植物同工酶分析技術(shù)

實驗8植物同工酶分析技術(shù)什么是同工酶同工酶（isozyme，isoenzyme）是指催化相同的化學反應，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。廣義是指生物體內(nèi)催化相同反應而分子結(jié)構(gòu)不同的酶。按照國際生化聯(lián)合會（IUB）所屬生化命名委員會的建議，則只把其中因編碼基因不同而產(chǎn)生的多種分子結(jié)構(gòu)的酶稱為同工酶。最典型的同工酶是乳酸脫氫酶（LDH）同工酶。同工酶的基因先轉(zhuǎn)錄成同工酶的信使核糖核酸，后者再轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生組成同工酶的肽鏈，不同的肽鏈可以不聚合的單體形式存在，也可聚合成純聚體或雜交體，從而形成同一種酶的不同結(jié)構(gòu)形式。同工酶應用1、在生物學中，同工酶可用于研究物種進化、遺傳變異、雜交育種和個體發(fā)育、組織分化等。例如最原始的脊椎動物七鰓鰻（Lamprey）只有一種LDH肽鏈，進化到較高級的魚類才有A、B兩類肽鏈。又如通過對地理分布不同的物種間某一同工酶譜的普查可以推測物種的地理來源。動、植物的遺傳變異可通過子代和親代同工酶譜的比較來鑒別。法醫(yī)學中也可用多種同工酶譜的分析來鑒定親子關(guān)系。細胞雜交或植物雜交育種后是否出現(xiàn)新品種也可用周工酶譜的比較來確定。在個體發(fā)育中，從胚胎到出生，再到成年，隨著組織的分化和發(fā)育，各種同工酶譜也有一個分化轉(zhuǎn)變的過程。某型同工酶在胚胎的大多數(shù)組織中出現(xiàn)，成為主要型式，稱為原始型同工酶。但出生后在某些組織中逐漸減少而被另一型同工酶取代，后者在胚胎組織中幾乎不存在或含量極微，只在分化成熟的少數(shù)組織中存在，稱為成年型同工酶。在植物的不同發(fā)育階段，同樣可見同工酶譜的相應改變。

2、在醫(yī)學方面，同工酶是研究癌瘤發(fā)生的重要手段，癌瘤組織的同工酶譜常發(fā)生胚胎化現(xiàn)象，即合成過多的胎兒型同工酶。如果這些變化可反映到血清中，則可利用血清同工酶譜的改變來診斷癌瘤。此外。因同工酶譜有臟器特異性，故測定血清同工酶?？奢^特異地反映某一臟器的病變，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是診斷心肌梗塞較特異的指標，較測定血清LDH或肌酸激酶（CK）總活力更為可靠。同工酶分離同工酶分離方法主要有電泳法、層析法、酶學法和免疫學法等，其中以電泳法應用最為廣泛。其原理在于同工酶是功能相同但結(jié)構(gòu)不同的一組酶，由于其結(jié)構(gòu)中氨基酸序列或組成有差異，致使同工酶在電泳時，其遷移率也存在差異電泳電泳(electrophoresis，簡稱EP)指帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。1937年瑞典科學家Tiselius成功地將血清蛋白質(zhì)分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5個主要成分，由于他的突出貢獻，1948年榮獲諾貝爾獎。50年代，先后出現(xiàn)了以濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉及瓊脂作為支持物的電泳技術(shù)。60年代，出現(xiàn)了聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，在此基礎上發(fā)展了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù)。這些技術(shù)具有設備簡單，操作方便，分辨率高等優(yōu)點。電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。混合樣品電泳方向電泳帶孔膠大分子按分子大小分離小分子影響電泳效果的因素1、帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；2、顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；3、溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；4、溶液的pH值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點越近，電泳速度越慢，反之越快；5、電場強度：電場強度越小，電泳速度越慢，反之越快；6、離子強度：離子強度越大，電泳速度越慢，反之越快；7、電滲現(xiàn)象：電場中，液體相對于固體支持物的相對移動；8、支持物篩孔大?。嚎讖叫。娪舅俣嚷?，反之則快。聚丙烯酰胺凝膠電泳膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基團體系時，就會聚合。引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有兩種：（1）化學法：引發(fā)劑是過硫酸銨(AP)，催化劑N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的堿基催化AP產(chǎn)生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺單體形成單體長鏈?；瘜W聚合形成的凝膠孔徑較小，且重復性好，用來制備分離膠；（2）光聚合法：光聚合法的催化劑是核黃素（VB2），光聚合形成的凝膠孔徑較大，且不穩(wěn)定，適于制備大孔徑的濃縮膠。聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點1、聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起；2、鏈的縱橫交錯形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩的性質(zhì)；3、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴散運動，使凝膠具有抗對流的作用；4、長鏈富含酰胺基團，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠；5、該結(jié)構(gòu)不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。過氧化氫酶過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是因為過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標。此外，過氧化物同工酶在遺傳育種中的重要作用也正在受到重視。一、實驗目的1.通過實驗掌握植物同工酶實驗技術(shù)，了解植物同工酶分析在遺傳學研究中的意義2.著重掌握過氧化物酶的提取，電泳與染色技術(shù)和分析方法。二、實驗原理同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式，即催化同一種反應而結(jié)構(gòu)不同的一族酶。它們是受遺傳體系決定的酶的不同分子形式。利用凝膠電泳技術(shù)可以將它們分開，用專一的作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在膠柱上呈現(xiàn)同工酶譜。同工酶的不同分子形式，可以出現(xiàn)在同一生物的不同發(fā)育時期，所以取不同時期的材料，酶帶的情況就不一樣。這是同工酶技術(shù)適用于發(fā)育研究的方便之處。另一方面，利用同工酶技術(shù)進行遺傳學分析與群體遺傳學研究時，則特別要求取材的一致性。否則，它們之間的差異可能不是遺傳而是由發(fā)育造成的。例如要比較2個蠶豆品種的遺傳差別，可用它們的發(fā)芽種子進行比較。但這時至少應該檢查是否是同年的種子、是否在發(fā)芽前都曬過種、是否同時浸種、是否恒溫發(fā)芽以及是否取同樣部位和同樣分量等。同工酶電泳在植物的分類、鑒定、起源、雜種優(yōu)勢利用和育種等研究中有重要意義。三、實驗材料黃豆和蠶豆四、實驗器具和藥品1、器具電泳儀、垂直電泳槽、微量加樣器、Tip頭、研缽、移液管、離心機。2、藥品三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、過硫酸銨、蔗糖、溴酚藍、聯(lián)苯胺、過氧化氫。五、實驗步驟1、提取酶液取蠶豆幼芽2個和黃豆幼芽3個分別置于研缽中，加入1毫升水研磨勻漿、然后將樣品移至小離心管中離心（1000rpm）15min，取上清液，備用。2、聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)的配制(16ml)A液：1mol/L鹽酸48.0ml，Tris36.0g,TEMED0.23ml加水至100ml,pH值8.3

B液：丙烯酰胺30.0g；甲叉雙丙烯酰胺0.8g加水至100ml。

C液：過硫酸銨（用前配制）1.4％。

配膠：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.4∶4.6

配膠后立即灌進裝膠室，插上梳子。3、電極緩沖液配制Tris3.0g,甘氨酸14.4g加水至1000ml,pH8.8,使用時稀釋10倍。4、染色液配制（過氧化物酶染液）醋酸聯(lián)苯胺溶液5毫升，3％H2O22ml，H2O93ml5、加樣和電泳向各加樣孔中滴加24μl的樣品酶粗提液。加一小微滴1％溴酚藍，在電壓120V下進行電泳分離，根據(jù)指示劑位置確定電泳時間。電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，用刀片或薄板輕輕將玻璃夾層分開。電泳緩沖液加在槽中的樣品夾在兩塊玻璃板之間的凝膠電泳緩沖液電泳示意圖分子量大分子量小電源6、染色將完整的膠塊置于染色器皿中，加入染色液，浸泡整塊凝膠，室溫下染色20—30min，呈現(xiàn)酶帶后取出膠塊，用水漂洗以終止染色。7、對帶型清楚的膠應做攝影記錄或做掃描測定，膠晾干后做永久保存。六、實驗報告及思考與練習1、繪出樣品同工酶譜，并說明酶譜差異。、2、將酶帶條數(shù)、寬度、著色深淺和移動距離填入下表(表16-1)：計算酶帶的相對遷移率Rf=某酶帶遷移距離/溴酚藍指示劑遷移距離表16-1根據(jù)遷移率Ｒ，值繪制同工酶酶譜及聚類分析；①計算酶譜的相似性系數(shù)：ｃ＝２ｗ／（＋ｂ），其中，ｎ為種Ａ酶譜的酶帶數(shù)，ｂ為種Ｂ酶譜的酶帶數(shù)。Ｗ為Ａ，Ｂ兩種的相同酶帶數(shù)，②計算不相似性系數(shù)值：ｄ：ｚ—ｆ。③采用未加權(quán)配群法，即ＵＰＧＭＡ法，進行聚