儀器分第十二章 色譜法基礎(chǔ)

第十二章

色譜法基礎(chǔ)第一節(jié)概述一、概述二、色譜法分類三、色譜法的特點(diǎn)一、概述混合物最有效的分離、分析方法。俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。

色譜法是一種分離技術(shù)，試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。（動畫）色譜法

當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。（動畫）與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。

兩相及兩相的相對運(yùn)動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)二、色譜法分類

(1)氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）。按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜液相色譜(2)液相色譜：流動相為液體（也稱為淋洗液）。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。

離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹脂為固定相，不同ph值的水溶液為流動相。(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡單的色譜方法凝膠色譜法：測聚合物分子量分布。超臨界色譜:co2流動相。高效毛細(xì)管電泳:九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。三、色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。第十二章

色譜法基礎(chǔ)第二節(jié)色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語一、色譜流出曲線二、色譜曲線有關(guān)術(shù)語一、色譜流出曲線

色譜峰為正態(tài)分布時，色譜流出曲線上的濃度與時間的關(guān)系為：

當(dāng)色譜峰為非正態(tài)分布時，可按正態(tài)分布函數(shù)加指數(shù)衰減函數(shù)構(gòu)建關(guān)系式。二、色譜曲線有關(guān)術(shù)語1.基線

無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線。2.保留值

（1）時間表示的保留值

保留時間（tr）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間；死時間（tm）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間；

調(diào)整保留時間（tr

＇）：tr＇=

tr－tm

（動畫）（2）用體積表示的保留值

保留體積（vr）：

vr=tr×f0f0為柱出口處的載氣流量，單位：ml/min。

死體積（vm）：

vm=

tm×f0

調(diào)整保留體積(vr＇)：

v

r＇=vr－vm

（動畫）3.相對保留值r21組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′r2

/t′r1=v′r2/v′r1相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對這兩種組分的選擇性。4.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(y1/2)：色譜峰高一半處的寬度y1/2=2.354（3）峰底寬(wb)：wb=4第十二章

色譜法基礎(chǔ)第三節(jié)色譜法基本原理一、分配系數(shù)Ｋ和分配比k二、塔板理論三、速率理論一、分配系數(shù)Ｋ和分配比k

1.分配系數(shù)Ｋ

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的濃度（單位：g/ml）比，稱為分配系數(shù)，用k表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。分配系數(shù)Ｋ的討論

一定溫度下，組分的分配系數(shù)k越大，出峰越慢；試樣一定時，k主要取決于固定相性質(zhì)；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)k不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的k值是分離的基礎(chǔ)；某組分的k=0時，即不被固定相保留，最先流出。2.分配比k

在實(shí)際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。3.分配比可以由實(shí)驗測得。分配比也稱：

容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；3.分配系數(shù)k與分配比k的關(guān)系

式中β為相比。填充柱相比：6～35；毛細(xì)管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留時間越長。

vm為流動相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；

vs為固定相體積，對不同類型色譜柱，vs的含義不同；

氣-液色譜柱：vs為固定液體積；

氣-固色譜柱：vs為吸附劑表面容量；4.分配比與保留時間的關(guān)系

滯留因子（retardationfactor）：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子rs也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示：若組分和流動相通過長度為l的分離柱，需要的時間分別為tr和tm，則：由以上各式，可得：tr=tm(1+k)色譜理論

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；

塔板理論的假設(shè)：(1)在每一個平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；(2)將載氣看作成脈動（間歇）過程；(3)試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；(4)每次分配的分配系數(shù)相同。二、塔板理論-柱分離效能指標(biāo)

1.塔板理論（platetheory）半經(jīng)驗理論；將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；

色譜柱長：l，

虛擬的塔板間距離：h，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=l/h理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：保留時間包含死時間，在死時間內(nèi)不參與分配!2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tm時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：3.塔板理論的特點(diǎn)和不足(1)當(dāng)色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n

越大(塔板高度h越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)k相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。(4)塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。三、速率理論-影響柱效的因素1.速率方程（也稱范.弟姆特方程式）

h=a+b/u+c·u

h：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)減小a、b、c三項可提高柱效；存在著最佳流速；

a、b、c三項各與哪些因素有關(guān)？Ａ─渦流擴(kuò)散項

a=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，a↓，h↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。（動畫）Ｂ/ｕ—分子擴(kuò)散項

b=2νdgν

：彎曲因子，填充柱色譜，ν<1。dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;

(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，h↑(n↓)，分離變差;

(3)分子擴(kuò)散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴(kuò)散↑;(4)擴(kuò)散系數(shù)：dg

∝(m載氣)-1/2；m載氣↑，b值↓。（動畫）

k為容量因子；dg、dl為擴(kuò)散系數(shù)。

減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。Ｂ.ｕ—傳質(zhì)阻力項

傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力cg和液相傳質(zhì)阻力cl即：

c=（cg+cl）（動畫）2.載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時：

傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時：

分子擴(kuò)散項成為影響柱效的主要因素，流速,柱效。h-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度h對應(yīng)載氣流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。3.速率理論的要點(diǎn)(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。(2)通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。第十二章

色譜法基礎(chǔ)第四節(jié)分離度與基本色譜分離方程式一、分離度二、基本色譜分離方程式一、分離度

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學(xué)因素；

區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動力學(xué)因素。色譜分離中的四種情況如圖所示：討論：色譜分離中的四種情況的討論：①柱效較高，△k(分配系數(shù))較大,完全分離；②△k不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，，△k較大,但分離的不好；④△k小，柱效低，分離效果更差。分離度的表達(dá)式：r=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；r=1：分離程度98%；r=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。令wb(2)=wb(1)=wb（相鄰兩峰的峰底寬近似相等），引入相對保留值和塔板數(shù)，可導(dǎo)出下式：二、基本色譜分離方程式討論：（1）分離度與柱效

分離度與柱效的平方根成正比，r21一定時，增加柱效，可提高分離度，但組分保留時間增加且峰擴(kuò)展，分析時間長。（2）分離度與r21

增大r21是提高分離度的最有效方法，計算可知，在相同分離度下，當(dāng)r21增加一倍，需要的n有效減小10000倍。

增大r21的最有效方法是選擇合適的固定液。例題1：

在一定條件下，兩個組分的調(diào)整保留時間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即r=1.5。計算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長是多少？解：r21=100/85=1.18

n有效=16r2[r21/(r21—1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（塊）

l有效=n有效·h有效=1547×0.1=155cm

即柱長為1.55米時，兩組分可以得到完全分離。例題2：

在一定條件下，兩個組分的保留時間分別為12.2s和12.8s，計算分離度。要達(dá)到完全分離，即r=1.5，所需要的柱長。解：分離度：塔板數(shù)增加一倍，分離度增加多少？第十二章

色譜法基礎(chǔ)一、色譜的定性分析二、色譜定量分析方法第五節(jié)

色譜定性和定量分析一、色譜定性鑒定方法1.利用純物質(zhì)定性的方法

利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。

利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。

2.利用文獻(xiàn)保留值定性

利用相對保留值r21定性

相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進(jìn)行定性鑒定。3.保留指數(shù)

又稱kovats指數(shù)(Ⅰ)，是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測定方法：將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（ix）是通過選定兩個相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有z和z＋1個碳原子。被測物質(zhì)x的調(diào)整保留時間應(yīng)在相鄰兩個正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：保留指數(shù)計算方法4.與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法小型化的臺式色質(zhì)譜聯(lián)用儀（gc-ms；lc-ms）

色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定samplesample

58901.0deg/minhewlettpackardhewlettpackard5972amassselectivedetectordcba

abcdgaschromatograph(gc)massspectrometer(ms)separationidentificationbacd二、色譜定量分析方法1.峰面積的測量

（1）峰高（h）乘半峰寬（y1/2）法：近似將色譜峰當(dāng)作等腰三角形。此法算出的面積是實(shí)際峰面積的0.94倍：

a=1.064h·y1/2

（2）峰高乘平均峰寬法：當(dāng)峰形不對稱時，可在峰高0.15和0.85處分別測定峰寬，由下式計算峰面積：

a=h·（y

0.15+y

0.85）/2

（3）峰高乘保留時間法：在一定操作條件下，同系物的半峰寬與保留時間成正比，對于難于測量半峰寬的窄峰、重疊峰（未完全重疊），可用此法測定峰面積：

a=h·b·tr

（4）自動積分和微機(jī)處理法2.定量校