第十章 病毒類疫苗

第十章病毒類疫苗第一節(jié)概述1一.病毒類疫苗定義：用病毒、衣原體、立克次體或其衍生物制成，進入人體后使機體產(chǎn)生抵抗相應(yīng)細病毒能力的生物制品2種類1.按用途分類：脊髓灰質(zhì)炎、麻疹等疫苗2.按病毒培養(yǎng)的組織來源和制造方法分類：動物培養(yǎng)疫苗、雞胚培養(yǎng)疫苗、細胞培養(yǎng)疫苗、基因工程疫苗3.按理化性狀分類：①是否被滅活②是否被裂解③有無佐劑④物理狀態(tài)3二.病毒培養(yǎng)方法1.細胞培養(yǎng)法生物制品生產(chǎn)用細胞的分類：①原代細胞和二倍體細胞：用于疫苗的制備和分離及建立毒株②傳代細胞：用于檢定③雜交瘤細胞：用于制備單克隆抗體4生產(chǎn)用細胞庫的原始細胞庫、主細胞庫、工作細胞的三級管理模式原始細胞庫（PCB）

主細胞庫（MCB）

工作細胞庫（WCB）

52.雞胚培養(yǎng)法細胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)明之前被廣泛使用，雞胚來源容易，操作簡單，至今仍用于痘類病毒、黏液病毒等的研究，黃熱病疫苗、流感等疫苗仍用雞胚培養(yǎng)法生產(chǎn)63.動物培養(yǎng)法動物是最早用于病毒的分離、鑒定、和疫苗制備的材料，具有對人類病毒敏感、易飼養(yǎng)、繁殖快、顯性指標(biāo)明確等優(yōu)點，但動物攜帶的外源因子以及疫苗中殘留的動物組織均影響疫苗的安全性，必將被其他技術(shù)代替7三.疫苗生產(chǎn)用毒株和細胞的要求1.毒種要求1）來源必須建立毒株的完整資料，包括病毒分離、全面質(zhì)控、臨川研究等資料2）管理由SFDA批準(zhǔn)，國家指定機構(gòu)保存，三級管理模式管理，規(guī)定傳代水平內(nèi)使用83）質(zhì)控項目①鑒別試驗②病毒外源因子檢查③猴體神經(jīng)毒力試驗④免疫原性檢查⑤其他試驗92.細胞要求①原代細胞。小動物清潔級，雞群SPF級②二倍體細胞。由SFDA批準(zhǔn)，國家指定機構(gòu)保存，三級管理模式管理，規(guī)定傳代水平內(nèi)使用③傳代細胞。④細胞質(zhì)控。按藥典要求進行檢定10第二節(jié)肝炎疫苗肝炎病毒是一組以肝臟為主要宿主細胞的病毒，主要有甲、乙、丙、丁、戊、己、庚型7中肝炎病毒，其中能引起臨床疾病的主要是前五種11

12一.乙型肝炎病毒及乙肝疫苗1.乙肝的流行病學(xué)13

1）地區(qū)分布

WorldHealthOrganization.HepatitisB.Availableat:/emc-documents/hepatitis/docs/whocdscsrlyo20022/disease/world_distribution.html.AccessedJune1,2004.142）流行特點HBV感染轉(zhuǎn)成慢性感染的可能性與初始感染年齡呈負相關(guān)，如果患者沒能在6個月內(nèi)清除HBV，那么HBV將由急性轉(zhuǎn)為慢性，如果患者沒有臨床癥狀，肝功能檢驗正常，這些慢性感染者就是慢性攜帶者153）傳染源及傳播途徑乙肝的傳染源是乙肝患者和HBV攜帶者，其傳播途徑主要有兩條：①母嬰傳播，又叫垂直傳播②水平傳播，包括密切接觸、醫(yī)源性傳播、及性傳播等162.HBV的病原學(xué)1）在血液中存在的三種形態(tài)乙型肝炎病毒（Brooks

etal,2004）A.

多形性小球顆粒（20～22nm）

B.

桿狀顆粒

C.Dane顆粒（42nm）17①Dane顆粒（Murry

etal,1998）18②22nm小圓球顆粒，不含核酸，主要成分是乙肝表面抗原（Murry

etal,1998）19③桿狀顆粒，不含核酸，可能成為完整HBV的外殼（Murry

etal,1998）202）病毒的復(fù)制1．HBV吸附并進入肝細胞后，脫去衣殼，病毒的DNA進入肝細胞核內(nèi)。2．在DNA聚合酶的催化下，以負鏈DNA為模板，延長修補正鏈DNA裂隙區(qū)，使形成完整的環(huán)狀雙鏈DNA（convalentlyclosedcirculardouble-strandedDNA,cccDNA）。3．雙鏈DNA繼而形成超螺旋環(huán)狀DNA，在細胞RNA聚合酶的作用下，以負鏈DNA為模板，轉(zhuǎn)錄形成長度分別為2.1kb、2.4kb、0.8kb和3.5kbRNA。2.1kb和2.4kb

RNA作為mRNA翻譯表面蛋白；3.5kb

RNA除翻譯核心蛋白和DNA聚合酶外，還作為HBVDNA復(fù)制的模板，故亦稱其為前基因組（pregenome）。4．病毒的前基因組、蛋白引物及DNA聚合酶共同進入組裝好的病毒內(nèi)衣殼中。5．在病毒DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性作用下，自DR區(qū)開始，以前基因組RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄出全長的HBVDNA負鏈。在負鏈DNA合成過程中，前基因組被RNA酶降解。6．

病毒以新合成的負鏈DNA為模板，也自DR區(qū)開始復(fù)制互補的正鏈DNA。7．復(fù)制中的正鏈DNA（長短不等）與完整的負鏈DNA結(jié)合并包裝于內(nèi)衣殼中，再包上外衣殼成為病毒體，從細胞質(zhì)釋放至細胞外。21HBV復(fù)制周期示意圖（Brooks

etal,2004）223）HBV的抗原結(jié)構(gòu)（1）HBsAgPrange,R.andM.Werr(1999)23

HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要標(biāo)志。HBsAg具有抗原性，可引起機體產(chǎn)生特異保護性的抗-HBs，也是制備疫苗的最主要成分。HBsAg存在不同的血清亞型，各亞型均含有一共同抗原表位（稱為a抗原），此外，還有二組互相排斥的亞型抗原表位（d/y和w/r）。按不同的組合形式，構(gòu)成HBsAg四個基本亞型，即adr、adw、ayr、ayw。HBsAg血清型分布有明顯的地區(qū)差異，并與種族有關(guān)24（2）HBcAg

是從C基因的第2個起始子開始翻譯產(chǎn)生的核心蛋白，是Dane顆粒中核心結(jié)構(gòu)的組成成分，其外被HBsAg所覆蓋，故不易在血循環(huán)中檢出。HBcAg的抗原性強，能刺激機體產(chǎn)生強而持久的抗-HBc?？?HBcIgG在血中持續(xù)時間較長，為非保護性抗體；抗-HBcIgM的存在提示近期發(fā)生過HBV的活躍復(fù)制。HBcAg可在感染的肝細胞表面存在，能被殺傷性T細胞識別，在清除HBV感染細胞中有重要作用25（3）HBeAg

是從C基因的第1個起始子開始翻譯產(chǎn)生包含PreC及C序列的蛋白，該蛋白經(jīng)細胞內(nèi)蛋白酶切除其N端19個氨基酸及C端34個氨基酸后成為可分泌的e抗原。HBeAg為可溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生后分泌入血，通常在病毒大量復(fù)制時產(chǎn)生，故為HBV復(fù)制及具有強感染性的一個指標(biāo)。HBeAg可刺激機體產(chǎn)生抗-HBe，抗-HBe能與受染肝細胞表面的HBeAg結(jié)合，通過補體介導(dǎo)破壞受染的肝細胞，對清除HBV感染有一定的作用?？?HBe的出現(xiàn)有利于機體對病毒活躍復(fù)制的抑制。近年發(fā)現(xiàn)在一部分感染者中，HBV發(fā)生在PreC區(qū)出現(xiàn)終止密碼子的突變，而不能合成HBeAg，從而有利于病毒逃避被抗-HBe及相應(yīng)的細胞免疫所識別而清除，出現(xiàn)抗-HBe陰性而病毒大量增殖的情況。因此，對抗-HBe陰性的患者也應(yīng)注意檢測其血中的病毒DNA，以全面了解病情判斷預(yù)后264）乙肝病毒的感染和致病機制①肝細胞損傷主要是細胞介導(dǎo)的免疫病理損傷，CTL起主要作用，也可造成肝細胞損傷②損傷之后，暴露出肝細胞膜上的LSP，可作為自身抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生對肝細胞的自身免疫③感染后可形成多對抗原抗體復(fù)合物，沉積于肝內(nèi)或肝外的多種組織，引起Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)④感染后可使靶細胞膜上的MHC-Ⅰ表達低下影響CTL對靶細胞的作用273.乙肝疫苗1）第一代疫苗—血源疫苗利用生化方法從乙肝攜帶者的血漿中沉淀和純化HBV表面抗原，化學(xué)或加熱方法使殘留病毒滅活而制成，但是安全性得不到絕對保證，血漿來源受限，我國1998年停止了生產(chǎn)282）第二代疫苗—基因工程疫苗（1）表達系統(tǒng)酵母系統(tǒng)哺乳動物細胞系統(tǒng)（CHO細胞）痘苗病毒載體系統(tǒng)29（2）質(zhì)控鑒別試驗理化試驗效力試驗異常毒性試驗劑型及效期30（3）臨床使用效果三針免疫后的抗-HBs陽轉(zhuǎn)率達85%~100%，30μg阻斷母嬰傳播的保護效果為80%以上，接種6年后，抗-HBs陽轉(zhuǎn)率72%~74%313）新型乙肝疫苗的研制（1）乙型肝炎DNA疫苗主要是將HBsAg的基因重組到真核表達載體上，然后將質(zhì)粒（裸露DNA）直接注射動物，引起一系列的免疫效應(yīng)32DNA疫苗的構(gòu)建流程及作用機制33附：最近乙肝基因疫苗研究的文獻報道（感興趣的閱讀）1.BreakingBandTcelltoleranceusingcationiclipid--DNAcomplexes(CLDC)asavaccineadjuvantwithhepatitisBvirus(HBV)surfaceantigenintransgenicmiceexpressingHBV.AntiviralRes.2011Jun;90(3):227-30.2.GPC3fusedtoanalphaepitopeofHBsAgactsasanimmunetargetagainsthepatocellularcarcinomaassociatedwithhepatitisBvirus.HepatobiliaryPancreatDisInt.2011Apr;10(2):164-70.3.Comparisonofabacteriophage-deliveredDNAvaccineandacommerciallyavailablerecombinantproteinvaccineagainsthepatitisB.FEMSImmunolMedMicrobiol.2011Mar;61(2):197-2044.ProfilesofBandTcellimmuneresponseselicitedbydifferentformsofthehepatitisBvirussurfaceantigen.Vaccine.2010Oct21;28(45):7288-96.Epub2010Sep85.[EffectofpolyethyleneglycolasadjuvantonhepatitisBvirusDNAvaccineinvitro].WeiShengWuXueBao.2010Jul4;50(7):949-5434（2）多種分子質(zhì)量HBsAg亞單位疫苗將s、pres2、pres1同時重組到載體上制備能同時表達三種蛋白質(zhì)的亞單位疫苗，可進一步提高疫苗的免疫原性和效果（3）新型佐劑疫苗（4）轉(zhuǎn)基因植物疫苗（5）載體活疫苗35二.甲型肝炎疫苗1.概述甲型肝炎是由一種腸道傳染的病毒即HAV感染肝細胞而引起的急性傳染病，主要經(jīng)過糞－口途徑傳播，可造成暴發(fā)或散發(fā)流行，潛伏期短，發(fā)病較急，一般不轉(zhuǎn)為慢性，亦無慢性攜帶者，預(yù)后良好。362.甲肝病毒的病原學(xué)及其致病機制

球形顆粒，無包膜基因組:線狀+ssRNA，衣殼:20面體立體對稱，由VP1～VP4等4種多肽組成，其中VP1是主要的衣殼蛋白，其抗體能中和HAV。至今，世界各地HAV只發(fā)現(xiàn)一個血清型。

37HAV主要侵犯兒童和青年，且多為隱性感染:HAV口小腸淋巴結(jié)內(nèi)增殖血（病毒血癥）肝細胞內(nèi)增殖致?。ǔ霈F(xiàn)臨床癥狀）急性期排毒量Ab383.甲肝疫苗1）甲肝病毒滅活疫苗用人二倍體成纖維細胞系復(fù)制擴增，經(jīng)富集純化后，甲醛變性，用氫氧化鋁吸附制得，優(yōu)點是安全保護作用較持久，缺點是價格比較高392）甲肝病毒減毒活疫苗（1）毒株H2株、L-A-1株（2）生產(chǎn)用細胞及培養(yǎng)方法KMB-17和2BS細胞株靜止或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)（3）質(zhì)控理化試驗、鑒別試驗、無菌試驗、異常毒性試驗（4）劑型及有效期403）新型甲肝疫苗的研究（1）聯(lián)合疫苗HAV-HBV二聯(lián)滅活疫苗、甲肝-乙腦二聯(lián)活疫苗等（2）基因工程疫苗①基因重組載體活疫苗②基因工程亞單位疫苗（3）新型佐劑或口服疫苗41三.丙型肝炎病毒及丙肝疫苗1.概述丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）引起丙型肝炎。HCV主要經(jīng)血或血制品傳播，目前占輸血后肝炎的80%～90%。在我國丙型肝炎流行率為2.1%。其臨床和流行病學(xué)特點類似乙型肝炎，但癥狀較輕，演變?yōu)槁哉叨嘁姡糠只颊呖砂l(fā)展為肝硬化或肝癌。422.丙肝病毒的病原學(xué)血清中病毒含量少，直到1991年日本學(xué)者阿部賢治才在免疫電鏡下觀察到HCV顆粒。病毒直徑36--62nm，球形，與黃病毒相似。HCV基因組結(jié)構(gòu)HCVRNA全長約10kb含三個編碼區(qū)C區(qū)（高度保守）核心蛋白（C）E1區(qū)膜蛋白1（E1）E2區(qū)（易變）膜蛋白2（E2）433.丙肝病毒的感染和機體的免疫反應(yīng)①HCV能引起長期感染，即使體內(nèi)產(chǎn)生有針對HCV的特異B、T淋巴細胞，仍能出現(xiàn)長期感染②HCV如同HIV一樣具有很高的變異性③沒有足夠證據(jù)表明在清除了HCV的患者體內(nèi)，產(chǎn)生了長期的針對HCV的免疫力，相反HCV再度感染并導(dǎo)致肝臟病變的可能性很高444.丙肝疫苗的研制1）基因工程亞單位疫苗在Hela細胞中表達E1、E2蛋白，或者用昆蟲細胞表達結(jié)構(gòu)蛋白并形成病毒樣顆粒，免疫動物均能產(chǎn)生免疫保護作用2）丙肝病毒的DNA疫苗研究最多的是HCV核心蛋白，因為這一蛋白具有高度的同源性，同時加用細胞因子作為免疫佐劑可增強體液和細胞免疫45四.戊型肝炎病毒及其疫苗的研究戊型肝炎病毒（HEV）為單股正鏈RNA病毒，現(xiàn)認(rèn)為屬杯狀病毒屬。應(yīng)用免疫電鏡（IEM）技術(shù)觀察到的病毒樣顆粒，各地報告不完全相同，存在著HEV序列的差異，但這些病毒顆粒間有明顯的交叉反應(yīng)，提示HEV可能只有一個血清型。46HEV尚不能體外培養(yǎng)，尚無滅活病毒疫苗和減毒活疫苗的報道，基因工程疫苗的研究側(cè)重于下面兩個方面①用重組DNA技術(shù)表達HEV第二個讀碼框編碼的蛋白，作為亞單位疫苗②用表達HEV第三個讀碼框蛋白的質(zhì)粒作DNA疫苗47第三節(jié)艾滋病疫苗AIDS由反轉(zhuǎn)錄病毒—人免疫缺陷病毒（HIV）引起，對人類T淋巴細胞的T4亞群有嗜性48一.艾滋病的流行病學(xué)截至2010年10月底，累計報告艾滋病病毒感染者和病人37萬余例，其中死亡6.8萬余例。但是根據(jù)早前衛(wèi)生部和聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署、世界衛(wèi)生組織聯(lián)合評估結(jié)果表明：截至2009年底，我國現(xiàn)存活艾滋病病毒感染者和病人約74萬人，其中病人約10.5萬人；2009年新發(fā)感染者約4.8萬人，因艾滋病相關(guān)死亡約2.6萬人。局部地區(qū)和特定人群疫情嚴(yán)重，云南、廣西、河南、四川、新疆和廣東6省區(qū)累計報告感染者和病人數(shù)占全國77.2%。49艾滋病的三大傳播途徑性途徑傳播血液途徑傳播母嬰途徑傳播50二.HIV的病原學(xué)1.病原體—HIVHIV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，存在兩種型別：HIV-1：AIDS感染的主要毒株，全球范圍內(nèi)流行，一旦感染便終身帶毒HIV-2：局限于西非，生物學(xué)特性與HIV-1相似，但其毒力較弱，致病性較低512.HIV的形態(tài)結(jié)構(gòu)HIV呈球形，直徑為100～120nm。典型的HIV-1顆粒由核心和包膜兩部分組成，核心包括病毒RNA、核心結(jié)構(gòu)蛋白和病毒復(fù)制所必須的酶類。HIV的RNA為兩條相同拷貝的正股RNA鏈。與RNA連在一起的是病毒的酶類，包括：①逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）；②整合酶（INT，P32）③蛋白酶。核酸外面為病毒衣殼蛋白（P24，P17）。病毒的最外層為包膜，其中嵌有g(shù)p120和gp41兩種特異性糖蛋白，前者構(gòu)成病毒表面刺突為外膜糖蛋白，后者為跨膜糖蛋白52HIV結(jié)構(gòu)模式圖533.HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白組成

HIV基因組兩條正股RNA鏈在5’端通過部分堿基互補配對而成雙聚體。病毒基因全長約9.7kb，含有g(shù)ag、pol、env3個結(jié)構(gòu)基因、2個調(diào)節(jié)基因和4個輔助基因，分別稱為tat（反式激活因子）、rev（毒粒蛋白表達調(diào)節(jié)子）；nef（負調(diào)控因子）、vpr（病毒r蛋白）、vpu（病毒u蛋白）和vif（毒粒感染性因子）。由于HIV基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜而被稱為復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒。54①結(jié)構(gòu)基因HIV-1結(jié)構(gòu)基因包括編碼病毒核心蛋白的gag基因，編碼病毒包膜蛋白的env基因，以及編碼病毒復(fù)制關(guān)鍵酶類的pol基因3個基因。②調(diào)節(jié)基因HIV-1病毒的非結(jié)構(gòu)基因包括兩個調(diào)節(jié)基因tat和rev，其編碼的蛋白對HIV復(fù)制均具有反式激活作用。③功能輔助基因包括Vif蛋白、Vpr蛋白、Ne蛋白、vpu基因、LTR等，各有其結(jié)構(gòu)、功能和意義。55564.HIV的復(fù)制和潛伏病毒識別宿主細胞后，與宿主細胞結(jié)合，釋放其內(nèi)容物到宿主細胞內(nèi)。在細胞內(nèi)宿主蛋白酶等作用下，首先清除病毒包膜蛋白。然后利用宿主酶進行宿主基因組復(fù)制。主要過程包括以下主要分子生物學(xué)步驟：571．病毒與靶細胞膜的融合2．病毒外膜的裂解3．裂解后釋放的病毒RNA利用自身逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，合成病毒基因組cDNA。4．病毒的潛伏5．病毒基因的表達6．病毒的組裝和成熟585.HIV基因和蛋白的變異HIV是一種高度變異的病毒，但其各基因變異或保守的程度不一樣，其變異率依次為pal（3%）、gag（6%）、env（22%）。核心抗原和各種蛋白酶很保守596.HIV感染的免疫應(yīng)答機體的免疫系統(tǒng)對HIV的初期感染起一定的抑制作用，但隨著免疫系統(tǒng)的損害及HIV的變異，機體的免疫系統(tǒng)最終對HIV的感染無能為力。HIV感染能激發(fā)機體產(chǎn)生特異的細胞免疫反應(yīng)和對各種病毒抗原產(chǎn)生相應(yīng)抗體。機體產(chǎn)生T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用，HIV感染者腦部有T淋巴細胞浸潤。CD8+T淋巴細胞對HIV病毒的抑制，溶解感染HIV的靶細胞，說明T細胞在HIV感染中發(fā)揮抑制HIV復(fù)制作用。60機體產(chǎn)生的抗體可以中和游離HIV病毒及已和細胞結(jié)合的而尚未進入細胞內(nèi)的HIV顆粒。自然殺傷細胞（NK）和殺傷細胞（K細胞）通過抗體依賴性細胞毒性作用能殺傷和溶解HIV感染的細胞。機體的細胞免疫和體液免疫作用可在一段時間內(nèi)控制HIV的復(fù)制及擴散。但是，由于病毒的變異和重組，可以逃脫免疫監(jiān)視，不能被機體的免疫系統(tǒng)徹底清除。當(dāng)機體的免疫系統(tǒng)被進一步破壞時，在某些觸發(fā)因素的作用下，使HIV大量復(fù)制和播散，最終導(dǎo)致AIDS的發(fā)生。617.HIV的發(fā)病機制①HIV侵入T4細胞，引起免疫缺陷，導(dǎo)致機會感染和腫瘤②HIV感染單核細胞，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦損傷，出現(xiàn)癡呆和慢性腦病62三.AIDS疫苗的研究1.目前研制AIDS疫苗的困難和對策1）HIV的基因變異率極高2）HIV能建立潛伏感染并能在細胞間傳播3）HIV可直接侵犯免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)4）尚缺乏能如實產(chǎn)生人類AIDS的HIV動物模型632.研制AIDS疫苗的可行性①人體免疫系統(tǒng)在某些情況下能夠控制HIV感染②有些實驗性HIV疫苗可以保護非人靈長類動物免患艾滋病或艾滋病樣疾病③感染HIV-2可降低HIV-1感染的可能性643.目前研究和開發(fā)的AIDS疫苗種類和現(xiàn)狀1）基因工程亞單位疫苗是HIV疫苗研究的重點，研究最多的是膜蛋白，是免疫系統(tǒng)很強的免疫原，生產(chǎn)和純化工藝較簡單、安全性好，缺點是不能引起細胞免疫652）病毒樣顆粒研究病毒樣顆粒疫苗（VLP）是以HIV核心蛋白Gag為基礎(chǔ)的復(fù)合疫苗，動物試驗中已觀察到VLP疫苗可誘生很強的CTL及抗體反應(yīng)，缺點是純化和保存較困難663）核酸疫苗HIV核酸疫苗主要以env、gag、pol、基因為目的基因4）合成肽疫苗運用肽合成技術(shù)制備的一種高純度制品，曾經(jīng)是HIV疫苗研究的一個十分活躍的領(lǐng)域675）滅活疫苗主要存在的問題第一，滅活程度很難掌握第二，滅活后的核酸仍完整，有可能整合到人體細胞染色體上第三，需要培養(yǎng)大量病毒，且必須高度純化，花費太高686）減毒活疫苗將HIV在體外或動物體內(nèi)長期傳代，或用人工方法使一些重要基因發(fā)生喪失功能性突變或缺失，使其在保留生長和免疫原性的基礎(chǔ)上失去致病能力，但是安全性要求非常高，尚未進入臨床試驗69第四節(jié)脊髓灰質(zhì)炎疫苗70一.概述脊髓灰質(zhì)炎是由脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）引起的急性傳染病，引起脊髓前角灰白區(qū)尤其是灰質(zhì)區(qū)的神經(jīng)細胞病變71二.發(fā)病機制72三.脊髓灰質(zhì)炎疫苗脊髓灰質(zhì)炎病毒可分為I、II、III3個血清型，型間無交叉免疫目前國內(nèi)外發(fā)病與流行多以I型居多。近年來服疫苗地區(qū)多見II、III型感染

731.滅活疫苗1952~1954年，研制成功注射用脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（IPV），但是不能阻止病毒在腸道的繁殖或作用小，目前大部分國家不再用IPV，而采用減毒活疫苗（OPV）742.減毒活疫苗1）我國現(xiàn)用的疫苗①脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗糖丸：用脊髓灰質(zhì)炎病毒I、II、III型減毒株分別接種人二倍體細胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲制成的糖丸②口服脊髓灰質(zhì)炎病毒活疫苗（猴腎細胞）：用三個型的減毒株分別接種與原代猴腎細胞，經(jīng)培養(yǎng)收獲病毒液制成的疫苗③脊髓灰質(zhì)炎病毒活疫苗糖丸（猴腎細胞）：用三個型的減毒株分別接種與原代猴腎細胞，經(jīng)培養(yǎng)收獲病毒液制成的糖丸752）生產(chǎn)用毒種、細胞和培養(yǎng)方法生產(chǎn)用毒種可用I、II、III型Sabin株，也可用I、II、III型Sabin純化株，中III-2株或其他批準(zhǔn)的毒株生產(chǎn)用細胞為原代猴腎細胞和2BS株人二倍體細胞種毒后靜止或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)40~96h763）質(zhì)控（1）毒種專項檢定：家兔試驗、Rct特征試驗d特征試驗、SV40序列測定（2）病毒原液的專項檢定：MAPREC試驗、猴體神經(jīng)毒力試驗（3）成品疫苗檢定：病毒滴度、熱穩(wěn)定性試驗（4）有效期：2~8℃五個月，-20℃2年77第五節(jié)麻疹疫苗78一.概述●麻疹是由麻疹病毒引起的急性發(fā)疹性呼吸道傳染病?！衽R床上以發(fā)熱、上呼吸道炎癥、頰粘膜出現(xiàn)麻疹粘膜斑（又稱柯氏斑）及全身斑丘疹為主要特征。79二.麻疹病毒的生物學(xué)性狀及理化特性麻疹病毒是單股螺旋RNA病毒，屬副粘液病毒科,麻疹病毒只有一個血清型。接近圓形或卵圓形的顆粒，直徑約為120－250nm。它的特性是耐低溫，對熱和一般消毒劑敏感，在流通空氣或日光下半小時滅活，含有病毒的飛沫在室內(nèi)空氣中保持傳染性一般不超過2小時，但在低溫及干燥條件下有較好的耐受力。80三.麻疹減毒活疫苗1.生產(chǎn)用毒種及細胞毒種：滬191株，長47株或其他批準(zhǔn)減毒株細胞：原代雞胚細胞812.質(zhì)控（1）理化試驗（2）鑒別試驗（3）無菌試驗（4）病毒滴度及熱穩(wěn)定性試驗（5）異常毒性試驗823.劑型及有效期人用劑量0.5ml，含麻疹活病毒不低于3.01gCCID50，有效期：1年6個月4.臨床使用效果8月齡嬰兒一次免疫的抗體陽轉(zhuǎn)率≥95%，80%以上初免者抗體持久性可維持16年以上835.存在問題1）原發(fā)性免疫失敗2）繼發(fā)性免疫失敗3）發(fā)病年齡后移和小年齡發(fā)病4）麻疹接種后的神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)84第六節(jié)流行性腮腺炎疫苗85一.概述簡稱腮腺炎或流腮腮腺炎病毒引起急性自限性呼吸道傳染病主要發(fā)生在兒童和青少年一種系統(tǒng)的、多器官受累的疾病丙類傳染病

86二.腮腺炎病毒的生物學(xué)性狀及理化特性單股RNA病毒含2種抗原：核殼蛋白（NP）具有S抗原。起病1周出現(xiàn)S抗體，無保護性，可用于診斷。血凝素和神經(jīng)氨酸酶糖蛋白（HN）具有V抗原。起病2~3周出現(xiàn)V抗體，具有保護作用。只有一種血清型，很少變異87三.流行性腮腺炎疫苗1.現(xiàn)用疫苗①腮腺炎減毒活疫苗②麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒活疫苗882.質(zhì)量控制1）理化試驗2）鑒別試驗3）無菌試驗4）病毒滴度及熱穩(wěn)定性試驗5）異常毒性893.劑型及有效期人用劑量0.5ml，含麻疹活病毒不低于3.71gCCID50，有效期：1年6個月4.臨床使用和效果8月齡嬰兒一次免疫的抗體陽轉(zhuǎn)率80%～88%，75%以上初免者抗體持久性可維持10年以上90第七節(jié)風(fēng)疹疫苗風(fēng)疹病毒91一.概述風(fēng)疹（rubella,Germanmeasles）又稱“風(fēng)痧”，痧子等。是兒童常見的一種呼吸道傳染病。由于風(fēng)疹的疹子來得快，去得也快，如一陣風(fēng)似的，“風(fēng)疹”也因此得名92二.風(fēng)疹病毒的生物學(xué)性狀及理化特性風(fēng)疹病毒是一種囊膜病毒，直徑約60～70nm，呈粗糙球狀，由一單股RNA基因組及脂質(zhì)外殼組成，內(nèi)含一個電子稠密核心，覆蓋兩層疏松外衣，病毒型別只有一個，病毒不耐熱，在37℃和室溫中風(fēng)疹很快滅活，-20℃可保存9個月，-60℃可保存一年以上93三.風(fēng)疹疫苗我國現(xiàn)用的疫苗有兩種：①風(fēng)疹減毒活疫苗（人二倍體細胞）：用BRDII或經(jīng)批準(zhǔn)的其他經(jīng)二倍體細胞適應(yīng)的減毒株接種人2BS株、MRC-5株或經(jīng)批準(zhǔn)的其他細胞株，經(jīng)培養(yǎng)制成②風(fēng)疹減毒活疫苗（兔腎細胞）：用松葉株接種原代兔腎細胞，經(jīng)培養(yǎng)制成941.國內(nèi)外毒株1）國外①HPV-77株②Cendehill株③RA27/3株④TO-336株2）國內(nèi)①BRD-II株②松葉株952.質(zhì)量控制1）理化試驗2）鑒別試驗3）無菌試驗4）病毒滴度及熱穩(wěn)定性試驗5）異常毒性試驗96第八節(jié)水痘和帶狀皰疹疫苗97一.概述水痘是由水痘帶狀皰疹病毒初次感染引起的急性傳染病。傳染率很高。主要發(fā)生在嬰幼兒，以發(fā)熱及成批出現(xiàn)周身性紅色斑丘疹、皰疹、痂疹為特征。帶狀皰疹屬于成年及老年疾病，其特征為神經(jīng)疼痛及隨神經(jīng)支單側(cè)分布的皮膚發(fā)疹。水痘和帶狀皰疹為臨床表現(xiàn)不同的疾病，卻為同一種病毒引起，因此將此病毒命名為水痘帶狀皰疹病毒。98二.水痘帶狀皰疹病毒的病原學(xué)及理化特性VZV現(xiàn)已命名為人皰疹病毒3型（HHV-3），此病毒呈磚形，有立體對稱的衣殼，內(nèi)含雙鏈DNA分子。VZV對體外環(huán)境的抵抗力較弱，在干燥的痂內(nèi)很快失去活性。99三.水痘疫苗1.現(xiàn)用疫苗1）疫苗毒株①國外：Oka株②國內(nèi)：北京株（84-7）2）生產(chǎn)用細胞及培養(yǎng)方法MRC-5和2BS細胞株靜止或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，病毒不易從胞內(nèi)釋放，需超聲破碎1003）質(zhì)量控制①理化試驗②鑒別試驗③無菌試驗④病毒滴度及熱穩(wěn)定性試驗⑤異常毒性試驗4）劑型及有效期每人份含活病毒不低于2000CCID50，有效期：一年1012.疫苗的應(yīng)用和效果①臨床使用：一歲以上易感兒童接種1劑②接種效果：國內(nèi)免疫后平均抗體陽轉(zhuǎn)率為88.9%，發(fā)熱率約3.7%，皮疹率0.5%1023.現(xiàn)有疫苗存在的問題①保護率不理想②疫苗病毒對高危人群的傳播性③接種疫苗后帶皰的發(fā)生問題1034.疫苗發(fā)展趨勢①分離或改造現(xiàn)有疫苗株，獲得對免疫缺陷人群更安全有效的疫苗②改進疫苗保護劑，開發(fā)耐熱性好，有效期長的疫苗③發(fā)展腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、水痘（NMRV）四聯(lián)疫苗④研究更安全的基因缺失減毒活疫苗或載體表達的基因重組亞單位疫苗104第九節(jié)流行性乙型腦炎疫苗乙腦是一種發(fā)生在夏秋季、由乙腦病毒引起、經(jīng)蚊子叮咬傳播、人畜共患的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病105一.乙腦病毒的結(jié)構(gòu)和理化特性乙腦病毒病原體屬披膜病毒科黃病毒屬第1亞群，呈球形，直徑20～40nm，為單股RNA病毒，外有類脂囊膜，表面有血凝素，能凝集雞紅細胞，病毒在胞漿內(nèi)增殖，對紫外線、溫度、乙醚、酸等都很敏感，能在乳鼠腦組織內(nèi)傳代，亦能在雞胚、猴腎細胞、雞胚細胞和Hela等細胞內(nèi)生長，其抗原性較穩(wěn)定。106二.乙腦病毒的生物學(xué)特性1.感染性和致病性多數(shù)人感染乙腦后不產(chǎn)生臨床癥狀，稱隱性感染，只有少數(shù)人發(fā)病2.抗原性和免疫原性乙腦病毒的抗原性由3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、M、E）和大約7種非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，但在病毒分類和致病機制上起重要作用的是E蛋白。人或動物感染病毒后血中可出現(xiàn)補結(jié)抗體、血抑抗體、和中和抗體。感染乙腦病毒后除產(chǎn)生體液免疫還產(chǎn)生細胞免疫107三.乙腦疫苗1.乙腦減毒活疫苗1）毒株中國藥品生物制品檢定所研制的SA14-14-2株2）生產(chǎn)用細胞及培養(yǎng)方法地鼠腎細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法1083）質(zhì)量控制①理化試驗②鑒別試驗③無菌試驗④疫苗滴度及熱穩(wěn)定性試驗⑤異常毒性試驗⑥安全試驗1094）劑型和有效期每份含活病毒量不少于5.41gPFU，有效期1年6個月5）臨床使用和效果初免一針抗體陽轉(zhuǎn)率可達85%～100%1102.乙腦滅活疫苗1）毒株P(guān)3強毒株2）生產(chǎn)用細胞及培養(yǎng)方法地鼠腎細胞和Vero細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法1113）質(zhì)量控制①理化試驗②鑒別試驗③無菌試驗④效力及熱穩(wěn)定性試驗⑤異常毒性試驗1124）劑型和有效期液體劑型，每人份兒童0.5ml，成人1ml，有效期2年5）臨床使用和效果需加入亞硫酸氫鈉溶液中和甲醛后再進行接種，初次免疫兩針后的抗體陽轉(zhuǎn)率可達70%～85%，加強注射后陽轉(zhuǎn)率可達95%以上113第十節(jié)狂犬病疫苗狂犬病又稱恐水病，是由狂犬病病毒感染所致的急性傳染病。114狂犬病毒形態(tài)（28萬倍）1151.狂犬病毒的生物學(xué)特性動物或人被咬傷后，病毒隨犬唾液經(jīng)傷口進入人體，在局部肌肉細胞中增殖，后通過神經(jīng)肌肉接頭侵入周圍神經(jīng)，以細胞－細胞間傳播方式上行至神經(jīng)節(jié)和CNS。在腦組織中迅速增殖，沿傳出神經(jīng)下行至唾液腺和其他組織116二.狂犬病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)與理化特性完整的狂犬病病毒呈子彈形，長度大約為180納米左右直徑為80納米左右。整個病毒由最外層的脂質(zhì)雙分子層外膜、結(jié)構(gòu)蛋白外殼和負載遺傳信息的RNA分子構(gòu)成。目前普遍認(rèn)為狂犬病病毒有四個不同的血清型?？袢〔《緦Σ焕h(huán)境的抵抗力非常弱，在表面活性劑、消毒劑如甲醛、升汞、碘酒還有酸堿環(huán)境下會很快失去活性，并且對熱和紫外線極其敏感。117狂犬病毒結(jié)構(gòu)示意圖118三.狂犬病疫苗1.現(xiàn)有疫苗類型WHO推薦四種疫苗：①人二倍體細胞疫苗②Vero細胞疫苗③原代地鼠腎細胞疫苗④原代雞胚細胞疫苗119我國目前生產(chǎn)和使用的狂犬疫苗主要有三種：①人用狂犬疫苗（Vero細胞）②凍干人用狂犬病疫苗（Vero細胞）③人用狂犬病疫苗（地鼠腎細胞）1202.質(zhì)量控制1）理化試驗2）鑒別試驗3）無菌試驗4）效力及熱穩(wěn)定性試驗5）異常毒性試驗1213.劑型及有效期人用劑量1ml，含量≥2.5IU，有效期：液體疫苗1年，凍干疫苗1年6個月4.臨床使用和效果接種對象為被狂犬或其他瘋動物咬傷、抓傷者。不分年齡、性別均應(yīng)立即用肥皂水仿佛沖洗后再用碘酊消毒數(shù)次，并及時按暴露后程序注射本疫苗。122暴露后注射程序：被咬傷者應(yīng)分別在第0、3、7、14、28天各肌肉注射狂犬疫苗1針，共注射5針。暴露前注射程序：即對健康者的預(yù)防接種?？砂?、7、21天接種程序注射3針。123第十一節(jié)流行性感冒疫苗流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，病毒傳染性強、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高。124一.流感病毒的生物學(xué)及理化特性

核心：負單股RNA、7~8個節(jié)段（易變異原因）內(nèi)層：核衣殼

核蛋白（NP）

RNA多聚酶

中層：內(nèi)膜蛋白（M蛋白）外層：包膜，雙層脂質(zhì)

其上有刺突：血凝素HA

神經(jīng)氨酸酶NA1251261、內(nèi)部抗原（核蛋白和內(nèi)膜蛋白）

抗原性穩(wěn)定，分甲A、乙B、丙C三型2、表面抗原：HA、NA

分亞型(subtype)依據(jù)

易變異127二.流感疫苗1.現(xiàn)用疫苗①流感全病毒滅活疫苗②裂解型流感病毒滅活疫苗③亞單位流感疫苗我國生產(chǎn)和使用的是主要為流感全病毒滅活疫苗1282.質(zhì)量控制①理化試驗②鑒別試驗③無菌試驗④異常毒性試驗1293.劑型和有效期3歲以下兒童0.25ml，3歲以上0.5ml，有效期暫定為1年4.臨床使用及效果6月齡以上所有希望預(yù)防流感感染的人接種，我國從日本引進生產(chǎn)的裂解疫苗，接種6周后HI抗體陽轉(zhuǎn)率81.1%～94.9%130第十二節(jié)流行性出血熱疫苗流行性出血熱是腎綜合征出血熱的一種，臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、出血、腎臟損害、三大癥狀，病情嚴(yán)重，病死率高。我國主要有兩種血清型野鼠型和家屬型131一.病毒的病原學(xué)及理化特性流行性出血熱病毒布尼亞病毒科，漢坦病毒屬負性單鏈RNA病毒形態(tài)：圓形或卵圓形包括外膜和核心132病毒結(jié)構(gòu)示意圖133對外界抵抗力不強對乙醚、氯仿和去氧膽酸鹽敏感不耐熱、不耐酸對紫外線、酒精和碘酒敏感134二.現(xiàn)用疫苗1.疫苗類型我國生產(chǎn)的出血熱疫苗主要有三種：①Ⅰ型腎綜合征出血熱滅活疫苗②Ⅱ型腎綜合征出血熱滅活疫苗③雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗1352.質(zhì)量控制1）理化試驗2）鑒別試驗3）無菌試驗4）效力及熱穩(wěn)定性試驗5）異常毒性試驗1363.劑型及有效期人用劑量每次1ml，有效期1年6個月4.臨床使用和效果16～60歲高危人群接種，于0、14、28d各注射一針，我國細胞培養(yǎng)疫苗抗體陽轉(zhuǎn)率，Ⅰ型為90.3%~93.3%，Ⅰ型為97.4%~100%137第十三節(jié)其他正在研制的病毒類疫苗138一.輪狀病毒疫苗1.輪狀病毒的生物學(xué)球形，直徑70nm，無包膜，雙層衣殼，二十面體對稱。內(nèi)衣殼的殼微粒沿著病毒體邊緣呈放射狀排列，形同車輪輻條，故稱為輪狀病毒輪狀病毒有兩種形態(tài)，即雙殼顆粒與單殼顆粒：

前者為一種成熟的或完整的病毒顆粒，具有外層多肽衣殼，又稱L毒粒（lightVirion），具有傳染性；后者因在自然條件下失去其外殼，形成粗糙單殼顆粒，又稱D毒粒（densevirion），無傳染性。139人類輪狀病毒屬呼腸病毒科輪狀病毒屬。根據(jù)病毒蛋白VP6抗原分為A～G7個組，每組分為若干血清型。人類輪狀病毒屬A、B、C三組，既可感染人也可感染動物

A組輪狀最為常見，病毒主要引起嬰幼兒腹瀉；

B組主要發(fā)現(xiàn)在中國引起成人輪狀病毒腹瀉，故也稱成人腹瀉輪狀病毒（adultdiarrhearotavirus，ADRV）；C組引起散發(fā)腹瀉，偶有小規(guī)模爆發(fā)流行的報道。

D～G組目前僅在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。1402.輪狀病毒疫苗1）現(xiàn)用疫苗我國蘭州生物制品研究所利用羊RVLLR-85（G10P12）株構(gòu)建的口服疫苗于1998年在中國獲得批準(zhǔn)使用1412）目前正在研究的疫苗①病毒樣顆粒疫苗（VLP）：用重組桿狀病毒傳染的昆蟲細胞，表達不同輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白制成②RV核酸疫苗：將編碼鼠VP4、VP6、和VP7基因的cDNA插入表達質(zhì)粒作為DNA疫苗，對同型RV有一定保護作用142二.呼吸道合胞病毒疫苗1.呼吸道合胞病毒的生物學(xué)特點①形態(tài)結(jié)構(gòu)不分節(jié)段的單股負鏈RNA。包膜上有2種糖蛋白刺突：F蛋白和G蛋白。F蛋白能引起病毒包膜與宿主及培養(yǎng)細胞之間的細胞膜的融合，G蛋白具有對宿主細胞的吸附作用。二者均為保護性免疫應(yīng)答的作用位點，但都無NA和HA的活性，也無溶血素活性。

②培養(yǎng)特性

可在HeLa、Hep-2等多種細胞中緩慢增殖并引起明顯的CPE，形成含有多個胞核的融合細胞，及胞內(nèi)嗜酸性包涵體。猩猩、狒狒、大鼠、小鼠、雪貂等多種對RSV敏感。③抵抗力

弱，不耐酸、熱1432.呼吸道合胞病毒疫苗的研究①使用痘苗病毒和腺病毒研制的表達RSVF，和RSVG的重組活疫苗有一定的免疫保護效果，但其很難在嬰幼兒早期使用，而且在免疫低下的嬰幼兒中安全性難以得到保證，目前研制的高病毒的非復(fù)制型載體可能是研制該疫苗的重要途徑②負鏈RNA病毒cDNA轉(zhuǎn)染技術(shù)的成功給使用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)制備RSV的分子減毒活疫苗帶來了希望144三.人類乳頭瘤病毒疫苗1.人類乳頭瘤病毒的生物學(xué)性狀HPV是一種小的DNA病毒，直徑50～55nm，衣殼呈二十面體立體對稱，含72個殼微粒，沒有囊膜，完整的病毒顆粒在氯化銫中浮密度為1.34g/ml，在密度梯度離心時易與無DNA的空殼（密度1.29g/ml)分開。HPV基因組是一閉環(huán)雙股DNA，約7.8~8.0KB。按功能可分為早期區(qū)（E區(qū)）、晚期區(qū)（L區(qū)）和非編碼區(qū)（NCR）三個區(qū)域。E區(qū)分為E1～E7開放閱讀框架，主要編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和細胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白。L區(qū)分L1和L2，分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。NCR是E區(qū)與L區(qū)間-6.4～1.0bp的DNA片段，可負責(zé)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控。145HPV分型低危型（非癌相關(guān)型）：HPV1、5、6、11、40、42、43等。高危型（癌相關(guān)型）：①疣狀表皮發(fā)育不良（EV）-HPV相關(guān)型：HPV5、8、9、12、14、15、17、19-25等。②生殖道癌前病變/癌-HPV型：HPV16、18、31、33、35-39、45、51-52、56、58、59等。1462.人類乳頭瘤病毒疫苗的研究目前的研制方向主要集中在以L1和L2及E6和E7為靶抗原的各類基因工程疫苗147四.單純皰疹病毒疫苗HSV具有典型的皰疹病毒科病毒的形態(tài)特征

148H