chap糖的研究方法實(shí)用

會計(jì)學(xué)1chap糖的研究方法實(shí)用糖復(fù)合物中糖鏈功能的研究方法利用糖基化過程不同的天然突變細(xì)胞株用糖苷酶體外修飾造成糖鏈結(jié)構(gòu)差異用糖合成抑制劑造成體內(nèi)糖基化加工的差異通過定點(diǎn)突變改變糖蛋白的糖基化位點(diǎn)，使糖鏈增加或缺失關(guān)閉或過表達(dá)糖鏈生物合成必需的糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶的基因利用自發(fā)突變的人類或動物模型……糖復(fù)合物中糖鏈的功能研究第1頁/共22頁1）利用糖基化過程不同的天然突變細(xì)胞株可將細(xì)胞用化學(xué)（如烷化劑）、物理（如電離輻射）或生物（如病毒轉(zhuǎn)染）方法進(jìn)行處理，使細(xì)胞發(fā)生誘變?？墒褂媚兀?xì)胞毒性或?qū)е录?xì)胞黏附）抗性、輻射自殺、影印鋪板等方法篩選突變體。常缺失或過表達(dá)糖鏈合成加工中的某一或是某些糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷水解酶。但糖鏈加工的缺陷有時(shí)不完全或不專一?？梢栽隗w外研究細(xì)胞粘附，分子識別和蛋白質(zhì)折疊、分揀等。但對于糖鏈在胚胎發(fā)育和分化中的作用研究有局限性。糖復(fù)合物生物功能研究方法（1）第2頁/共22頁影印鋪板法篩選突變體細(xì)胞因相關(guān)酶缺陷無法進(jìn)行硫酸化的突變株因相關(guān)酶缺陷導(dǎo)致HSPG糖鏈結(jié)構(gòu)改變而無法與bFGF結(jié)合第3頁/共22頁糖基供體（糖核苷酸）的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷糖基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)性質(zhì)或細(xì)胞定位改變新的糖基轉(zhuǎn)移酶被活化GPI錨生物合成的突變體蛋白聚糖組裝中的突變體糖脂和粘蛋白組裝中的突變體…N-糖基化過程有關(guān)的細(xì)胞突變株第4頁/共22頁糖核苷酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中的細(xì)胞突變株StrainBiochemicaldefectGlycosylationphenotypeLec32(CHO)CMP-Neu5AcsynthetasesialicacidLec2(CHO)CMP-Neu5ActransporterreducedinNeu5Ac;N-andO-glycansterminateinGalLec8(CHO)UDP-GaltransporterreducedinGal;N-glycansterminateinGalNAcLec13(CHO)GDP-Man-2,4-dehydratasereducedinFucresiduesldlD(CHO)UDP-Gal/UDP-GlcNAc-4-epimeraseN-glycansreducedinGalandterminateinGlcNAc；O-glycansandchondroitinsulfatenotpresentintheabsenceofaddedGalNAc；GAGdeficientintheabsenceofGalD33W25-1(MDAY-D2)SAP(CHO)activationofCMP-Neu5AchydroxylaseterminateinNeu5Gc第5頁/共22頁糖基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)性質(zhì)或細(xì)胞定位改變StrainBiochemicaldefectGlycosylationphenotypeLec1(CHO)GlcNAc-TIMan5GlcNAc2AsnClone15B(CHO)Lec1A(CHO)GlcNAc-TI(Kmdefect)complexmixtureofglycansandMan5GlcNAc2AsnRicR21(BHK)GlcNAc-TIIMan3GlcNAc2AsnLec4A(CHO)GlcNAc-TVlocatedintheincorrectcompartmentcomplexN-glycanslackβ(1,6)GlcNAcbranchfromαMan(1,6)Sil(KB)α2,3sialyl-TreducedNeu5AconO-glycans第6頁/共22頁新的糖基轉(zhuǎn)移酶被活化StrainBiochemicaldefectGlycosylationphenotypeLEC11(CHO)(1,3)Fuc-TterminalLewisX,SA-LewisX,andVIM-2LEC14(CHO)GlcNAc-TVIIadditionalGlcNAcincoreLEC18(CHO)GlcNAc-TVIIIadditionalGlcNAcincoreLEC10(CHO)GlcNAc-TIIIcomplexchainshavethebisectedGlcNAcresidue第7頁/共22頁糖復(fù)合物生物功能研究方法（2）應(yīng)用內(nèi)切和外切糖苷酶內(nèi)切糖苷酶PNG酶（肽N聚糖酶）：GlcNAc—GlcNAc—Asn內(nèi)切酶H、CII、D、F：GlcNAc—GlcNAc—AsnPOG酶：GalNAc—Ser/Thr外切糖苷酶：神經(jīng)氨酸酶；α、β半乳糖苷酶；β-N-乙酰氨基己糖酶；α、β甘露糖苷酶；α巖藻糖苷酶等。有嚴(yán)格的立體專一性和鍵專一性。但也有一些酶沒有嚴(yán)格的鍵專一性。第8頁/共22頁天然糖蛋白很難被完全酶解；糖鏈去除可能導(dǎo)致改變蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，不一定就是糖鏈本身的功能。糖苷酶法的問題第9頁/共22頁3）DNA定點(diǎn)突變技術(shù)，改變蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)：以相同電荷或極性的氨基酸取代，如Asn→Gln，Ser→Cys，一般不會引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。對糖鏈的缺失有選擇性。但不能研究單個糖基的作用。4）糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除或封閉，或基因過表達(dá)：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或ES細(xì)胞，進(jìn)行基因knock-out,knock-inorknock-down，研究轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)育和表型變化。可研究單個糖基的功能。糖復(fù)合物生物功能研究方法（3）第10頁/共22頁Approachestoalteringglycosylationinstudiesofoligosaccharidefunction第11頁/共22頁糖復(fù)合物生物功能研究方法（4）5）利用自發(fā)突變的人類和動物模型動物的缺陷主要影響蛋白聚糖的生物合成，因?yàn)檫@些缺陷引發(fā)的不良形態(tài)容易識別。多種溶酶體貯積異常的突變。多種CDGS疾病個體第12頁/共22頁糖基化途徑自發(fā)異常引發(fā)的疾病舉例Carbohydrate-deficientglycoproteinsyndromes(CDGS)severalgeneticdefectsintheassembly,transfer,andearlyprocessingofN-glycans人白細(xì)胞粘附缺乏綜合癥II型decreasedconversionofGDP-MantoGDP-Fuc;人Galactosemia半乳糖血癥defectsinformingUDP-Gal,e.g.,Gal-1-phosphateuridyltransferase人斑點(diǎn)狀角膜營養(yǎng)不良I型defectivekeratansulfatebiosynthesis人Ehlers-Danlos先天性結(jié)締組織發(fā)育不良綜合癥伴早老綜合癥partialdeficiencyofxylosylproteinβ4galactosyltransferase(GalT-I)人骨發(fā)育不良diastrophicdysplasiasulfatetransporter;defectinsulfateavailability人矮型病Brachymorphism(bm)adenosine-phosphosulfatekinasedeficiency(SK2);defectinsynthesisofsulfatedonor(PAPS)鼠軟骨基質(zhì)缺乏aggrecanproteoglycangene(frameshift)鼠第13頁/共22頁6）應(yīng)用糖鏈合成或加工抑制劑衣霉素（Tunicamycin）：既有尿苷、酰化葡萄糖樣結(jié)構(gòu)，又有長鏈脂肪酸，和G寡糖合成起始反應(yīng)的兩個底物有結(jié)構(gòu)相似，因此可抑制G寡糖合成的起始反應(yīng)，進(jìn)而也抑制了蛋白質(zhì)的N-糖基化。但對糖蛋白和糖基化位點(diǎn)無選擇性，也可能影響糖蛋白的空間構(gòu)象。糖復(fù)合物生物功能研究方法（5）第14頁/共22頁衣霉素——N-糖鏈從頭合成抑制劑第15頁/共22頁糖合成抑制劑的種類抑制劑的種類靶標(biāo)代謝抑制劑參與共同中間體形成的步驟，如PAPS或核苷酸糖衣霉素抑制N-糖鏈的從頭合成；影響肽聚糖合成植物堿抑制對G寡糖進(jìn)行修剪的糖苷酶而影響N-糖基化，如苦馬豆堿，抑制α-甘露糖苷酶II。底物類似物專一抑制糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶糖苷引物使糖鏈組裝從內(nèi)源接納體轉(zhuǎn)向外源引物第16頁/共22頁代謝抑制劑布萊飛爾定A(BrefeldinA):引起鄰近反式高爾基體網(wǎng)內(nèi)的高爾基體組分逆向運(yùn)輸氯酸鹽作為硫酸鹽的類似物競爭性結(jié)合硫酸化酶而干擾GAG的合成…第17頁/共22頁植物堿：糖苷酶的天然抑制劑植物堿通過抑制參與形成N-糖鏈的糖苷酶而抑制N-糖鏈的后加工過程。通常不干擾蛋白質(zhì)折疊?？囫R豆堿抑甘露糖酶A導(dǎo)致無法合成復(fù)雜型N糖鏈，而大量積聚高甘露糖型和雜合型糖鏈第18頁/共22頁合成的底物結(jié)構(gòu)類似物作為糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑第19頁/共22頁糖苷引物Xylβ-O-R可以有效穿越質(zhì)膜，進(jìn)入糖基轉(zhuǎn)移酶所在的高爾基體，通過使GAG連接到外源添加的X