第八章雙水相萃取技術(shù)

第八章雙水相萃取技術(shù)第一節(jié)概述1896年，荷蘭微生物學(xué)家Beijerinck發(fā)現(xiàn)聚合物的不相容性:把明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液混合時，得到一種不透明的混合溶液，靜置后分為兩相，上相含有大部分水，下相含有大部分瓊脂（或淀粉），而兩相的主要成分都是水.1955年，瑞典倫德大學(xué)的Albertsson首次利用雙水相技術(shù)從單細(xì)胞藻類中分離淀粉核，從此開創(chuàng)了雙水相分配技術(shù)。1979年德國GBF的Kula和Kroner等[3]人將雙水相體系用于提取酶和蛋白質(zhì)，使胞內(nèi)酶的提取過程大為改善。

一、基本概念及分類雙水相系統(tǒng):某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可形成兩個不相混溶的水相。聚合物-聚合物-水系統(tǒng):聚合物分子的空間阻礙作用使相互間無法滲透。聚合物-無機(jī)鹽-水系統(tǒng):鹽析作用。為什么會形成雙水相？聚合物之間的不相容性:聚合物分子的空間阻礙作用使相互間無法滲透，從而在一定條件下分為兩相。只要兩種聚合物水溶液的水溶性有所差異，混合時就可發(fā)生相分離，并且水溶性差別越大，相分離傾向也就越大。某些聚合物的溶液在與某些無機(jī)鹽等低分子質(zhì)量化合物的溶液相混時，只要濃度達(dá)到一定值，也會產(chǎn)生兩相。其形成機(jī)理是由于鹽析作用。

雙水相系統(tǒng)分類雙聚合物體系：聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)/葡聚糖（dextran，Dx）；聚丙二醇（polypropyleneglycol）/聚乙二醇；甲基纖維素（methylcellulose）/葡聚糖等。聚合物和無機(jī)鹽體系：PEG/磷酸鉀（略作KPi）、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等類型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物/非離子型聚合物聚乙二醇聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、甲基聚丙二醇、羥丙基葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖乙基羥基纖維素葡聚糖甲基纖維素羥丙基葡聚糖、葡聚糖高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物羧甲基葡聚糖鈉鹽聚乙二醇高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉非離子型聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇非離子型聚合物/無機(jī)鹽聚乙二醇磷酸鉀、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、甲酸鈉與一般的水-有機(jī)溶劑體系相比較有什么不同？雙水相體系中兩相的性質(zhì)差別（如密度和折射率等）較小。由于折射率的差別甚小，有時甚至都難于發(fā)現(xiàn)它們的相界面。兩相間的界面張力也很小，僅為10-5~10-4N/m（一般體系為10-3~2×10-2N/m）。三、雙水相萃取技術(shù)的基本特點兩相的性質(zhì)差別（如密度和折射率等）較小兩相間的界面張力也很?。ㄒ唬l件溫和，體系具有生物親和性（二）所需溶液少，操作方便（三）分離迅速，步驟簡便（四）操作易于控制（五）可簡化分離步驟（六）能進(jìn)行萃取性的生物轉(zhuǎn)化（七）親和萃?。ㄓH和分配）可大大提高分配系數(shù)和萃取專一性（八）易于工藝的連續(xù)化生產(chǎn)第二節(jié)雙水相分配原理及其理論基礎(chǔ)一、雙水相系統(tǒng)分配原理是否會形成雙水相，取決于混合熵增和分子間作用力兩個因素?；旌鲜亲园l(fā)的熵增過程，而分子間相互作用力則隨分子量的變大而增強(qiáng)。當(dāng)兩種高分子聚合物之間互不相溶時，由于相對分子質(zhì)量較大，分子間的相互排斥作用與混合過程的熵增加相比占主導(dǎo)地位，一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平衡時，即形成富含兩種不同聚合物的兩相。

上、下相的組成取決于兩種聚合物（如PEG/Dx）的加入量以及其分子質(zhì)量的大小。當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環(huán)境的影響，使其在上、下相中的濃度不同。分配系數(shù)

K不同而分離相圖雙水相形成條件和定量關(guān)系可用相圖表示。雙結(jié)點線：把均相區(qū)和兩相區(qū)域分隔開。

系線：連接雙結(jié)點線上兩點的直線。臨界點：當(dāng)系線長度趨向于零時，即在圖中的K點，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，成為單相體系。KPi質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%均相區(qū)兩相區(qū)系線在同一條系線上的各點分成的兩相具有相同的組成，但體積比不同。當(dāng)上下兩相間密度差小時，兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則。按表格重復(fù)操作…PEG4000.700gH2O0.5ml(NH4)2SO4混和H2渾濁記錄(NH4)2SO4ml數(shù)混均繪制相圖實驗操作澄清旋渦器繪制相圖PEG400%(NH4)2SO4%二、雙水相中的分配平衡溶質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)也用K=cT/cB表示。分配系數(shù)是各種相互作用的和.lnKP=lnKE+lnKS+lnKA

總分配系數(shù)KP:lnKE、lnKS、lnKA分別為靜電作用、疏水作用、親和作用對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻(xiàn)。

在系線上各點處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相，在同一條系線上的不同點，物質(zhì)的分配系數(shù)相同。（一）靜電作用lnK=lnKo+ΔφFZ/RTKo為溶質(zhì)靜電荷為零時的分配系數(shù)；F為法拉第常數(shù)；Z為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)；Δφ為相間電位差。

荷電解質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比.分配系數(shù)與靜電荷數(shù)的關(guān)系因無機(jī)鹽而異,同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的相間電位不同

帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在雙水相種的分配系數(shù)K:

K+<Na+<NH4+<Li+<(C4H9)4N+

ClO4-<SCN-<I-<Br-<Cl-<CH3CO2-<F-<H2PO4-<HPO42-

（二）疏水作用一般情況下，蛋白質(zhì)的表面均存在疏水區(qū)，疏水區(qū)所占比表面越大，其疏水性越強(qiáng)。不同組分由于其表面疏水性的差異使得其各自在上下相中產(chǎn)生相應(yīng)的分配平衡。lnKs＝HF(RH+B)HF為相間的疏水性差，也稱疏水性因子；RH為氨基酸的相對疏水性；B為比例常數(shù)。lnKo=HF×HFSHFS蛋白質(zhì)的表面疏水性.（pH=pI時）lnK0＝HF(HFS+△HFS)△HFS為鹽濃度增加引起的HFS值增量。lnK＝HF(HFS+△HFS)+ΔφFZ/RT（三）界面張力作用非電解質(zhì)型溶質(zhì)在液體中的界面張力的存在使它呈不均勻分布，并聚集在雙水相體系中具有較低能量的一相中。

非電解質(zhì)型溶質(zhì)的分配系數(shù)與相間表面自由能差及溶質(zhì)的分子量有關(guān)lnKP=-ΔE/kT＝-MΔ/RT溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與其分子量呈線性關(guān)系同一溶質(zhì)的分配系數(shù)隨雙水相系統(tǒng)的不同而改變（四）親和作用通過一定的方法，將配基連接在雙水相的成相物質(zhì)分子上，就構(gòu)成了具有親和性質(zhì)的雙水相體系，形成對被分配物質(zhì)的親和作用，調(diào)節(jié)待提取物在兩相中的分配，從而提高其分離效果過渡金屬離子:Cu2＋、Ni2＋、Fe2＋、Zn2＋、Co2＋等是常用的親和配基

作用機(jī)理:配位鍵力、π-鍵及靜電作用力四、影響物質(zhì)分配平衡的因素除了靜電作用、疏水作用及界面張力等各種相互作用因素外，影響物質(zhì)在雙水相系統(tǒng)中分配的因素主要還有:雙水相系統(tǒng)的聚合物組成(包括聚合物類型、平均分子量)鹽類(包括離子的類型和濃度、離子強(qiáng)度、pH值)溶質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)(包括分子量、等電點)體系的溫度等。（一）雙水相中聚合物組成當(dāng)兩種不同濃度的聚合物與聚合物或者聚合物與無機(jī)鹽以不同的濃度混合時，可能存在三種情況：a、完全混溶性(勻相溶液)；b、物理的不相溶性(相分離)；c、復(fù)雜的凝聚(相分離，聚合物聚集在同一相中，純?nèi)軇?水聚集在另一相中)當(dāng)這兩種聚合物是離子化合物并帶有相反電荷時，它們互相吸引并發(fā)生復(fù)雜的凝聚。

不同聚合物的水相系統(tǒng)顯示出不同的疏水性

水溶液中聚合物的疏水性按下列次序遞增：葡萄糖硫酸鹽<甲基葡萄糖<葡萄糖<羥丙級葡萄糖<甲基纖維素<聚乙烯醇<聚乙二醇<聚丙三醇。（二）成相聚合物分子量同一聚合物的疏水性隨分子量的增大而增大。對于PEG/Dextran所形成的雙水相體系中，若降低PEG相對分子質(zhì)量，則生物分子分配于富含PEG的上相中，使分配系數(shù)增大；而降低Dextran相對分子質(zhì)量，則分配系數(shù)減小。（質(zhì)量濃度不變時，親水基團(tuán)增多，pro親水性）對于同種聚合物而言，其疏水性隨相對分子質(zhì)量增加而增加若想在上相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，對于PEG聚合物，應(yīng)(??)它的平均相對分子質(zhì)量。（三）成相聚合物的濃度聚合物分相的最低濃度為臨界點，系線的長度為零,此時分配系數(shù)為1，即組分均勻的分配于上下相.隨著成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合物的總濃度增大，系線的長度增加，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點，成相聚合物兩相性質(zhì)的差別也增大，組分在兩相中的分配系數(shù)改變。成相物質(zhì)的總濃度越高，系線越長，生物分子越容易分配于其中的某一相.其它因素1.分配物質(zhì)的分子量2.鹽的種類和濃度值影響4.溫度的影響5.通氣和攪拌的影響M×10-4第三節(jié)雙水相萃取操作及設(shè)備一、雙水相系統(tǒng)的選擇:易于兩相的分離.

根據(jù)待分離蛋白質(zhì)和共存雜質(zhì)的表面疏水性、分子量、等電點和表面電荷等性質(zhì)上的差別，來選擇雙水相系統(tǒng)，并確定成相聚合物的分子量及濃度、鹽的濃度、pH值等因素以確定最佳的萃取系統(tǒng)。

對于目標(biāo)蛋白與雜蛋白的表面疏水性相差較大的體系，可利用鹽析等作用原理，通過提高成相系統(tǒng)的濃度，增大雙水相系統(tǒng)的疏水性，達(dá)到目標(biāo)蛋白與雜蛋白的分離。對于目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白的等電點不同的體系，添加適當(dāng)?shù)柠}，并通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)的pH值使相間電位差變大，而達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)物與雜蛋白的分離。PEG/Dx系統(tǒng)高聚物/鹽體系新的雙水相體系:表面活性劑-表面活性劑-水體系、雙水相膠束體系等體系

二、雙水相萃取工藝設(shè)計目標(biāo)物應(yīng)滿足以下條件：與原料液中的雜質(zhì)應(yīng)分配在不同的相中在雙水相體系中的某一相中的分配系數(shù)應(yīng)相對較大雙水相系統(tǒng)的上下相應(yīng)易于分離。工藝流程目的產(chǎn)物的萃取PEG的循環(huán)無機(jī)鹽的循環(huán)。（一）目的產(chǎn)物的萃取1.如果目標(biāo)產(chǎn)物在上相中的分配系數(shù)足夠大，則細(xì)胞勻漿液中的目標(biāo)產(chǎn)物可采用一步或兩步雙水相萃取工藝獲得較高的純化倍數(shù)。一步雙水相萃取是把生物材料懸浮液和雙水相系統(tǒng)混合后，分離上下相，其中下相含有大多數(shù)雜質(zhì)，而上相再通過超濾操作進(jìn)行進(jìn)一步的提純目標(biāo)產(chǎn)物，同時高聚物一相可以得到回收。在兩步萃取操作中，把一步萃取體系中的上相分離出來后，再加入鹽使其形成新的雙水相體系，則富含PEG的上相得到回收，同時，含有目標(biāo)產(chǎn)物的鹽相通過超濾等操作得到分離目標(biāo)，而且可以通過濃縮可以進(jìn)行回收再利用。PEG/鹽雙水相體系一步或兩步萃取流程示意圖2.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的萃取雙水相萃取法可選擇性地使細(xì)胞碎片分配于雙水相系統(tǒng)的下相，而目標(biāo)產(chǎn)物分配于上相，同時實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的部分純化和細(xì)胞碎片的除去，從而節(jié)省利用離心法或膜分離法除碎片的操作過程。如果細(xì)胞勻漿液中的目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)較小，則可采用多步雙水相萃取工藝以獲得較高的純化倍數(shù)。三步雙水相萃取酶的流程示意圖（二）PEG循環(huán)在大規(guī)模雙水相萃取過程中，成相材料的回收和循環(huán)使用，不僅可以減少廢水處理的費用，還可以節(jié)約化學(xué)試劑，降低成本。PEG的回收有兩種方法：①加入鹽使目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入富鹽相來回收PEG；②將PEG相通過離子交換樹脂，用洗脫劑先洗去PEG，再洗出蛋白質(zhì)。（三）無機(jī)鹽的循環(huán)一種方法使將含磷酸鈉的鹽相冷卻到6℃，使鹽結(jié)晶析出，然后用離心機(jī)分離收集；另一種方法是用電滲析法、膜分離法回收鹽類或除去PEG相的鹽。三、大規(guī)模雙水相萃取及其簡單設(shè)備兩步萃取法連續(xù)分離胞內(nèi)