《生物技術(shù)實(shí)踐》復(fù)習(xí)課件

微生物的分離和培養(yǎng)酶的研究與應(yīng)用DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)生物技術(shù)與實(shí)踐1一、微生物的培養(yǎng)與分離㈠微生物的培養(yǎng)與分離培養(yǎng)基的配制微生物的分離——純化大腸桿菌的操作㈡某種微生物數(shù)量的測(cè)定土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)㈢培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用分解纖維素的微生物的分離㈣利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)特定的產(chǎn)物果酒、果醋、腐乳的制作㈤發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量的測(cè)定制作泡菜并檢測(cè)亞硝酸鹽含量2㈠

微生物的培養(yǎng)：1.培養(yǎng)基培養(yǎng)基的種類依據(jù)物理性質(zhì)、化學(xué)成分、用途劃分培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)碳源、氮源、水、無(wú)機(jī)鹽配制培養(yǎng)基的操作：倒平板與平板倒置3制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計(jì)算（配方比例）稱量（各種成分）溶化（瓊脂）調(diào)整pH滅菌倒平板①②③④42.滅菌與消毒方法及對(duì)象滅菌方法：灼燒、干熱、高壓蒸汽、過(guò)濾滅菌法滅菌對(duì)象：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種用具等消毒方法：煮沸消毒、巴氏、酒精、過(guò)氧乙酸、紫外線消毒的對(duì)象：操作臺(tái)、操作空間、操作者的衣著和雙手53.接種純化大腸桿菌的操作—⑴平板劃線法6平板劃線操作7五區(qū)劃線法倒置培養(yǎng)皿8⑵稀釋涂布平板法①系列稀釋操作9②涂布平板操作：104.培養(yǎng)——恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)：放在培養(yǎng)箱中，適宜恒溫、氧氣、二氧化碳的含量5.觀察——菌落：菌落群體結(jié)構(gòu)特征：菌落的形狀、大小、邊緣、光澤度、隆起度、透明度等是菌種鑒定重要依據(jù)11菌落的觀察12二、某種微生物數(shù)量的測(cè)定：——土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)選擇菌種梯度稀釋培養(yǎng)菌液稀釋涂布接種134.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：樣品稀釋度足夠高時(shí)，一個(gè)菌落來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌（不是絕對(duì)的）。實(shí)驗(yàn)至少要涂布三個(gè)平板作為重復(fù)組一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板計(jì)數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)＝平均菌落數(shù)÷稀釋液的體積×稀釋的倍數(shù)14稀釋涂布平板法鑒別培養(yǎng)基—固體選擇培養(yǎng)基—液體三、培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用——分解纖維素微生物的分離15四、利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)特定的產(chǎn)物㈠果酒和果醋的制作果酒果醋實(shí)驗(yàn)原理酵母菌無(wú)氧分解葡萄糖產(chǎn)生酒精醋酸桿菌有氧分解葡萄糖、乙醇產(chǎn)生醋酸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)操作過(guò)程挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→→醋酸發(fā)酵

無(wú)氧↓1-3周

↓有氧10天左右

生成果酒

生成果醋結(jié)果評(píng)價(jià)成分鑒定3mol/LH2SO43滴、飽和重鉻酸鉀溶液3滴，酒精與重鉻酸鉀反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色或通過(guò)嗅味和品嘗觀察菌膜、嗅味、品嘗，檢測(cè)和比較醋酸發(fā)酵前后的pH、顯微鏡觀察。16㈡腐乳的制作17１.實(shí)驗(yàn)原理用豆腐由多種微生物（主要毛霉）參與發(fā)酵制成毛霉等微生物產(chǎn)生的以蛋白酶為主各種酶發(fā)酵的最佳溫度為15～18℃。2.操作條件酒精含量的控制：鹽的濃度控制:水分保持在70%以下183.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作19４.課題成果評(píng)價(jià)是否完成腐乳的制作腐乳質(zhì)量的評(píng)價(jià)影響腐乳質(zhì)量的因素：菌種和雜菌：雜菌污染則直接影響產(chǎn)品的色、香、味。溫度：溫度影響菌絲的生長(zhǎng)和代謝發(fā)酵時(shí)間：發(fā)酵時(shí)間影響生化反應(yīng)度及生化產(chǎn)物的量調(diào)味品：各種酒類、糖類等輔料的多少也對(duì)口感有重要影響20五、泡菜中亞硝酸鹽含量的測(cè)定211.實(shí)驗(yàn)原理：乳酸菌無(wú)氧條件將葡萄糖分解成乳酸。泡菜中微生物將蔬菜中硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在特定的條件下會(huì)轉(zhuǎn)變成致癌物——亞硝胺。用對(duì)氨基苯磺酸重氮法測(cè)量亞硝酸鹽含量（紫紅色）：在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸形成重氮化合物，再與N-1-萘基乙二胺偶合，形成紫紅色染料與標(biāo)準(zhǔn)顯色液比較、定量分析。222.

操作步驟腌制泡菜

↓制備標(biāo)準(zhǔn)顯色液↓制備樣品處理液↓比色→結(jié)果分析計(jì)算2324腌制條件的控制將壇口用水封好，防止外界空氣進(jìn)入壇中要加一些白酒（白酒可抑制泡菜表面雜菌的生長(zhǎng)，是一種調(diào)味劑，可增加醇香感）腌制條件的控制：溫度、食鹽量、腌制時(shí)間溫度過(guò)高、食鹽用量不足10％、腌制時(shí)間過(guò)短，容易造成細(xì)菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。一般在腌制10天后，亞硝酸鹽的含量開(kāi)始下降。25３、亞硝酸鹽含量的測(cè)定制備樣液顯色處理標(biāo)準(zhǔn)比色26泡菜亞硝酸鹽含量（mg/kg）=樣品亞硝酸鹽含量

取樣量（40ml濾液）比色亞硝酸含量單位：1μg=10-3mg取樣量：0.4×1/2×60/500×40/100=9.6×10-3kg泡菜亞硝酸鹽含量的計(jì)算27觀察樣品顏色的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)顯色液比較，找出與標(biāo)準(zhǔn)液最相近的顏色，記錄對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉含量，并計(jì)算。每隔2天測(cè)一次，將結(jié)果記錄下來(lái)。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1號(hào)壇2號(hào)壇3號(hào)壇1月4日0.150.150.151月8日0.600.200.801月12日0.200.100.601月15日0.100.050.201月19日0.100.0502028解釋數(shù)據(jù)：腌制后的前6天內(nèi)，泡菜中的亞硝酸鹽含量就可以達(dá)到最高峰。由于泡菜在開(kāi)始腌制時(shí)，壇內(nèi)環(huán)境有利于某些硝酸鹽還原菌的繁殖，可以促進(jìn)硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。第9天后泡菜中的亞硝酸鹽含量開(kāi)始有明顯下降。隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，泡菜中亞硝酸鹽的含量又有所下降。乳酸細(xì)菌也大量繁殖，對(duì)硝酸鹽還原菌產(chǎn)生一定的抑制作，使其生長(zhǎng)繁殖受到影響。29果酒、果醋、腐乳、泡菜相關(guān)內(nèi)容比較比較果酒果醋腐乳泡菜微生物酵母菌醋酸桿菌毛霉菌乳酸菌生物類型真核原核真核原核呼吸類型兼性厭氧—酒精需氧—醋酸需氧—菌絲層厭氧—乳酸生殖類型出芽生殖分裂生殖孢子生殖分裂生殖原理無(wú)氧分解葡萄糖產(chǎn)生酒精。有氧分解葡萄糖、乙醇產(chǎn)生醋酸。毛霉分解蛋白質(zhì)和脂肪，配料腌制生成腐乳香氣。乳酸菌無(wú)氧分解葡萄糖產(chǎn)生乳酸。果酒、果醋、腐乳、泡菜相關(guān)內(nèi)容比較比較果酒果醋腐乳泡菜微生物生物類型呼吸類型生殖類型原理30微生物的培養(yǎng)與分離主要考查內(nèi)容培養(yǎng)基的類型與配制液體、固體、選擇、鑒別倒平板、平板倒置滅菌與消毒滅菌與消毒的方法與對(duì)象接種方法平板劃線法、稀釋涂布平板法微生物的培養(yǎng)溫度、pH、含氧量、培養(yǎng)箱、天數(shù)觀察結(jié)果菌落形態(tài)、菌落周圍透明圈、抑菌圈等31二、酶的研究與應(yīng)用果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用探討加酶洗衣粉的洗滌效果酵母細(xì)胞的固定化32㈠果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用331.實(shí)驗(yàn)原理：果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分，果膠酶和果膠甲酯酶可水解果膠，與制取果汁有關(guān)果膠酶適宜溫度范圍：10-50℃適宜pH值為3.2-5.0相同重量的蘋(píng)果泥在不同溫度或pH值下和相同時(shí)間內(nèi)比較果汁產(chǎn)量，從而確定果膠酶的最適反應(yīng)溫度或pH值342.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)——操作步驟：設(shè)置不以溫度或pH梯度探究最適溫度或pH值35３.觀察并記錄數(shù)據(jù)

364.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)曲線圖形式表示不同溫度或不同pH下，制作1L果汁與果膠酶用量的關(guān)系，分解果汁的最適溫度和pH。如何判斷果膠是否被全部分解——果膠不溶于酒精（混濁）37㈡探討加酶洗衣粉的洗滌效果38１.原理：利用添加了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等酶類的洗衣粉，將蛋白質(zhì)、油脂、淀粉、纖維素等類污漬水解成水溶性小分子物質(zhì)。2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾骄吭谑裁礈囟认率褂眉用赶匆路鄣南礈煨Ч詈锰骄科胀ㄏ匆路酆图用赶匆路蹖?duì)衣物污漬的洗滌效果探究添加不同種類酶的洗衣粉其洗滌效果有哪些區(qū)別39３.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)40４.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)確定加酶洗衣粉的洗滌效果最好的最適溫度比較普通洗衣粉和加酶洗衣粉洗滌效果分析各種不同品牌的加酶洗衣粉對(duì)油漬、汗?jié)n、血漬的洗滌效果41㈢酵母細(xì)胞的固定化421.實(shí)驗(yàn)原理：酶在催化反應(yīng)中易變性失活，反應(yīng)后不易回收再利用，提高成本，影響產(chǎn)品質(zhì)量。將酶固定在不溶于水的載體上，既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離，可回收反復(fù)利用。酶是由細(xì)胞合成的，直接固定合成酶的細(xì)胞，既操作簡(jiǎn)便，又可降低成本。43２.固定化細(xì)胞技術(shù)固定化酶：是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體的說(shuō)，指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑44固定化細(xì)胞固定化技術(shù)：將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)固定化細(xì)胞：被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞45酶固定的幾種方式示意圖46α－淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)有吸附法將α－淀粉酶的固定在石英砂上。用淀粉指示劑溶液測(cè)試，流出物呈紅色，表明水解產(chǎn)物糊精生成。47三、DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)DNA的粗提取與鑒定多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA段——PCR體外擴(kuò)增DNA技術(shù)血紅蛋白的提取和分離48㈠DNA的

粗提取與鑒定491.實(shí)驗(yàn)原理：NaCl溶液濃度為0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最低——析出DNA；DNA不溶于酒精——提純DNA；DNA遇二苯胺(沸水浴)能被染成藍(lán)色——鑒定DNA50２.

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：制備雞血細(xì)胞液——檸檬酸鈉提取血細(xì)胞的核物質(zhì)——蒸餾水溶解DNA——2mol/LNaCl溶液析出DNA——0.14mol/LNaCl溶液提純DNA——95％冷酒精再溶解DNA——2mol/LNaCl鑒定DNA——二苯胺鑒定513.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)材料的選擇動(dòng)物：雞血（不能選擇哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞）植物：菜花（用植物細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料時(shí)

需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜）提取DNA的基本思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分52DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對(duì)DNA沒(méi)有影響53操作步驟破碎細(xì)胞雞血＋蒸餾水→攪拌→過(guò)濾→收集濾液溶解DNA并去掉濾液中雜質(zhì)2mol/LNaCl溶液＋濾液析出DNA2mol/LNaCl溶液＋蒸餾水→0.14mol/LNaCl→DNA析出再溶解DNA2mol/LnaCl溶液＋析出的DNA析出→濾液54⑦提純DNA：95％冷酒精＋濾液→靜置２～３min→出現(xiàn)白色絲狀物⑧鑒定DNA2mol/LnaCl溶液５mL＋白色絲狀的物＋４mL二苯胺溶液→沸水?。祄in→出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)⑨設(shè)置對(duì)照2mol/LnaCl溶液５mL＋４mL二苯胺溶液→沸水?。祄in→沒(méi)有藍(lán)色反應(yīng)⑩觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組是否變藍(lán)55（PCR體外擴(kuò)增DNA技術(shù)）㈡多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段561.實(shí)驗(yàn)原理：通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍通過(guò)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，加入四種脫氧核苷酸原料、DNA模板、TaqDNA聚合酶(耐高93℃高溫)等，完成特定基因的體外復(fù)制。57脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式58OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’脫氧核苷酸鏈間的連接59dNTP60四種脫氧核苷酸(dNTP)61２.實(shí)驗(yàn)操作第一步第二步第三步62靶序列（目的基因）靶序列（目的基因）PCR

循環(huán)第一步：加熱變性63靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火64靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸65靶序列

靶序列

第1個(gè)

PCR

循環(huán)完成后：得