pH值的緩沖液：樣品膠：大孔徑，pH6.7～6.8Tris-HCl緩沖液濃縮膠：與樣品膠相同分離膠：小孔徑，pH8.8～8.9Tris-HCl緩沖液

牛牛文庫(kù)文檔分享2不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理29樣品壓縮成層原理：電極緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸HCl→(解離）→Cl－，Cl－泳動(dòng)速度最快（快離子）CH2(NH2)COOH→(樣品膠、濃縮膠pH6.7~6.8）→CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳動(dòng)速度最慢（慢離子）蛋白質(zhì)（P）泳動(dòng)速度介于快慢離子之間電泳時(shí)，Cl－超過(guò)P走在最前面，其后形成一個(gè)離子濃度較低的低電導(dǎo)區(qū)→較高電位梯度→P和慢離子加速移動(dòng)→P壓縮成層樣品進(jìn)入分離膠后，pH為9.5（電泳過(guò)程實(shí)測(cè)），CH2(NH2)COO－增加，泳動(dòng)速度增大，很快超過(guò)P，P在均一的電位梯度和pH條件下分離

牛牛文庫(kù)文檔分享樣品壓縮成層原理：牛牛文庫(kù)文檔分30SDS-凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，P電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無(wú)關(guān)。加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使P二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到P分子上，形成P-SDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長(zhǎng)橢圓形，短軸一定，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度正比于P分子量。分離測(cè)定：測(cè)分子量（與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較）鑒定樣品純度（條帶數(shù)目）測(cè)定樣品P含量：掃描定量（比色）

牛牛文庫(kù)文檔分享SDS-凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，P電泳遷31凝膠電泳的操作要點(diǎn)1凝膠制備2電極緩沖液3樣品處理及加樣4電泳5染色與固定6脫色7分析

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牛牛文庫(kù)文檔分享牛牛文庫(kù)文檔分享34煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化

牛牛文庫(kù)文檔分享煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化www.niuwk.35六等電點(diǎn)聚焦電泳電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通已直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽(yáng)極