第八章催化水解反應(yīng)的金屬酶

第八章催化水解反應(yīng)的金屬酶第一節(jié)概述第二節(jié)羧肽酶第三節(jié)碳酸酐酶根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，把酶分為六類：氧化還原酶類催化氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)移酶類催化功能基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)裂解酶類催化從底物移去一個(gè)基團(tuán)而留下雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)異構(gòu)酶類催化異構(gòu)體互相轉(zhuǎn)變合成酶類催化雙分子合成一種新物質(zhì)同時(shí)使ATP分解的反應(yīng)水解酶類催化水解反應(yīng)第一節(jié)概述一、水解酶六大酶類之中研究的最多并應(yīng)用最廣泛的一類，其中有不少水解酶的活性與金屬離子有關(guān)。后頁(yè)表中列出若干水解金屬酶和金屬離子激活酶。金屬離子激活酶是指必須加入金屬離子才具有活性的酶。水解酶根據(jù)水解鍵的類型不同分為六個(gè)亞類。酯酶作用于酯鍵，使其水解為酸和醇糖苷酶作用于糖基化合物，使糖鍵水解醚酶作用于醚鍵，使其水解肽酶作用于肽鍵，使其水解C-N酶作用于其它C-N鍵酸酐酶作用于酸酐本章僅對(duì)肽酶及酯酶作一些介紹

肽酶催化蛋白質(zhì)的肽鍵水解蛋白質(zhì)為高分子物質(zhì)，不能透過(guò)細(xì)胞膜，必須水解成小分子才能被腸吸收。蛋白質(zhì)由各種肽酶催化，水解成小分子，被腸吸收。肽酶肽鏈端解酶肽鏈內(nèi)切酶（蛋白酶）氨肽酶羧肽酶嗜熱菌蛋白酶根據(jù)作用方式，肽酶又分為肽鏈端解酶和肽鏈內(nèi)切酶。肽鏈端解酶從肽鏈羧基末端和氨基末端切下氨基酸，前者稱羧肽酶，后者稱氨肽酶。內(nèi)切酶是另一類肽酶，用于切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵使之變成小分子多肽，如嗜熱菌蛋白酶。

酯酶催化酯鍵水解，其中羧酸酯酶催化羧酸酯水解RCOO—R’+H2O→RCOOH+R’OH磷酸酯酶催化磷酸酯鍵水解

OO‖

‖RO―P―OR’+H2O→RO―P―OH+R’OH

|

|OH

OHR=H時(shí)，磷酸單酯酶（如：堿性磷酸酯酶）磷酸二酯酶（如：磷脂酶C)水解金屬酶之中很多都與Zn2+有關(guān)。其次：Ca2+、Mg2+，還有少數(shù)酶含Mn2+

由于水解過(guò)程不發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，所以金屬離子的氧化態(tài)在催化過(guò)程中不變化。二、水解金屬酶研究中的過(guò)渡金屬離子EPR、M?ssbauer、d-d電子光譜－金屬酶存在某種過(guò)渡金屬。Zn2+,Ca2+,Mg2+等離子不具有未充滿的d軌道，因此含有Zn2+,Ca2+,Mg2+等離子的金屬酶就難以應(yīng)用上述檢測(cè)技術(shù)獲得有用信息。為了深入研究金屬酶的性質(zhì)，通常采用探針。一般采用Co2+代替Zn2+，用Mn2+代替Mg2+。非過(guò)渡金屬Tl+作為K+的NMR探針。使用探針離子遵循的原則：同晶置換，即探針離子在酶分子中占據(jù)原有金屬離子所在的同一位置。電子構(gòu)型、離子半徑、配位幾何構(gòu)型。很關(guān)鍵問(wèn)題：是否能繼續(xù)保持酶分子的生物活性。金屬配位鍵的強(qiáng)弱對(duì)于決定反應(yīng)的途徑也很重要，而這種配位鍵的強(qiáng)度可隨金屬不同而變化。Zn2+的電子結(jié)構(gòu)：d10，在可見(jiàn)區(qū)沒(méi)有吸收。在羧肽酶研究中采用Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Rh3+，Cd2+，Pd2+等離子取代。Co2+取代的羧肽酶A對(duì)肽鍵的水解具有很強(qiáng)的活性。Co2+羧肽酶A的吸收光譜與經(jīng)典的四面體配位的鈷配合物很不同，而且摩爾消光系數(shù)很大，這是由于金屬處在畸變四面體配位引起的；圓二色譜、磁圓二色譜和低溫EPR譜的結(jié)果證實(shí)這一點(diǎn)。證明鋅酶中的Zn2+處于畸變四面體配位狀態(tài)。碳酸酐酶研究中，鈷酶活性是鋅酶活性的50%，而Ni2+，Mn2+，F(xiàn)e2+酶僅稍具活性，其它惰性。Co2+取代酶大都能在不同程度上保持酶的催化活性。電子結(jié)構(gòu)、離子半徑、配位幾何構(gòu)型。Co2+配合物有多種幾何構(gòu)型，高自旋Co(II)配合物優(yōu)先采取四面體結(jié)構(gòu)。四面體場(chǎng)中，高自旋Co2+的電子組態(tài)為e4t23，相當(dāng)于Zn2+的d10組態(tài)的球?qū)ΨQ結(jié)構(gòu)。采用Co2+作為探針，就能提供鋅酶的金屬結(jié)合部位結(jié)構(gòu)的有用信息。第二節(jié)羧肽酶羧肽酶是催化肽鏈的C-末端氨基酸殘基水解的酶。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的鋅酶第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的金屬酶動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)、光譜最清楚的水解酶羧肽酶分類：金屬酶，存在于胰液中，細(xì)胞外酶，幫助蛋白質(zhì)消化，中性或弱堿性顯示極大的活性非金屬酶（酵母羧肽酶C），細(xì)胞內(nèi)酶，在酸性條件下具有很大活性。一、羧肽酶A1.組成、結(jié)構(gòu)與功能（1）組成：存在哺乳動(dòng)物胰臟中，相對(duì)分子質(zhì)量34600，

Zn2+作為輔基，單一多肽鏈，約300個(gè)氨基酸殘基。研究比較多的是牛的羧肽酶A。羧肽酶原A在胰蛋白酶作用下，一個(gè)肽鍵斷裂，釋放出大約60個(gè)氨基酸殘基的N-末端裂解物。在不同條件下，可以產(chǎn)生4種不同羧肽酶A：α307;β305;γ300;δ300動(dòng)物體內(nèi)羧肽酶原A二聚體或三聚體，無(wú)活性胰蛋白酶激活60個(gè)氨基酸殘基-N末端裂解物肽鍵斷裂不同條件下α,β,γ,δ四種不同的羧肽酶307，305，300，300通常說(shuō)的羧肽酶A就是羧肽酶Aα(2)結(jié)構(gòu)：橢球形，羧肽酶A(α)大約一半的氨基酸形成α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)。其余氨基酸無(wú)確定模式，相對(duì)容易變形，與底物結(jié)合相聯(lián)系的構(gòu)象變化主要在這些容易變形的部分發(fā)生。酶分子中部一狹長(zhǎng)的空腔，底物結(jié)合位置。底物的C－末端沿這條溝槽伸入到酶分子內(nèi)的活性部位，空腔中還有一定數(shù)量的水分子，Zn2+就處于這條空腔的內(nèi)表面，它是維持羧肽酶A活性所必須的組分。Zn2+與多肽鏈的兩個(gè)組氨酸（69,196）的咪唑基氮原子，以及谷氨酸（72）的羧基氧原子以配位鍵結(jié)合，Zn2+第４配位為水。Zn2+處于畸變四面體配位狀態(tài)中?！?〕功能：催化蛋白質(zhì)或多肽的羧基末端肽鍵的水解反應(yīng)。除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有各種C-末端氨基酸的肽鏈水解。底物的C-末端側(cè)鏈為芳基或分支較大的脂基羧肽酶顯示出很強(qiáng)的活性。

―NH―CH―CO―NH―CH―COO-+H2O→||R2R1―NH―CH―COOH+NH2―CH―COO-||R2R12.肽水解的催化機(jī)理（1）活性部位早期的蛋白鏈化學(xué)修飾法已經(jīng)確定羧肽酶的活性部位。Zn2+除與組氨酸（His-69)、-196，以及Glu-72形成直接參與催化作用的活性部位外，還包括Arg-145，Tyr-248和Glu-270，它們的側(cè)聯(lián)基團(tuán)也是直接與底物結(jié)合的部位。當(dāng)上述氨基酸與其他物質(zhì)作用而被化學(xué)修飾時(shí)，酶失去活性（2）鋅-羰基機(jī)理主要特征：底物的C-末端肽鍵的羰基通過(guò)鋅的配位作用而極化，極化羰基的碳原子由于親核反應(yīng)發(fā)生水解作用。第一步：Arg-145的胍基和底物的帶負(fù)電荷的C-末端羧基相互吸引。第二步：底物酪氨酸殘基的芳基側(cè)鏈進(jìn)入酶的非極性口袋形空腔中擠走4H2O。第三步:底物敏感肽鍵的-NH-基上的氮原子與酶的Tyr-248的-OH以氫鍵連結(jié)。第四步：底物肽鍵上的羰基擠走了水分子而與鋅配位，鋅使羰基極化以致碳原子容易接受親核進(jìn)攻。第五步：底物末端的羰基碳原子通過(guò)一個(gè)插入的水分子與酶的谷氨酸Glu-270的側(cè)鏈以氫鍵連結(jié)。但最后這一步不一定發(fā)生。羧肽酶與甘氨酰胺結(jié)合的過(guò)程，必須通過(guò)活性中心的重排，特別是酶分子的構(gòu)象的重大改變才能實(shí)現(xiàn)。Arg-145和Glu-270移動(dòng)，Arg的位移帶動(dòng)了肽鏈的扭轉(zhuǎn)，使Tyr-248移動(dòng)了。誘導(dǎo)喫合狀態(tài)：酶分子構(gòu)象改變，配位鍵、范德華力、靜電吸引力和氫鍵等作用力，使酶分子與底物在空間和電荷上都很匹配，因而處于喫合狀態(tài)。羧肽酶與甘氨酰胺結(jié)合正是酶的誘導(dǎo)喫合狀態(tài)的范例。酶分子構(gòu)象改變和各種相互作用力使底物肽鍵處于張力狀體下，因此，反應(yīng)活化能大大降低。酶與底物結(jié)合后進(jìn)一步反應(yīng)的步驟有兩種不同的觀點(diǎn)。第一種：Glu-270激活了水分子，提高了水分子的氧的親核能力，向底物肽健羰基的碳原子進(jìn)攻，Glu-270羰基質(zhì)子化，Tyr-248也提供一個(gè)質(zhì)子，肽鍵斷裂，底物分解。第二種：鋅的作用：在鋅-羰基機(jī)理中起了使肽鍵產(chǎn)生張力的作用，從而促進(jìn)了底物的水解。由于Zn2+的作用，底物肽鍵的羰基碳原子的電子云密度降低而呈正電性，因此羰基碳原子更容易接受親核進(jìn)攻。底物末端羧基與Arg-145帶正電的胍基連結(jié)，觸發(fā)了Tyr-248大幅度位移，酶顯示活性。由此可見(jiàn)：酶與底物的誘導(dǎo)喫合是一個(gè)互相識(shí)別的動(dòng)態(tài)過(guò)程。這個(gè)過(guò)程發(fā)生活性中心重排，使底物有可能被酶的功能基包圍而發(fā)生催化。第三節(jié)：碳酸酐酶廣泛存在動(dòng)物、植物和某些微生物體內(nèi)?？赡娲呋趸嫉乃献饔?，還能催化醛類水合作用和某些脂的水解。碳酸酐酶分含Zn2+酶和不含Zn2+酶。鋅酶，紅細(xì)胞中僅次于血紅蛋白。一、組成、結(jié)構(gòu)、功能相對(duì)分子量約30000，單一肽鏈，每個(gè)分子含一個(gè)Zn2+，260個(gè)氨基酸殘基，脯氨酸含量較高，沒(méi)有二硫鍵。通常碳酸酐酶指碳酸酐酶