個體化藥學(xué)服務(wù)與基因相關(guān)概念-課件

個體化藥學(xué)服務(wù)與基因相關(guān)概念人類基因組計劃1990年正式啟動人類基因組測序計劃,2003年完成。

識別人類基因組的所有大約3萬個DNA測定組成人類基因組DNA的約30億對核苷酸的序列個體化用藥—主要潮流，大勢所趨WHO：2000年提出，21世紀(jì)步入“3P”時代—預(yù)防（preventive），預(yù)測（predictable)和個體化（personal）美國FDA：2006全美3600萬份用藥記錄中，880萬份（24.3%）使用了說明書中有基因組生物標(biāo)記信息的藥物。FDA：2013.12，已經(jīng)批準(zhǔn)超過200個需要患者基因信息指導(dǎo)才能準(zhǔn)確治療的藥物，涉及約40%的患者。三甲評審標(biāo)準(zhǔn)要求：進(jìn)行個體化給藥方案的研究與監(jiān)測Wewouldn’tthinkofbuyingshoesinasinglesize

我們不會愿意買只有一個尺碼的皮鞋Sowhyshouldwebesatisfiedwithone-size-fits-allmedicine?那為什么我們就滿足于千人一方呢？據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率在10%至20%，其中5%的患者會因?yàn)閲?yán)重的藥品不良反應(yīng)而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當(dāng)，藥品不良反應(yīng)致死占社會人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應(yīng)的發(fā)生往往是因?yàn)樗幬锓磻?yīng)的個體差異所致；個體差異使藥品的效果差異顯著。個體化藥學(xué)服務(wù)的必要性個體化藥學(xué)臨床應(yīng)用的意義降低醫(yī)療事故發(fā)生率縮短平均住院日提高醫(yī)院收入為臨床用藥提供更精確的指導(dǎo)（精準(zhǔn)劑量,減少不良反應(yīng)，藥物相互作用等）療效好療效不好或無療效毒副反應(yīng)藥物反應(yīng)的個體差異相同藥物治療的一組人群基因?環(huán)境?藥物不良反應(yīng)藥物效應(yīng)據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，各國住院病人發(fā)生藥品不良反應(yīng)的比率在10%至20%，其中5%的患者會因?yàn)閲?yán)重的藥品不良反應(yīng)而死亡。目前全世界死亡的病人中，約有1/3的患者死于用藥不當(dāng)，藥品不良反應(yīng)致死占社會人口死因的第4位。藥物毒性或不良反應(yīng)的發(fā)生往往是因?yàn)樗幬锓磻?yīng)的個體差異所致；個體差異使藥品的效果差異顯著。個體化藥學(xué)服務(wù)的必要性藥物有效率三環(huán)類抗抑郁藥50-80%阻滯藥65-85%ACE抑制藥70-90%5-HT1

抑制藥55-80%HMGCoA還原酶抑制藥70-90%干擾素30-70%抗惡性腫瘤藥30-80%

藥物劑量（mg）氯氮卓15-60

氯氮平25-600

奧氮平5-20普萘洛爾10-240美托洛爾12.5-200卡托普利6.25-25奈法唑酮50-300

纈沙坦80-320維拉帕米80-480利血平0.125-1相關(guān)藥物的劑量范圍各類常用藥物的有效率常用藥物的有效率與劑量0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%基因環(huán)境因素II糖尿病乳腺癌男性心肌梗死原發(fā)性高血壓病冠心病I糖尿病苯妥英鋰水揚(yáng)酸異戊巴比妥雙香豆素阿司匹林安替匹林保泰松遺傳和非遺傳因素在藥物代謝中的作用藥物代謝及疾病，遺傳與非遺傳的影響新的醫(yī)學(xué)模式:個體化治療（PersonalizedTherapy）根據(jù)分子診斷提出治療方案診斷分子診斷-預(yù)測反應(yīng)治療理想反應(yīng)藥理學(xué)+基因組學(xué)基因是載有特定生物遺傳信息的DNA分子片斷，人類基因包括兩大區(qū)域:1.編碼區(qū)(占5%);2.側(cè)翼序列

DNA分子是由腺嘌呤（A）、胞嘧啶(C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T，DNA專有）和尿嘧啶（U，RNA專有）堿基排列組成,每個人都存在差異，將其稱為多態(tài)性。人類的基因發(fā)現(xiàn)幾百萬由單一的堿基變換而形成的位點(diǎn)既SNP，它意味著個人間最小的遺傳差異。

A:腺嘌呤T:胸嘧啶G:鳥嘌呤C:胞嘧啶CGTTCTCTATTAACA……GCAAGAGATAATTGT……CGTGCTCTATTAACA……GCACGAGATAATTGT……藥物相關(guān)基因研究10q24.2Chromosome10CYP2C9gene9Exon55kb490AA10q24.2CGTASNPCYP2C9*1NormalenzymaticactivityGAGGACCGTGTTCAAGluAspArgValGln5’3’CYP2C9*2NoenzymaticactivityT430C>T(Arg144Cys)Cys單核苷酸多態(tài)性（SNP）導(dǎo)致人類遺傳易感性的重要因素導(dǎo)致人類藥物代謝和反應(yīng)差異的重要因素GT突變野生型突變型變態(tài)反應(yīng)藥動學(xué)代謝吸收、分布、排泄藥效學(xué)靶向結(jié)合作用免疫系統(tǒng)毒副作用治療作用藥物耐受藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物靶蛋白、受體人類白血球抗原藥物作用基因與藥物作用的關(guān)系原理基因蛋白合成舉例：抗癲癇藥丙戊酸鈉的相關(guān)代謝酶——CYP2C19其基因最主要的兩個突變位點(diǎn)

CYP2C19*2:第5外顯子681位G→ACYP2C19*3:第4外顯子636位G→A產(chǎn)生終止密碼，過早終止蛋白合成，產(chǎn)生無活性CYP2C19酶，降低對丙戊酸代謝，使其在體內(nèi)蓄積，發(fā)生毒副反應(yīng)18...CCATTGAC......CCATTGAC...…GGTAACTG...…GGTAACTG......CCATTGAC......CCGTTGAC...…GGTAACTG...…GGCAACTG......CCGTTGAC......CCGTTGAC...…GGCAACTG...…GGCAACTG...A/A野生型純合子單核苷酸多態(tài)性形成三種基因型和表型XXXA/a野生型雜合子a/a突變純合子高活性中活性低活性GCCCACCTCGCCCGCCTC甲病人乙病人WildtypeMutationWildtypeConcentrationMutationConcentrationTimeTimeCYP450CYP450

相同的劑量不同的血漿濃度P450酶活性與PD/PK值的關(guān)系吸收-慢

-快受體-缺失-豐富代謝

-慢速-中等-快速-超快速排泄

-緩慢-正常藥物體內(nèi)過程)吸收藥物代謝酶藥物轉(zhuǎn)運(yùn)分布藥物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝藥物代謝酶排泄藥物轉(zhuǎn)運(yùn)藥物相關(guān)基因研究CYP450

主要存在于肝微粒體中,它的活性決定藥物的代謝速率,與藥物的清除率有著直接關(guān)系。CYP450酶系的基因主要有CYP1,CYP2,CYP3三家族,有以下幾種重要的P450酶:CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。藥物代謝酶根據(jù)CYP2D6基因型調(diào)整抗抑郁藥劑量3839米帕明多慮平馬普替林曲米帕明地昔帕明去甲替林氯米帕明帕羅西丁文拉法辛阿米替林米安色林PMIMEMUM18213217480301288138174129928113217941811259811915292118138747593115135941161327084110130641159360148170523838%平均劑量關(guān)于CYP2D6的表型判斷舉例：關(guān)于CYP2D6的表型判斷，CYP2D6屬于細(xì)胞色素P450酶常見藥物代謝酶基因型及表型判斷Β1受體基因突變藥物計量調(diào)整Β1受體野生純合子高敏感性美托洛爾25mg/次，bid100%阿替洛爾50mg/次，qd100%比索洛爾5mg/次，qd100%雜合子中度敏感性美托洛爾25mg/次，bid150%阿替洛爾50mg/次，qd150%比索洛爾5mg/次，qd150%突變純合子低敏感性美托洛爾25mg/次，bid建議改用其他藥物阿替洛爾50mg/次，qd建議改用其他藥物比索洛爾5mg/次，qd建議改用其他藥物

美托洛爾，根據(jù)CYP2D6基因調(diào)整劑量CYP2D6(Genotype)美托洛爾劑量調(diào)整原則PM弱代謝型心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛?；驕p少75%劑量。其他適應(yīng)癥，警惕不良事件，如心動過緩、四肢冰冷?；驌Q藥，用阿替洛爾或比索洛爾。

IM中間代謝型心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛。或減少50%劑量。其他適應(yīng)癥，警惕不良事件，如心動過緩、四肢冰冷?；驌Q藥，用阿替洛爾或比索洛爾。UM超快代謝型心力衰竭：換藥，用比索洛爾或卡維地洛?；蛟谠u估療效和副作用的前提下，可將劑量滴定到正常劑量的250%。其他適應(yīng)癥，換藥，用阿替洛爾或比索洛爾?；蛟谠u估療效和副作用的前提下，可將劑量滴定到正常劑量的250%。

26項(xiàng)目類別檢測基因相關(guān)藥物檢測意義高血脂用藥基因檢測

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SLCO1B1)、ABCB1他汀類降脂藥基因突變者降低總膽固醇作用顯著減弱。硝酸甘油用藥基因檢測

ALDH2硝酸甘油基因突變導(dǎo)致硝酸甘油難以發(fā)揮有效作用。故基因有缺陷的患者，不能完全把硝酸甘油片當(dāng)作救命之舉。另外酒精的代謝能力也與該基因息息相關(guān)。

高血脂藥物及硝酸甘油項(xiàng)目類別檢測基因相關(guān)藥物檢測意義雌激素代謝酶

SULT1A1磺基轉(zhuǎn)移酶雌醇類藥物

該基因確實(shí)導(dǎo)致雌激素在卵巢等靶器官暴露值升高造成癌變。兒童智商基因

DIO2

突變兒童應(yīng)補(bǔ)充T4基因確實(shí)可造成智商低下，切8歲后無法治愈。

雌激素與兒童智商相關(guān)基因【英國《每日郵報》網(wǎng)站3月23日報道】科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種會增加兒童智商低下風(fēng)險的基因。這個發(fā)現(xiàn)意味著，在新生兒出生后不久對其進(jìn)行一項(xiàng)基因檢測，可能會有助于發(fā)現(xiàn)存在上述問題的嬰兒，甚至為應(yīng)對這一問題確定治療方案做好準(zhǔn)備?？茖W(xué)家認(rèn)識到，如果7歲以下兒童在體內(nèi)出現(xiàn)一種常見基因變異體的同時，甲狀腺激素水平也出現(xiàn)下降，那么他們的智商變得異常低下的可能性將為其他兒童的4倍。每年約有4%的新生兒帶有這種基因，而且體內(nèi)的甲狀腺激素水平較低。給這些兒童服用含有甲狀腺激素的藥片，或許可以幫助其大腦正常發(fā)育并達(dá)到正常水平的智商。每年將會有3萬名兒童因此受益。這項(xiàng)新研究的關(guān)注重點(diǎn)是與細(xì)胞內(nèi)甲狀腺激素的產(chǎn)生有關(guān)的Ⅱ型脫碘酶。研究人員此前已將這種酶的基因突變與包括糖尿病和高血壓在內(nèi)的其他健康問題聯(lián)系在一起。在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對3123名7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。這些兒童也接受了智商測試。體內(nèi)甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問題的兒童不會面臨更多智商低下的風(fēng)險。加的夫大學(xué)的皮特·泰勒博士說：“如果其他研究證實(shí)了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時進(jìn)行針對這種基因變異體的測試，將有助于識別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！毕嚓P(guān)研究結(jié)果是在于利物浦召開的英國內(nèi)分泌協(xié)會大會上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導(dǎo)致智商低下的研究在上述新研究中，加的夫大學(xué)和布里斯托爾大學(xué)的科學(xué)家對3123名7歲以下兒童的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。這些兒童也接受了智商測試。體內(nèi)甲狀腺激素水平較低且存在Ⅱ型脫碘酶變異體的那些兒童，智商低于85的可能性是其他兒童的4倍。而僅存在甲狀腺激素水平較低問題的兒童不會面臨更多智商低下的風(fēng)險。加的夫大學(xué)的皮特·泰勒博士說：“如果其他研究證實(shí)了我們的科研成果，那么，除了常規(guī)的新生兒甲狀腺激素篩查外，同時進(jìn)行針對這種基因變異體的測試，將有助于識別出今后最有可能變得智商低下的那些兒童?！毕嚓P(guān)研究結(jié)果是在于利物浦召開的英國內(nèi)分泌協(xié)會大會上發(fā)布的。

兒童DIO2基因突變導(dǎo)致智商低下的研究本世紀(jì)，腫瘤的藥物治療取得了巨大成就。但腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性和腫瘤藥物治療的個體差異常造成腫瘤化療的失敗，且引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。個體藥物治療的藥效和毒性的差異在很大程度上受到遺傳因素如藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物作用靶點(diǎn)等藥物相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性的影響。所以抗惡性腫瘤藥臨床有效率為30-80%腫瘤個體化治療與基因檢測根據(jù)病人的遺傳特征,選擇最有效的疾病治療方法，更好地控制疾病的進(jìn)展甚至預(yù)防疾病的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)最佳的醫(yī)學(xué)治療效果。

在合適的時間(RightTime)給合適的病人(RightPatient)施行合適的治療(RightTreatment),達(dá)到腫瘤個體化治療腫瘤個體化治療與基因檢測腫瘤個體化治療包括靶向治療和化療兩部分:靶向治療:通過實(shí)時定量、基因測序、FISH等技術(shù)檢測腫瘤患者基因拷貝及基因突變信息，根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行靶向治療。個體化化療：通過實(shí)時定量、基因分型、mRNA定量等技術(shù)，檢測患者腫瘤標(biāo)本或血液標(biāo)本的mRNA表達(dá)、DNA的SNP分型，確定患者對化療藥物的敏感性和毒性反應(yīng)并確定化療劑量。腫瘤個體化治療與基因檢測類型藥物檢測基因相關(guān)病癥適用樣本判斷標(biāo)準(zhǔn)基因多態(tài)性檢測卡鉑（碳鉑、卡波鉑）順鉑（順氯氨鉑，順式鉑）奧沙利鉑（樂沙定、奧正南、草鉑等）ABCB1XRCC1GSTP1非小細(xì)胞肺癌小細(xì)胞肺癌乳腺癌結(jié)直腸癌肝癌卵巢癌等石蠟、手術(shù)/穿刺樣本、全血（抗凝）等AA基因型，出現(xiàn)毒副作用的風(fēng)險最高，生存率降低，其次是AG型；GG型毒副作用風(fēng)險最低，生存率較高。氟尿嘧啶GSTP1非小細(xì)胞肺癌小細(xì)胞肺癌乳腺癌卵巢癌等AA基因型，毒性風(fēng)險最高，其次是AG型，GG型毒性風(fēng)險最低。伊立替康UGT1A1*28非小細(xì)胞肺癌等TA7突變者毒副作用增加，建議降低用藥量；劑量>250mg/m^2時，起始劑量減少30%。腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)與化療藥物類型藥物檢測基因相關(guān)病癥適用樣本判斷標(biāo)準(zhǔn)基因多態(tài)性檢測阿那曲唑（艾達(dá)、瑞斯意、瑞婷、瑞寧得）/來曲唑（芙瑞）CYP19A1乳腺癌等全血、血漿、血清、石蠟、手術(shù)/穿刺樣本等突變用藥顯著（純合/雜合）伊立替康（開普拓）UGT1大腸癌等野生型純合子用藥顯著SLCOIB1氟尿嘧啶DPYD直腸癌等野生純合子用藥顯著5FU藥物（5氟尿嘧啶等）ABCB1胃腸道乳腺癌等突變純合用藥顯著乳腺癌胃癌腸癌等野生純合用藥顯著順鉑（順氯氨鉑，順式鉑）奧沙利鉑（樂沙定、奧正南、草鉑等）ABCB1肺癌胃癌腸癌等野生純合用藥顯著突變用藥顯著（純合/雜合）突變用藥顯著（純合/雜合）突變基因與化療藥物腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測項(xiàng)目類別檢測基因相關(guān)藥物檢測意義腫瘤化療療效及毒副作用基因檢測GSTM1、GSTP1、MTHFR、XRCC1、XPD、XPG、ERCC1、TPMT、CYP2E1、CYP2C9、ABCB1鉑類藥物：順氯氨鉑(順鉑)；草酸鉑；奧沙利鉑等、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤、6-硫鳥嘌呤（6-TG），6-巰基嘌呤（6-MP）、硫唑嘌呤（AZA）、環(huán)磷酰胺、長春堿、FK506、依托泊苷1.GSTM1突變型在紫杉醇和順氯氨鉑治療后有較好的生存時間，降低急性粒系白血病治療時的復(fù)發(fā)。2.GSTP1突變型有利患者在化療中的生存。3.MTHFR突變的白血病患兒對于MTX的毒副反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險為未突變者的11.3倍。4.XRCC1突變型對5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑不敏感。5.XPG突變者用草酸鉑，客觀緩解率低。6.ERCC1突變型對含有鉑類藥物化療的敏感性高。果因PPT工作室/guoyinppt原位雜交技術(shù)

2014-03-19原位雜交技術(shù)一原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展二原位雜交技術(shù)的原理及分類三原位雜交技術(shù)的一般過程四原位雜交技術(shù)的應(yīng)用一、原位雜交技術(shù)的歷史發(fā)展

原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。1969年美國耶魯大學(xué)的Gall等首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，將該基因進(jìn)行定位，與此同時Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。自此以后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是20世紀(jì)70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展奠定了深厚的技術(shù)基礎(chǔ)。

二、原位雜交技術(shù)的原理及分類概念：原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織，細(xì)胞、間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位和相對定量研究的一種手段。原理：利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補(bǔ)配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。原位雜交法分類1、基因組原位雜交技術(shù)基因組原位雜交(GISH)技術(shù)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異，用另一物種的基因組DNA以適當(dāng)?shù)臐舛茸鞣庾瑁诎腥旧w上進(jìn)行原位雜交。

2、熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是在已有的放射性

原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放

射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記

的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切

片上的特異性雜交，通過熒光檢測系

統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測信號DNA序列在染色體或

DNA顯微切片上的目的DNA序列，進(jìn)而確定其雜

交位點(diǎn)。3、多彩色熒光原位雜交技術(shù)多彩色熒光原位雜交(mFISH)是在熒

光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的

一種新技術(shù)，它用幾種不同顏色的熒

光素單獨(dú)或混合標(biāo)記的探針進(jìn)行原位

雜交，能同時檢測多個靶位，各靶位

在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，

呈現(xiàn)多種色彩。4、原位PCR原位PCR技術(shù)是常規(guī)的原位雜交技術(shù)與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，即通過PCR技術(shù)對靶核酸序列在染色體上或組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位擴(kuò)增使其拷貝數(shù)增加，然后通過原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測，從而對靶核酸序列進(jìn)行定性、定位和定量分析。原位雜交法分類三、原位雜交技術(shù)的一般過程以經(jīng)過標(biāo)記的已知核酸分子為探針以細(xì)胞內(nèi)與探針序列互補(bǔ)的特異核酸分子為靶分子在一定條件下使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交再對其探測探針標(biāo)記靶核酸分子雜交檢測一）、探針

是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或RNA片段，是在原位雜交中用于檢測細(xì)胞內(nèi)特定DNA或RNA順序定位的特殊試劑，探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸1、cDNA(complementaryDNA)互補(bǔ)于mRNA的DNA分子（長度為數(shù)百-數(shù)千堿基對）⑴克隆于質(zhì)粒中，可以無限繁殖，取之不盡⑵較穩(wěn)定，不易被降解⑶標(biāo)記方法可靠易行優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：⑴雜交效率比DNA探針高

⑵在檢測mRNA時所形成的RNA-mRNA雜交體比DNA-mRNA雜交體穩(wěn)定

⑶可以同時得到同義RNA鏈和反義RNA鏈缺點(diǎn)：2、RNA

RNA是單鏈分子（探針長度50-300堿基對）容易受RNA酶的污染而被降解

這類探針是根據(jù)靶分子而設(shè)計序列在DNA合成儀上用化學(xué)方法合成

優(yōu)點(diǎn)：形成雜交體快速（序列短鏈，雜交時易于穿透）

缺點(diǎn)：特異性較低（短鏈和簡單）短鏈探針(長度10-50個核苷酸)3、寡核苷酸

二）、探針標(biāo)記1、標(biāo)記物

（1）放射性標(biāo)記物

（2）非放射性標(biāo)記物2、標(biāo)記方法

（1）DNA探針標(biāo)記

（2）RNA探針標(biāo)記

（3）寡核苷酸探針標(biāo)記

1、標(biāo)記物①高度靈敏性；②標(biāo)記物與核酸探針結(jié)合，應(yīng)絕對不能影響核酸探針與模板的結(jié)合能力及結(jié)合的特異性；③當(dāng)用酶促方法進(jìn)行標(biāo)記時，應(yīng)對酶促活性（Km值）無多大影響，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性；④高度特異性；⑤較高的化學(xué)穩(wěn)定性，保存時間長，標(biāo)記及檢測方法簡單；⑥對環(huán)境無污染，對人體無損傷；⑦價格低廉等。標(biāo)記物分類放射性標(biāo)記物：同位素35S、33P、32P和3H等非放射性標(biāo)記物：熒光素生物素地高辛

溴脫氧尿嘧啶等標(biāo)記分子：某種單核苷酸在單核苷酸分子中導(dǎo)入某個原子、功能基團(tuán)或側(cè)鏈分子作為標(biāo)記物，對堿基配對不造成影響標(biāo)記分子：放射性標(biāo)記分子：

35S-UTP35S-dATP

35S-dCTP

32P-UTP32P-dATP等等非放射性標(biāo)記分子：

四甲基羅達(dá)明-UTP

生物素-UTP(Bio-UTP)

地高辛-dUTP(Dig-dUTP)

溴脫氧尿嘧啶本身為標(biāo)記分子2、標(biāo)記方法（1）DNA探針標(biāo)記

切口移位法隨機(jī)引物法（2）RNA探針標(biāo)記

在體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)中與探針制備同時完成（3）寡核苷酸探針標(biāo)記

末端轉(zhuǎn)移法將放射性或非放射性的標(biāo)記分子在各種酶促反應(yīng)中參入探針分子切口平移法隨機(jī)引物法

三）、靶核酸分子靶分子（或靶序列）：指所要探測的核酸分子或核苷酸序列（DNA或RNA）

DNA——可以是中期染色體上的或是間期細(xì)胞核內(nèi)的，也可以是線粒體DNA或病毒DNARNA——可以是編碼細(xì)胞合成的任何蛋白質(zhì)分子的mRNA，也可以是核糖體rRNA線粒體或病毒RNA四）、雜交

1.雜交體

2.雜交條件

3.嚴(yán)格度的概念1、雜交體hybrids

DNA-DNADNA-RNARNA-RNA穩(wěn)定性依次是：DNA-DNA＜DNA-RNA＜RNA-RNADNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性2、雜交條件（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時間（1）、雜交液

①鈉鹽（雜交效率↑非特異反應(yīng)↓）②甲酰胺（使雜交所需溫度降低裂解紅細(xì)胞）

③硫酸葡聚糖（提高探針濃度）

④牛血清白蛋白和載體DNA等（阻斷探針與組織非特異結(jié)合，↓背景）雜交條件

（2）、探針濃度

探針濃度影響雜交反應(yīng)的速度

放射性標(biāo)記探針0.5μg/ml非放射性為2μg/ml最適宜的探針濃度要經(jīng)實(shí)驗(yàn)摸索得到確定（1）雜交液（2）探針濃度（3）溫度（4）pH（5）時間雜交條件（3）、溫度雜交時溫度一般低于相應(yīng)雜交體的Tm值25℃Tm值：是核酸的融解溫度，是一半雙鏈分子解鏈時的溫度）

當(dāng)雜交液含50%甲酰胺、鹽濃度0.75mol/L左右時雜交溫度：對DNA探針是42℃