第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

在消費(fèi)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主才能的微生物菌種的保存和長(zhǎng)期保藏，對(duì)于一成功的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程極為重要。第一頁(yè)，共52頁(yè)。一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)

經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在；(2)

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物消費(fèi)的高產(chǎn)才能。(3)菌種保藏的根本措施是低溫、枯燥、真空。第二頁(yè)，共52頁(yè)。一、微生物菌種保藏在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂根本要求：根本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍枯燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空枯燥第三頁(yè)，共52頁(yè)。由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對(duì)不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，因此，在詳細(xì)選擇保藏方法時(shí)必須對(duì)被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)展綜合考慮。對(duì)于一些比較重要的微生物菌株，那么要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)展保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。第四頁(yè)，共52頁(yè)。國(guó)際重要菌種保藏機(jī)構(gòu)第五頁(yè)，共52頁(yè)。中國(guó)菌種保藏單位第六頁(yè)，共52頁(yè)。第七頁(yè)，共52頁(yè)。二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(2)冷凍枯燥或真空枯燥保藏；(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。第八頁(yè)，共52頁(yè)。菌種保藏方法暫時(shí)保藏法

斜面?zhèn)鞔ù┐谭ㄩL(zhǎng)期保藏法液體石蠟法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法濾紙片保藏法冷凍枯燥保藏法液氮冷凍法第九頁(yè)，共52頁(yè)。

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡(jiǎn)單而有效的方法。通過(guò)冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停頓。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中參加一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20℃以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。第十頁(yè)，共52頁(yè)。冷凍保藏種類(lèi)

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)

第十一頁(yè)，共52頁(yè)。普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持假設(shè)干微生物的活力1—2年。第十二頁(yè)，共52頁(yè)。應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。保藏過(guò)程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。第十三頁(yè)，共52頁(yè)。二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)展保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞；2．用新穎培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；3．參加等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。第十四頁(yè)，共52頁(yè)。假如待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，那么可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。假設(shè)干細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏5年而活力不受影響。第十五頁(yè)，共52頁(yè)。三、液氮冷凍保藏技術(shù)

(一)冷凍保護(hù)劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過(guò)濾滅菌。

第十六頁(yè)，共52頁(yè)。(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟1．待冷凍保藏菌種懸液的制備(1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面參加5ml含10％甘油的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶。

第十七頁(yè)，共52頁(yè)。(2)從浸沒(méi)培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒(méi)培養(yǎng)液中參加等體積20%無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，假如菌體絮凝較緊，那么需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間到達(dá)平衡。第十八頁(yè)，共52頁(yè)。2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度到達(dá)相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；第十九頁(yè)，共52頁(yè)。(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。假如無(wú)控速冷凍機(jī)，那么一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。第二十頁(yè)，共52頁(yè)。(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無(wú)菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。第二十一頁(yè)，共52頁(yè)。

凍干保藏

冷凍枯燥的根本方法：是通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物枯燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一。冷凍枯燥過(guò)程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)展冷凍保藏，便于運(yùn)輸。第二十二頁(yè)，共52頁(yè)。培養(yǎng)物的凍干過(guò)程第二十三頁(yè)，共52頁(yè)。冷凍真空枯燥操作流程安培瓶配制保護(hù)劑滅菌菌種培養(yǎng)制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標(biāo)簽加棉塞預(yù)凍真空干燥測(cè)定水分熔封管口檢查真空度包藏第二十四頁(yè)，共52頁(yè)。(三)凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍枯燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對(duì)于培養(yǎng)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無(wú)菌紗布或無(wú)菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開(kāi)安瓿。第二十五頁(yè)，共52頁(yè)。(3)在安瓿中參加0.5～1ml營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，漸漸旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。第二十六頁(yè)，共52頁(yè)。將菌種定期在新穎瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長(zhǎng)溫度下生長(zhǎng)和保存的傳代保藏方法?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室中假設(shè)干菌種的保藏。此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基枯槁、菌體自溶、基因突變。第二十七頁(yè)，共52頁(yè)。2.3傳代培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)原理：保藏的菌種通過(guò)斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基〔用于厭氧細(xì)菌〕培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進(jìn)展傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無(wú)菌液體石蠟來(lái)進(jìn)一步延長(zhǎng)保存期。操作方法1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好〔棉塞換成膠塞效果更好〕，置4C?冰箱中包藏。保藏時(shí)間依微生物的種類(lèi)而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。第二十八頁(yè)，共52頁(yè)。2、液體石蠟保藏法將無(wú)菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放。第二十九頁(yè)，共52頁(yè)。礦物油中浸沒(méi)保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡(jiǎn)便有效?？捎糜诮z狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍枯燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。第三十頁(yè)，共52頁(yè)。浸沒(méi)保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)。因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長(zhǎng)還十清楚顯，有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟，也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測(cè)，一般保藏株2～3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。第三十一頁(yè)，共52頁(yè)。2.4載體法

實(shí)驗(yàn)原理：使生長(zhǎng)適宜的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)展枯燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。第三十二頁(yè)，共52頁(yè)。操作方法〔砂土管保藏法〕〔1〕河砂處理取河砂假設(shè)干參加鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來(lái)水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過(guò)篩，棄去粗顆粒，備用?！玻病惩寥捞幚砣》歉鲗硬缓迟|(zhì)的痩黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過(guò)篩，粗顆粒部分丟掉。(3)砂土混合處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)展滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。第三十三頁(yè)，共52頁(yè)。

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易喪失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長(zhǎng)非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞喪失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。第三十四頁(yè)，共52頁(yè)。當(dāng)培養(yǎng)基中參加抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)展發(fā)酵時(shí)，抗生素的參加可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第三十五頁(yè)，共52頁(yè)。不同菌種保藏方法比較第三十六頁(yè)，共52頁(yè)。細(xì)菌的保藏第三十七頁(yè)，共52頁(yè)。放線菌菌種的保藏保藏方法主要有：

沙土管法、冷凍枯燥法、液氮冷凍法放線菌菌種的長(zhǎng)期保藏依保藏放線菌的分生孢子為主要方式。第三十八頁(yè)，共52頁(yè)。2.5微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定

所有保藏菌種的方法都必須是長(zhǎng)期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時(shí)定期檢測(cè)菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)際保藏過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。第三十九頁(yè)，共52頁(yè)。對(duì)工業(yè)微生物消費(fèi)菌種來(lái)說(shuō)，建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))應(yīng)在保藏后加以檢測(cè)和確定。第四十頁(yè)，共52頁(yè)。加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測(cè)保藏過(guò)程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過(guò)對(duì)高溫下短期活力喪失程度檢測(cè)，可以用來(lái)預(yù)測(cè)嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率(或存活單位)。細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性，以及實(shí)驗(yàn)室中、中試車(chē)間中和消費(fèi)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。第四十一頁(yè)，共52頁(yè)。第十節(jié)菌種的衰退與復(fù)壯

在生物進(jìn)化的歷史長(zhǎng)河中，遺傳性的變異是絕對(duì)的，而它的穩(wěn)定性反而是相對(duì)的；退化性的變異是大量的，而進(jìn)化性的變異卻是個(gè)別的。在自然情況下，個(gè)別的適應(yīng)性變異通過(guò)自然選擇就可保存和開(kāi)展，最后成為進(jìn)化的方向；在人為條件下，人們也可以通過(guò)人工選擇法去有意識(shí)地挑選出個(gè)別的正變體用于消費(fèi)理論中。相反，如不自覺(jué)、認(rèn)真地去進(jìn)展人工選擇，大量的自發(fā)突變菌株就會(huì)趁機(jī)泛濫，最后導(dǎo)致菌種的衰退〔degeneration〕。第四十二頁(yè)，共52頁(yè)。在長(zhǎng)期接觸菌種的實(shí)際工作人員中，都有這樣的體會(huì)，即假如對(duì)菌種工作長(zhǎng)期放任自流，不搞純化、復(fù)壯〔rejuve-nation〕和育種，那么菌種就會(huì)對(duì)你進(jìn)展“懲罰〞，反映到消費(fèi)上就會(huì)出現(xiàn)持續(xù)的低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這說(shuō)明菌種的消費(fèi)性狀也是不進(jìn)那么退的。第四十三頁(yè)，共52頁(yè)。菌種衰退的表現(xiàn)對(duì)產(chǎn)量性狀來(lái)說(shuō)，菌種的負(fù)變就是衰退。其他原有的典型性狀變得不典型時(shí)，也是衰退。最易覺(jué)察到的是菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變。生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少。代謝產(chǎn)物消費(fèi)才能或其對(duì)宿主寄生才能的下降。衰退還表如今抗不良環(huán)境條件〔抗噬菌體、抗低溫等〕才能的減弱等。第四十四頁(yè)，共52頁(yè)。菌種衰退的本質(zhì)菌種的衰退是發(fā)生在細(xì)胞群體中的一個(gè)由量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。開(kāi)場(chǎng)時(shí)，在一個(gè)大群體中僅個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)變，這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取有效措施，而一味移種傳代，那么群體中這種負(fù)變個(gè)體的比例逐步增大，最后讓它們占了優(yōu)勢(shì)，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的衰退。所以，在開(kāi)場(chǎng)時(shí)所謂“純〞的菌株，實(shí)際上其中已包含著一定程度的不純因素；同樣，到了后來(lái)，整個(gè)菌種雖已“衰退〞了，但也是不純的，即其中還有少數(shù)尚未衰退的個(gè)體存在著。第四十五頁(yè)，共52頁(yè)。復(fù)壯的概念狹義的復(fù)壯僅是一種消極的措施，它指的是在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種別離和測(cè)定消費(fèi)性能等方法，從衰退的群體中找出少數(shù)尚未衰退的個(gè)體，以到達(dá)恢復(fù)該菌原有典型性狀的一種措施；而廣義的復(fù)壯那么應(yīng)是一項(xiàng)積極的措施，即在菌種的消費(fèi)性