生化實(shí)驗(yàn)講義：實(shí)驗(yàn)十一親和層析（最后）

?化實(shí)驗(yàn)講義：實(shí)驗(yàn)??親和層析（最后）實(shí)驗(yàn)??親和層析純化胰蛋?酶?、引?前?我們所學(xué)的凝膠過濾法、離?交換法以及電泳等?系列分離純化?物?分?的?段，?起早期采?的鹽析法，有機(jī)溶劑及等電點(diǎn)沉淀法等，分離效果要好得多。但是，這些?法中，或是利??物?分?在?定條件下不同的溶解度、電荷分布、總電荷的不同，或是依據(jù)其分?的??和形狀的不同。?句話，多是利??物分?間物理和化學(xué)性質(zhì)的差異來進(jìn)?分離純化的。由于這些?法的特異性?較低，加之待分離物質(zhì)之間的物化性質(zhì)差異較?，常常要綜合不同的分離?法。經(jīng)過許多步驟才能使?物分?達(dá)到?定的純度。這樣既費(fèi)時間，?費(fèi)試劑，有時最后產(chǎn)品還不能令?滿意。另外，有些?物?分?，往往在?物組織或發(fā)酵液中的含量很低，相對地說雜質(zhì)很多，特別是?些具有?物活性的分?，往往由于分離純化的步驟很多，時間過長，造成破壞以致失活，產(chǎn)率很低。這就促使?們?nèi)で笮碌?法來解決存在的問題。親和層析法是近?多年來迅速地發(fā)展并?泛被采?來分離純化?物?分?的?種?分有效的?法。它具有分離快速，純化效率?。特別是對于那些含量少，雜質(zhì)多，采?常規(guī)?法難于分離的?物活性分?，顯?了獨(dú)特的優(yōu)越性。有時?次被分離物質(zhì)的純度可提??倍，??倍甚??百倍。因此，親和層析技術(shù)已成為純化?物分?，特別是純化?物活性物質(zhì)最重要的?法之?。?、實(shí)驗(yàn)?的與要求1.理解親和層析法的基本原理，并通過實(shí)驗(yàn)?zāi)艹醪秸莆罩苽?種親和吸附劑的操作?法；2.理解和掌握親和層析實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)；3.學(xué)會?種測定蛋??解酶活?及?活的?法。三、基本原理簡?之，親的層析主要是根據(jù)?物分?與其特定的固相化的配基或配體之間具有?定的親和??使?物分?得以分離。這是由?種典型的吸附層析發(fā)展?來的分離純化?法。許多?物分?都有?種獨(dú)特的?物學(xué)功能。即它們都具有能和某些相對應(yīng)的專?分?可逆地結(jié)合的特性（分?間通過某些次級鍵結(jié)合，如范德華?，疏??，氫鍵等，在?定條件下?可解離）。如：酶和底物（包括酶的抑制劑、產(chǎn)物、輔酶及其底物的類似物）的結(jié)合。特異性的抗體?抗原（包括病毒、細(xì)胞）、激素與其受體、載體蛋?，基因與其互補(bǔ)DNA、mRNA及阻遏蛋?的結(jié)合，植物凝集素與淋巴細(xì)胞表?抗原及某些多糖的結(jié)合等。均屬于專?性?可逆的結(jié)合。這種分?之間的結(jié)合能?叫做親和?。親和層析正是利??物分?間所具有的專?親和??設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。所以有?稱為“?物專?吸附技術(shù)”或“功能層析技術(shù)”。在實(shí)際?作中，只要把被識別的分?，稱為配基（Ligand），在不損害其?物學(xué)功能的條件下共價結(jié)合到?不溶性載體或基質(zhì)上（Matrix,如Sepharose4B）制成親和吸附247劑，然后裝柱。再把含有要分離純化的物質(zhì)的混合液通過這個柱?，這時絕?部分對配基沒有親和?的化合物均順利地流過層析柱?不滯留，只有與配基互補(bǔ)的化合物被吸附留在柱內(nèi)。當(dāng)所有的雜質(zhì)從柱上流?后，再改變洗脫條件，使結(jié)合在配基上的物質(zhì)解離下來。這樣，原來混合液中被分離的物質(zhì)便以?度純化的形式在洗脫液中出現(xiàn)。其過程可?簡圖表?如下：親和層析原理?意圖本實(shí)驗(yàn)為了純化胰蛋?酶，采?胰蛋?酶的天然抑制劑—雞卵粘蛋?作為配基制成親和吸附劑，從胰臟粗提取液中純化胰蛋?酶。雞卵粘蛋?是專?性較?的胰蛋?酶抑制劑，對?和豬的胰蛋?酶有相當(dāng)強(qiáng)的抑制作?，但不抑制糜蛋?酶。在pH=7~8的緩沖溶液中卵粘蛋?與胰蛋?酶牢固地結(jié)合，?在pH=2~3時，?能被解離下來。因此，采?雞卵粘蛋?作成的親和吸附劑可以從胰臟粗提液中通過?次親和層析直接獲得活??于10,000BAEE單位/毫克蛋?胰蛋?酶制品，??經(jīng)典分離純化?法簡便得多。純化效率可達(dá)到10~20倍以上。四、試劑與器材主要試劑：丙酮三氯?酸HClNaOHNaClNaHCO3Na2CO3氯代環(huán)氧丙烷?腈甲酸TrisCaCl2KClDEAE-纖維素Sepharose-4B.新鮮豬胰臟雞蛋清?酸?氧六環(huán)?甲基亞砜主要貯存溶液：1.雞卵粘蛋?層析液（1升）0.02mol/LpH=7.3Tris-HClBuffer。2.DEAE-纖維素處理液：0.5mol/LHCl300ml和0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl0.3升。3.卵粘蛋?洗脫液：0.02mol/LpH=7.3Tris-HClBuffer含0.3mol/LNaCl,150ml.4.標(biāo)準(zhǔn)胰蛋?酶溶液：結(jié)晶胰蛋?酶以0.001NHCl配制成50g/ml。5.親和層析柱平衡液：0.1mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer,含0.5mol/LKCl、2480.05mol/LCaCl2,500ml。（配1000ml：12.1gTris，37.5gKCl，5.6gCacl2）。6.0.05mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer含0.2%Cacl2（全斑公?，配1000ml：6.05gTris?溶后，先?4mol/LHCl調(diào)pH為8.0，然后?可加2gCacl2）。7.親和柱解吸液：0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5,500ml。（配1000ml：37.5gKCl，4.35ml甲酸）。8.Sepharose4B膠清洗液：0.5mol/LNaCl和0.1mol/LNaHCO3緩沖液，pH=9.5,各500ml.9.BAEE底物緩沖液：34mgBAEE溶于50ml0.05mol/LpH=8.0Tris-HClbuffer中，臨?前配制，冰箱內(nèi)可保存3天。主要器材：恒溫?浴，溫度計(jì)，G2玻璃漏?，抽濾瓶，布?漏?，離?杯（50ml），透析袋，層析柱（2×30cm,26×30cm），秒表，移液管，貯液瓶（1升），電磁攪拌器，pH計(jì)，紫外分光光度計(jì)，紗布，勻漿器，pH試紙。五、實(shí)驗(yàn)操作步驟（?）雞卵粘蛋?的分離及純化1.雞卵粘蛋?（Ovomucoid）的?些性質(zhì):Ovomucoid是?種糖蛋?，在中性及偏酸性溶液中對熱及?濃度脲、有機(jī)溶劑，均有較?的耐受性。但在較酸、堿條件下，易引起變性。Ovomucoid帶有四種糖基，因此有較強(qiáng)的吸?性。在50%丙酮或5%三氯?酸鹽的?溶液中，仍有較好的溶解度。所以，選擇合適的pH，丙酮濃度和三氯?酸鹽的濃度，可以從蛋清中除去?量的?卵粘蛋?。由于Ovomucoid所帶的糖基不同，電泳?為呈現(xiàn)出不均?性，等電點(diǎn)在3.9~4.5之間并呈現(xiàn)出四條電泳條帶，但它們在?物學(xué)功能上差異不?，在氨基酸組成上?乎?差異，分?量約為28,000。每1摩爾的卵粘蛋?分?能抑制1摩爾的胰蛋?酶。所以每毫克?純度的卵粘蛋?能抑制約0.84毫克的胰蛋?酶。Ovomucoid在280nm處的百分消光系數(shù)A1%1cm.280=4.13.，即蛋?酶濃度為1mg/ml時,溶液的吸光度A280=0.413，據(jù)此可以測定其溶液中蛋?質(zhì)的含量。2.Ovomucoid的分離及粗品制備：取2只雞蛋，得蛋清約50ml，將其溫?zé)?25℃左右，加?等體積10%pH=1.0的三氯?酸溶液（配制三氯?酸：稱取10克三氯?酸，?70ml蒸餾?溶解，再?5mol/LNaOH調(diào)pH=1.0左右，最后加蒸餾??100ml。），這時出現(xiàn)?量??沉淀，充分?jǐn)噭蚝?，測定溶液的pH值，此時溶液的pH值應(yīng)當(dāng)是3.5±0.2,若偏離此值，?5NHCl或5mol/LNaOH溶液調(diào)pH=3.5±0.2，注意在調(diào)pH值時，要嚴(yán)防局部過酸或過堿。接著25℃放置4?時或過夜。次??4000~6000轉(zhuǎn)/分離?20分鐘，收集清液，再?三層紗布過濾并檢查濾液的pH值是否仍為3.5±0.2，若不是，則要調(diào)回到此范圍內(nèi)。然后將清液放冰浴冷卻?0℃，緩緩加?3倍體積預(yù)先冷卻的丙酮，?玻璃棒攪拌均勻并?塑料薄膜蓋好防?丙酮揮發(fā)，放冰箱或冰浴中3~4?時后，離?（3000轉(zhuǎn)/分，15~20分鐘）收集沉淀（清液留待回收丙酮）。將沉淀抽真空去凈丙酮，得到粗的卵粘蛋?。將其?20ml左右蒸餾?溶解。若溶解后的溶液渾濁，可?濾紙過濾或離?去掉不溶物。取上清裝透249析袋，并對蒸餾?透析去除三氯?酸（或?SephadexG-25凝膠層析柱脫鹽去除三氯?酸）。測定其抑制胰蛋?酶的?活?。若?活??于7000BAEE/mg，可直接?作親和配基制備親和吸附劑，否則應(yīng)進(jìn)?步純化。3.Ovomucoid的純化DEAE-纖維素的處理：稱取10克DEAE-Cellulose粉（DE-32），先?約150ml0.5mol/LNaCl?0.5mol/LNaOH溶液溶脹30分鐘，?G2漏?抽?并?去離??沖洗?中性，轉(zhuǎn)?燒杯中再?約150ml0.5mol/LHCl浸泡20分鐘，再在G2漏?中?蒸餾?洗?中性，最后?約150ml0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl緩沖液浸泡，抽真空去?泡后裝柱（?2cm×20cm柱），并?同?緩沖液平衡?個床體積即可使?。將粗的Ovomucoid制品加?等體積的0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl綏沖液后上柱吸附，并?同?緩沖液洗雜蛋??A280<0.05為?。最后?含0.3mol/LNaCl的上述Tris-HCl緩沖液洗脫。收集具有胰蛋?酶抑制活性的蛋?峰。測定合并液的蛋?含量及卵粘蛋?的?活性及總活?。最后將其對蒸餾?透析（或?SephadexG-25）脫鹽，精確調(diào)溶液pH=4.0~4.5，加?3倍體積予冷的丙酮沉淀，放冰箱或冰浴3~4?時，然后離?（3000轉(zhuǎn)/分，15~20分鐘）收集沉淀（清液回收丙酮），真空下抽去丙酮即得卵粘蛋??粉。如將透析后溶液吹風(fēng)濃縮，冰凍?燥則得海綿狀松軟???粉的卵粘蛋?。雞卵粘蛋?粗提物在DEAE-Cellulose柱上的層析圖平衡緩沖液：0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl緩沖液沖洗緩沖液：同上洗脫液：0.02mol/LpH=7.3Tris-HCl緩沖液并含0.3mol/LNaCl（?）親和吸附劑的合成?前有多種?法活化載體和偶聯(lián)配基制備親和吸附劑。本實(shí)驗(yàn)采?氯代環(huán)氧丙烷活化載體與偶聯(lián)配基（在附錄中注明了溴化氰活化載體與偶聯(lián)配基的?法）。1.載體Sepharose4B的活化-氯代環(huán)氧丙烷活化.可?下?兩種溶劑。(1)?氧六環(huán)250取10ml沉淀體積的Sepharose4B于G2玻璃燒結(jié)漏?中，抽濾成半?，先?約100ml.0.5mol/LNaCl溶液淋洗，再?100~150ml蒸餾?洗滌，以除去其中的保護(hù)劑和防腐劑。抽?約得6克半?濾并，置于50ml三?瓶中，加?6.5ml2mol/LNaOH，2ml氯代環(huán)氧丙烷及15ml56%?氧六環(huán)，并置于40℃溫和攪拌2?時，然后將膠轉(zhuǎn)移到G2玻璃漏?中以蒸餾?淋洗除去多余的試劑，最后再?約100ml0.2mol/LNa2CO3pH=9.5緩沖液洗滌。接著盡快進(jìn)?偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)。（2）?甲基亞砜同（1）法將6克半?濾并置于50ml三?瓶中，加?6.5ml2mol/LNaOH，2ml氯代環(huán)氧丙烷及15ml56%?甲基亞砜，充分混勻，在40℃振蕩2?時，然后同（1）法洗滌凝膠后盡快進(jìn)?偶聯(lián)。2.雞卵粘蛋?與活化的載體Sepharose-4B偶聯(lián)將已活化好的Sepharose-4B轉(zhuǎn)移到三?瓶中。?10ml0.2mol/LNa2CO3,pH=9.5緩沖液將上述制備好的卵粘蛋?溶解（或0.1mol/LNaOH10ml溶解），取出0.1ml溶液稀釋20~30倍，?紫外分光光度計(jì)測定卵粘蛋?的含量。剩余的溶液全部轉(zhuǎn)移到三?瓶中與活化好的Sepharose4B偶聯(lián)。在40℃恒溫?fù)u床振蕩24?時左右。偶聯(lián)終?后，將凝膠倒?G2漏?中抽?并?100ml0.5mol/LNaCl溶液洗去未偶聯(lián)上的蛋?（收集濾液，測蛋?含量及總活?，以計(jì)算偶聯(lián)率）,再?100ml蒸餾?淋洗。接著?親和洗脫液（0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5）50ml洗?次。最后?蒸餾?洗?中性，浸泡于親和柱平衡液0.05mol/LCaCl20.1mol/LpH=8.0Tris-HCl緩沖液中，放冰箱待?。環(huán)氧氯丙烷活化載體與蛋?質(zhì)配基的偶聯(lián)反應(yīng)式如下：（三）親和層析分離純化胰蛋?酶1.粗胰蛋?酶的制備取100g新鮮冰凍豬胰臟，剝?nèi)ブ炯敖Y(jié)締組織后在勻漿機(jī)器中攪碎，加?約200ml,預(yù)冷的?酸酸化?（pH=4.0）,8~10℃條件下,攪拌提取4~5?時，然后四層紗布擠濾（殘?jiān)?約100ml?酸酸化?攪拌提取1?時，四層紗布擠濾），收集合并兩次濾液，?2.5mol/LH2SO4調(diào)pH=2.5.~3.0，放置1~2?時（靜置期間要檢查?下pH值，應(yīng)始終保持pH=2.5~3.0）,最后?濾紙過濾，收集濾液待激活。2512522.胰蛋?酶原的激活：將濾液?5mol/LNaOH調(diào)pH=8.0，加固體CaCl2，使溶液中Ca2+的終濃度達(dá)到0.1mol/L。(注意先取2ml胰蛋?酶粗提液測定激活前的蛋?含量及酶活性。)然后加?2~5mg結(jié)晶胰蛋?酶進(jìn)?激活，于5℃冰箱放置18~20?時進(jìn)?激活（或在室溫下，20~25℃左右激活2~4?時）即可完成。激活期間，分別在16、18?時取樣測酶的活性，待酶的?活達(dá)到800~1000BAEE單位/mg時停?激活。?2.5mol/LH2SO4調(diào)?pH=2.5~3.0,濾去CaSO4沉淀物，濾液放冰箱內(nèi)備?。3.親和層析純化胰蛋?酶：（1）裝柱：取??層析柱，先裝?1/4體積的親和柱平衡液（0.1mol/LpH=8.0,含0.05mol/LCaCl2的Tris-HCl溶液）。然后將親和吸附劑輕輕攪勻，緩緩加?柱內(nèi)，待其?然沉降，調(diào)好流速3ml/10min左右,?親和柱平衡液平衡，檢測流出液A280值?于0.02.（2）上樣：將胰蛋?酶粗提液?5mol/LNaOH調(diào)?pH=8.0,（若有沉淀，過濾去除之）。取?定體積上述澄清溶液上柱吸附。上樣體積可?致計(jì)算如下：胰蛋?酶上樣體積（ml）=5.1103.184.04ACW式中：W：是卵粘蛋?偶聯(lián)的總mg數(shù)；0.84：是1mg卵粘蛋?能抑制約0.84mg胰蛋?酶；3×104：是純化后胰蛋?酶?活的近似值；C：是胰蛋?酶粗提液的濃度（mg/ml）；A：是胰蛋?酶粗提液的?活（BAEE/mg）；1.5：是上樣量過量50%。吸附畢，先?平衡液洗滌，?流出液A280<0.02。換洗脫液洗脫。（3）洗脫及收集胰蛋?酶：?0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5洗脫液進(jìn)?洗脫。洗脫速度約2~4ml/10min.然后收集蛋?峰并測定收集液的蛋?含量、酶的?活?及總活?。親和層析柱?平衡緩沖液平衡后可再次作親和層析。若柱內(nèi)加?防腐劑0.01%疊氮化鈉NaN3在冰箱中保存，?少?年內(nèi)活性不喪失。最后可?兩種?法將純化的胰蛋?酶制成固體保存：（1）將?活?最?部分?固體(NH4)2SO4以0.8飽和度鹽析，放置4?時以上，抽濾收集硫酸銨沉淀（要抽?）。濾并先?少量蒸餾?溶解，再加?1/4體積0.8mol/LpH=9.0的硼酸溶液，冰箱中放置,數(shù)?后即可獲得棒狀結(jié)晶。（注：只有胰蛋?酶的量較多時，才能得到結(jié)晶品）。（2）將親和層析獲得的胰蛋?酶溶液放?透析袋內(nèi)，在4℃對蒸餾?透析，然后冷凍?燥成?粉。胰蛋?酶在親和柱上的分離曲線六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理1.繪制親和柱層析洗脫曲線。2.計(jì)算雞卵粘蛋?的?活?。3.計(jì)算雞卵蛋?的偶聯(lián)量。4.繪制酶促反應(yīng)動?學(xué)曲線（求初速度）。5.計(jì)算親和層析純化胰蛋?酶的?活?及純化效率。最后將親和層析過程中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)詳細(xì)列?下表中。附錄?：?溴化氰活化載體及偶聯(lián)配基?法1.載體Sepharose4B的活化：取15ml沉淀體積的Sepharose4B,抽濾成半?物，?約10倍體積0.5mol/LNaCl洗，再?10~15倍蒸餾?洗去其中的保護(hù)劑和防腐劑。抽?約得2538克半?濾并，放??燒杯中，加?等體積的2mol/LpH=10.5NaHCO3緩沖溶液，外置?冰浴，在通風(fēng)廚內(nèi)于電磁攪拌器上輕輕地進(jìn)?攪拌，然后再緩慢加CNBr—?腈溶液3ml（含CNBr1g/ml?腈），邊測pH，通過逐滴加?2mol/LNaOH，始終維持pH在10.5左右，待CNBr—?腈溶液加完并且pH不再明顯變化時，即可終?反應(yīng)（?般在30~35分鐘內(nèi)完成）。?即投?少許冰塊，取出并迅速轉(zhuǎn)移?G2玻璃燒結(jié)漏?中抽濾，??量冰?洗，最后?冷的0.1mol/LpH=9.5NaHCO3緩沖溶液洗，其?量約為凝膠體積的10~15倍。接著抽?待?。2.雞卵粘蛋?的偶聯(lián)：將30ml（約0.5g蛋?質(zhì)）對0.1mol/LpH=9.5NaHCO3透析平衡過的雞卵粘蛋??即加?上述活化好的凝膠中，室溫緩慢攪拌反應(yīng)6?時，這?步動作要快，從載體活化后到加?配基的時間最好不超過2分鐘，因活化好的載體極不穩(wěn)定，易變成?活性的產(chǎn)物。反應(yīng)6?時后取出抽濾，先??量去離??洗，然后?20ml1mol/L?醇胺（pH=9~9.5）封閉殘存的活性基團(tuán)，室溫攪拌反應(yīng)2?時，抽濾。再?凝膠體積2~3倍的0.2mol/L甲酸和0.1mol/LpH=8.3Tris—HCl緩沖液交替洗滌，直到流出液中A280<0.05為?。抽?后?0.05mol/LpH=8.3Tris-HClBuffer浸泡,然后置冰箱中待?。溴化氰活化載體與蛋?質(zhì)配基偶聯(lián)反應(yīng)式如下：附錄?：酶活?的測定1.胰蛋?酶活?的測定：本實(shí)驗(yàn)以苯甲酰L—精氨酸?酯（英?縮寫為BAEE）為底物，?紫外吸收法進(jìn)?測定。?法如下：取2個光程為1厘?的帶蓋?英??杯，先在?只杯中加?25℃予熱過的2.0ml緩沖液（0.05mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer,含0.2%CaCl2）。0.2ml0.001mol/LHCl，然后再加0.8mlBAEE-0.05mol/LpH=8.0Tris-HClBuffer（含0.2%CaCl2和1mmol/LBAEE）作為空?，校正儀器的253nm處光吸收零點(diǎn)。再在另???杯中加?0.2ml待測酶液（?量?般為10微克結(jié)晶的胰蛋?酶），?即混勻并記時（杯內(nèi)已有2.0ml緩沖液和0.8mlBAEE溶液）。每半分鐘讀數(shù)?次，共讀3~4分鐘。若?A253/min>0.400，則酶液應(yīng)當(dāng)稀釋或減量，控制?A253/min在0.05~0.100左右為宜。254255繪制酶促反應(yīng)動?學(xué)曲線，從曲線上求出反應(yīng)起始點(diǎn)吸光度隨時間的變化率（即初速度）?A253/min。胰蛋?酶活?單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25℃，反應(yīng)體積3.0ml，光徑1厘?的條件下，測定?A253，每分鐘使?A253增加0.001，反應(yīng)液中所加?的酶量為?BAEE單位。所以：胰蛋?酶溶液的活?單位（BAEE單位/ml）＝稀釋倍數(shù)酶液加?體積001.0(min)253A胰蛋?酶?活?（BAEE單位/mg）＝酶液加?體積／胰酶濃度酶液活??)(mlmg2.卵粘蛋?抑制活性的測定胰蛋?酶抑制活?單位的定義：抑制?個胰蛋?酶活?單位（BAEE單位）所需卵粘蛋?的量，定為抑制劑的?個活?單位（英?縮寫為BAEETIu）。具體測定?法如下：?先以底物（不加酶）于253nm處校正儀器光吸收零點(diǎn)（操作如上述）；再測定標(biāo)準(zhǔn)酶的活?單位（操作如上述）；測定加?抑制劑后剩余酶活?單位；在??杯中加?0.2ml上述標(biāo)準(zhǔn)酶液再加?適量的抑制劑（?般不能超過標(biāo)準(zhǔn)酶含量，以1：2左右為宜，具體視抑制劑的純度?定），再加?1.8ml0.05mol/LpH=8.0Tris-HCl緩沖液，搖勻后于25℃放置2分鐘以上，讓酶與抑制劑充分結(jié)合。最后加?0.8ml底物（BAEE溶液），搖勻?即記時，測定A253的變化。計(jì)算剩余酶活?單位。按下??式計(jì)算出抑制劑的抑制活?和抑制?活?：抑制劑溶液的抑制活?Iu＝ViNiAiA001.00－（BAEE抑制單位/ml）抑制?活?＝)(ml