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文檔簡介

蛋白質(zhì)含量的測定—Folin-酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍(lán)法（Brodford法）

一Folin-酚試劑法（Lowry法）目的和要求學(xué)習(xí)Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。進(jìn)一步掌握分光光度法——求標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確測定未知樣品、正確使用儀器

原理蛋白質(zhì)濃度可以從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如折射率、比重、紫外吸收等測定而得知：或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)、Folin-酚試劑反應(yīng)等方法來求算。其中雙縮脲法和Folin-酚法是一般實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的方法。它們操縱簡便、迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的設(shè)備，又能適合一般實(shí)驗(yàn)室的要求，若作一般的濃度測定較為適應(yīng)。Folin-酚法靈敏度高，較雙縮脲法靈敏100倍。本實(shí)驗(yàn)采用的是Folin-酚法。Folin-酚法所用的試劑由兩部分組成。試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑，可與蛋白質(zhì)中的肽鍵起顯色反應(yīng)。試劑乙（磷鎢酸和磷鉬酸混合液）在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸，故有此顏色反應(yīng)。因此，用Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量靈敏度較高。實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按下表操作管號BSA（300μg／mL）H2OPr.含量μg步驟12345600.20.40.60.81.01.00.80.60.40.20050100150200250各試管加入試劑甲5.0mL，混合后放置10分鐘，加入試劑乙0.5mL，立即混合，37度恒溫反應(yīng)20分鐘。以1號為參比，測A750的值。2.樣品（小白菜）液的提取稱取小白菜1-4克（菜桿2-4克，菜葉1-2克）置于研缽中，加5mL蒸餾水在低溫下研磨成勻漿，全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，并定容至刻度，然后抽濾，在3000rpm離心20分鐘，上層清液為提取液，待用。樣品的測定吸取提取液和稀釋250倍的血清液各1.0mL于試管中（三次重復(fù)），分別加5.0mL試劑甲，放置10分鐘后，加試劑乙0.5mL，立即混勻，恒溫37度反應(yīng)20分鐘，測A750的值。管號小白菜T或A管號血

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