結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測方法建立與應(yīng)用目建立結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR探討熒光PCR檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌應(yīng),并構(gòu)建標準品。對102例45,PCR法、痰涂片抗酸染色法檢測結(jié)核分枝桿菌。結(jié)果熒光定量PCR100%、30%。結(jié)論熒光定量PCR是一個快速、敏感性高、特異性強結(jié)核分枝桿菌含相關(guān)鍵應(yīng)用價值?！娟P(guān)鍵詞】結(jié)核;分枝桿菌;抗酸染色;熒光定量PCREstablishment and application of fluorescence quantitative PCR for detection Mycobacteriumtuberculosis.ZHUYu-lan,WANGDian-peng,GAOZhao-xian,etal.InternationalTravel AgencyHealthCareCenter, ShenzhenEntryandExitInspectionQuarantineBureau,Shenzhen518033,Guangdong,P.R.ChinaAbstract:Objective ToconstituteamethodfordetectionofMycobacteriumtuberculosisbyfluorescencequantitativePCRandevaluatetheapplicationvalueoffluorescencequantitativePCRindetectionofMycobacteriumtuberculosisinsputum. Methods Theprimersandprobeweredesignedandconstitute astandards.The suptumsamplesfrom102tuberculosispatientsand45non-tuberculosispatientsweredetectedbyfluorescencequantitativePCRandacid-faststain.Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, stain,were100%and30%respectively. Conclusion FluorescencequantitativePCRisamethodfordiagnosisoftuberculosis,whichshowsahighspecificityandsensitivity.Itisausefultoolfordiagnosisoftuberculosisinthefuture.Key words: Tuberculosis;Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; FluorescencequantitativePCR,自1985年以來結(jié)核病疫情在全球范圍內(nèi)急,,1/3,20億人口感染了結(jié),2000萬,800～1000萬,每年約有300萬人死于結(jié)核病1～中國是全球22,活動性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。據(jù)結(jié)核病流行病學,現(xiàn)有活動性肺結(jié)核病人450萬,其中傳染性肺結(jié)核病人150萬4。結(jié)核病,出入境人員體檢診療傳染性肺結(jié)核關(guān)鍵方法是經(jīng)過胸部X,加上痰涂片抗酸染色鏡檢和PPD試驗聯(lián)合檢測。因為胸部X片是依據(jù)臨,,加上肺結(jié)核與其她肺部疾病在胸片上有相同地方,輕易出現(xiàn)誤診和漏診;痰涂片抗酸染色陽性率低,采樣不合格標本陽性率更低,極易出現(xiàn)漏診;而PPD,,這三種檢測方法組合模式在檢測肺結(jié),,而少數(shù)肺部疾病或其她部位結(jié)核病人可,,特異性高特點成為結(jié)核分枝桿菌檢測研究熱點。中國外大量研究證實PCR檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性達成100％,本研究以熒光PCR,,結(jié)果匯報以下。材料與方法材料確診肺結(jié)核病人培養(yǎng)涂陽結(jié)核痰液標本102份。正常人痰液25份,葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯球菌痰液標本累計20份。引物與探針依據(jù)對NCBI數(shù)據(jù)庫結(jié)核桿菌基因序列分析,找出其保守序列,而且在此區(qū)域應(yīng)用Primer5.0和Primerexpress3.0,5’端標以熒光發(fā)射基團FAM標識,靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA標識表1)ForwardPrimer:5’ReversePrimer:Probe:CACGTAGGCGAACCCTGCCCA儀器ABI企業(yè)ABI7500熒光Real－timePCR儀。痰液DNA提取痰液樣品預(yù)處理吸收待測痰液200μl1.5mleppendo,5mol/LNaOH混勻,室溫中1mol/LNaH2PO4700μl,(),10000rmp5min。去上清液,補加TE100μl,混勻,20μl50mg/ml3730min。DNA提取,300μl,20秒,置65。加200μl,5～616000rmp3min500μl),,,混勻后16000rmp離心3min,200μl70,,,16000rmp3min70,,,30μlDNA,快速漩渦1～2秒,使沉淀DNA完全溶解。標準品制備標準品包含:陽性定量參考品、陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強陽性質(zhì)控品。以結(jié)核桿菌陽性DNA2μl做為PCR,加入PCR23μl,PCR反應(yīng)液中含有10xPCRBuffer3μl、25mmol/LMgCl2、10mmol/LdNTPs、4U/μlTaqDNA0.5μl10pmol/L1μl,13.3μl。于PT-200PCR擴增:944min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,30個循環(huán);最終7210min。PCR1.5,凝膠回收試劑盒回收PCR,與線pMD18-T載體（Invitrogen企業(yè)12～16h,連接反應(yīng)體系中含有PCR凝5μlpMD18-T1μlT41μl,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ,轉(zhuǎn)化后細胞涂布于含有氨芐青霉素抗性1.5％瓊脂固體LB培養(yǎng)基上,3712～16h,,50mg/ml氨芐青霉5mlLB,200rpm37;1.6ml,,經(jīng)PCR,,,抽提質(zhì)粒DNA,用(4次,4管,),10倍系列稀釋,108、107、106、105copies／ml4個標準品,陰性質(zhì)控品以生理鹽水制備,強陽性質(zhì)控品和臨界陽性質(zhì)控品依據(jù)濃度和拷貝數(shù)以標準品經(jīng)滅菌水稀釋后制得。Taq-man探針實時PCR及反應(yīng)條件20μl,2×Probe－PCRMasterMix上、下游引物(10μmol/μl)0.5μl,探針(10μmol/μl)0.2μl,6.8μl,結(jié)核桿菌陽性DNA樣2μl:95℃15min(×1),94℃10s→60℃20s→72℃30s(×40)。根據(jù)上述反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,伴隨PCR,就得到了以循環(huán)數(shù),Ct曲線。,測序PCR2,,1hABI3130基因分析儀序列分析。特異性試驗25份和金黃色葡萄球菌DNADNADNA20Taq-manPCR檢測。檢測限試驗對陽性樣本以10倍梯度進行稀釋,共5個稀釋度,最大稀釋倍數(shù)為10萬倍,然后以各稀釋液為模板進行實時PCR檢測。反復(fù)性試驗107410倍倍比稀釋陽性DNA五次分別統(tǒng)計其Ct值。靈敏度試驗對102例痰液標本分別進行抗酸染色顯微鏡檢測和實時PCR檢測。結(jié)果定量曲線各個稀釋度標準陽性株在第一個循環(huán)結(jié)束后測到一個基礎(chǔ)吸光值,接下來一直到第20個循環(huán)結(jié)束時都沒有顯著改變。從第23,,25(Ct值)后,,36,,一直到反應(yīng)結(jié)束。陰性對照未出現(xiàn)擴增曲線（圖。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果痰液DNA進行驗證試驗,對所獲取PCR產(chǎn)物進行測序,序列分析顯示該產(chǎn)物為TB核酸序列。特異性試驗DNATaq-manPCR檢測到無熒光信號。檢測限試驗10,Taq-manPCR檢測,熒光信號隨樣本濃度下降而下降,線性范圍為103～107copies/ml,檢測下限為102copies/ml。反復(fù)性試驗反復(fù)測定4組10倍倍比稀釋后標準品,濃度由高到低Ct平均值分別是21.07、24.6、28.16、31.57,標準差分別是0.69、0.88、0.39、1.82,變異系數(shù)分別是3.9%、4.3%、1.6%、6.9%,伴隨標準品拷貝數(shù)降低,Ct值增大,標準差和變異系數(shù)也呈逐步增大趨勢。2.6 靈敏度試驗對確診肺結(jié)核病人102例痰液標本分別進行直接涂片染色法和實時PCR30％。熒光PCR100％。討論肺結(jié)核試驗室快速診療對出入境人員傳染性肺結(jié)核發(fā)覺相關(guān)鍵意義,現(xiàn)在,肺結(jié)核試驗室診療方法關(guān)鍵有細菌學檢驗、免疫學檢驗和分子生物學檢驗。細菌學檢驗是現(xiàn)在傳染性肺結(jié)核診療金標準,檢測出來陽性對肺結(jié)核診療意義最大,關(guān),痰涂片抗酸染直接鏡檢法陽,陽性率只有14～47%,,陽性率相差很大1。提升痰標,加強痰涂片鏡檢質(zhì)量控制是現(xiàn)在中國外研究關(guān)鍵片法,且能得到活菌,但因為結(jié)核分枝桿菌生長速度太慢,檢測時間長,傳統(tǒng)方法培養(yǎng)需要5～8BACTEC,使培養(yǎng)分枝桿菌能,9～14d。分枝桿菌生長指示管使用熒光計量技術(shù)檢測,,陽性率高［15,16］,,是快速培養(yǎng)主流。試驗室檢測結(jié)核分枝桿菌是臨床結(jié)核病診療關(guān)鍵依據(jù)傳統(tǒng)檢測結(jié)核分枝桿菌關(guān)鍵方法為直接涂片法和培養(yǎng)法［20］,但直接涂片法存在特異性差、靈敏度低和不能判別抗酸菌死活缺點,而培養(yǎng)法則存在特異性差和需時較長不足［5］,實際臨床應(yīng)用受限。本試驗中102例標本實時PCR陽性102例(102%),而直接涂片法只有30例(30%)。實時PCR法與抗酸染色法比較符合率為實時PCR法操作簡便、快速、高,含有很高敏感性、特異性,且其在密閉體系中完成擴增并進行實時測定,降低了污染可能性,并可正確地進行定量檢,為傳染病監(jiān)測提供參考實時PCR技術(shù)尤其對部分含菌量低標(如尿液、胸腹)檢測含有非常實用價,大大提升了結(jié)核分枝桿菌檢出率。實時PCR檢測原理為TaqMan探針,是在反應(yīng)體系中加入一個熒光標識探,探針5′端標以熒光發(fā)射基團FAM, 3′端標以熒光猝滅基團。實時PCR過程,利用Taq酶5′→3′外切核酸酶活性釋放熒光信號模板每復(fù)制一,便釋放一個熒光信,依據(jù)熒光強弱可對模板進行正確定量因為實時PCR采取閉管操,克服了常規(guī)PCR污染問,使其含有很高特異性。實時PCR技術(shù)盡管有少數(shù)假陽性結(jié),但其與常規(guī)細菌學方法互補使用可提升陽性檢出,仍不失為靈敏度高、特異性強結(jié)核病輔助診療有效方法之一。本研究結(jié)果顯示, 痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率(30%)較低,是可能因為抗酸染色受痰中細菌數(shù)量限制,通常最少每毫升痰液含(5×103)～(1×104)個細菌方可得出陽性結(jié),且結(jié)核病人是間斷性排,可能造成假陰性。這就要求我們在抗酸染色時要嚴格控制條件,挑取標本中干酪樣或膿性部分,以提升陽性率。而實時PCR檢測法陽性率顯著高于抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng),且特異性為100%,這和熒光定量PCR原理和它所采取一系列新技術(shù)親密相關(guān)。尤其是結(jié)核病患者經(jīng)藥品診療或體內(nèi)出現(xiàn)了細胞壁缺損L型細菌造成分離培養(yǎng)結(jié)果呈陰性時,此方法檢測結(jié)果仍不受影,PCR,且定量結(jié)PCR檢測結(jié)核抗酸桿菌DNA細菌即可取得陽性結(jié)果,而且在本試驗建立過程中,無一例抗酸染色陽性和(或)培養(yǎng)陽性標本實時PCR檢測為陰性。實時PCR,,為結(jié)核快速診療提供了有力參考6?！緟⒖嘉募浚?］vanLethF,vanderWerfMJ,BorgdorffMW.PrevalenceoftubercμLousinfectionandincidenceoftubercμLosis:are-assessmentoftheStyblorμLe［J