m第十四章基因工程

臨床醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室佘集凱

基因重組和基因工程

第十四章目錄第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

DNA重組細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組接合作用、轉(zhuǎn)化作用、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用轉(zhuǎn)座重組同源重組特異位點的重組發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體拼接重組體

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄片段重組體：切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組接合作用轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用細(xì)胞融合（一））接合合作用用當(dāng)細(xì)胞胞或細(xì)細(xì)菌通通過菌菌毛相相互接接觸時時，質(zhì)質(zhì)粒DNA從一一個細(xì)細(xì)胞（（細(xì)菌菌）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至至另一一細(xì)胞胞（細(xì)細(xì)菌）），這這種DNA轉(zhuǎn)移移稱為為接合作作用。質(zhì)?！?xì)菌染染色體體外的的小型型環(huán)狀狀雙鏈鏈DNA分分子可接合合質(zhì)粒粒如F因因子子(Ffactor)（二））轉(zhuǎn)化化作用用通過自自動獲獲取或或人為為地供供給外外源DNA，使使細(xì)胞胞或培培養(yǎng)的的受體體細(xì)胞胞獲得得新的的遺傳傳表型型，稱稱為轉(zhuǎn)化作作用。例：溶菌時時，裂裂解的的DNA片片段被被另一一細(xì)菌菌攝取取。目錄錄（三））轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)作用用當(dāng)病毒毒從被被感染染的細(xì)細(xì)胞（（供體體）釋釋放出出來、、再次次感染染另一一細(xì)胞胞（受受體））時，，發(fā)生生在供供體細(xì)細(xì)胞與與受體體細(xì)胞胞之間間的DNA轉(zhuǎn)移移及基基因重重組即即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作作用。λ噬菌菌體的的生活活史溶菌生生長途途徑溶源菌菌生長長途徑徑例目錄錄目錄錄三、位位點特特異重重組位點特特異重重組是由整整合酶酶催化化，在在兩個個DNA序序列的的特異異位點點間發(fā)發(fā)生的的整合合。例（（一）λ噬菌菌體DNA的整整合λ噬菌菌體的的整合合酶識識別噬噬菌體體和宿宿主染染色體體的特特異靶靶位點點發(fā)生生選擇擇性整整合；；反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病病毒整整合酶酶可特特異地地識別別、整整合反反轉(zhuǎn)錄錄病毒毒cDNA的長末端端重復(fù)復(fù)序列列(LTR)。例（二））細(xì)菌菌的特特異位位點重重組鼠傷寒寒沙門門桿菌菌H片片段倒倒位決決定鞭鞭毛相相轉(zhuǎn)變變hix為反向向重復(fù)復(fù)序列列，它它們之之間的的H片片段可可在Hin控制制下進(jìn)進(jìn)行特特異位位點重重組(倒位位)。。H片片段上上有兩兩個啟啟動子子P，，其一一驅(qū)動動hin基因表表達(dá)，，另一一正向向時驅(qū)驅(qū)動H2和和rH1基基因表表達(dá)，，反向向(倒倒位)時H2和和rH1不不表達(dá)達(dá)。rH1為H1的的阻遏遏蛋白白基因因。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段H1鞭毛素沙門氏氏菌H片段段倒位位決定定鞭毛毛相轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列hinH2IH1例（三））免疫疫球蛋蛋白基基因的的重排排免疫球球蛋白白(Ig)，由由兩條條輕鏈鏈(L鏈)和兩兩條重重鏈(H鏈鏈)組組成，，分別別由三三個獨獨立的的基因因族編編碼，，其中中兩個個編碼碼輕鏈鏈(和)，一一個編編碼重重鏈。。輕鏈的的基因因片段段：重鏈的的基因因片段段：LVJCLVDJC重鏈(IgH)基因因的V-D-J重排排和輕輕鏈(IgL)基因因的V-J重排排均發(fā)發(fā)生在在特異異位點點上。。在V片段段的下下游，，J片片段的的上游游以及及D片片段的的兩側(cè)側(cè)均存存在保保守的的重組組信號號序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重重排的的重組組酶基基因rag(recombinationactivatinggene)共有有兩個個，分分別產(chǎn)產(chǎn)生蛋蛋白質(zhì)質(zhì)RAG1和RAG2。。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)內(nèi)轉(zhuǎn)酯酯反應(yīng)應(yīng)單鏈切切開轉(zhuǎn)移核核苷酸酸修復(fù)、、連接接免疫球球蛋白白基因因重排排過程程目錄錄四、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座重重組由插入入序列列和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座子子介導(dǎo)導(dǎo)的基基因移移位或或重排排稱為為轉(zhuǎn)座(transposition)。典型的的插入入序列列(IS)組成：：二個分分離的的反向向重復(fù)復(fù)(IR)序列列一個轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座酶酶（transposase)編編碼基基因特有的的正向向重復(fù)復(fù)序列列IRTransposaseGeneIR發(fā)生形形式：：保守性性轉(zhuǎn)座座復(fù)制性性轉(zhuǎn)座座（一））插入入序列列轉(zhuǎn)座座插入序序列的的復(fù)制制性轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座目錄錄轉(zhuǎn)座子子(transposons)——可可從一一個染染色體體位點點轉(zhuǎn)移移到另另一位位點的的分散散重復(fù)復(fù)序列列。轉(zhuǎn)座子子組成成：反向重重復(fù)序序列轉(zhuǎn)座酶酶編碼碼基因因抗生素素抗性性等有有用的的基因因IRIRTransposaseGene有用基因（二））轉(zhuǎn)座座子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座座子介介導(dǎo)的的轉(zhuǎn)座座目錄錄第二二節(jié)節(jié)重重組組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique重組DNA技術(shù)術(shù)的發(fā)發(fā)展史史年G.J.Mendel的豌豌豆雜雜交試試驗1944年年O.T.Avery的的肺炎炎球菌菌轉(zhuǎn)化化實驗驗1973年年美美國國斯坦坦福大大學(xué)的的科學(xué)學(xué)家構(gòu)構(gòu)建第一個個重組DNA分子子1977年年美美國國南舊舊金山山由博博耶和和斯旺旺森建建立世世界上上第一家家遺傳工工程公公司，，專門門應(yīng)用用重組組DNA技技術(shù)制制造醫(yī)醫(yī)學(xué)上上重要要的藥藥物。。1980年年開開始始建造造第一家家應(yīng)用重重組DNA技術(shù)術(shù)生產(chǎn)產(chǎn)胰島島素的的工廠廠1997年年英英國國羅林林研究究所成成功的的克隆隆了多莉相關(guān)概概念DNA克隆隆工具酶酶目的基基因基因載載體基本原原理重組DNA技術(shù)術(shù)與醫(yī)醫(yī)學(xué)的的關(guān)系系本節(jié)主主要內(nèi)內(nèi)容一、重重組DNA技術(shù)術(shù)相關(guān)關(guān)概念念克隆(clone)來自同同一始始祖的的相同同副本本或拷拷貝的的集合合。獲取同同一拷拷貝的的過程程稱為為克隆化化(cloning)，即無性繁繁殖。（一））DNA克隆隆技術(shù)水水平：：分子克克隆即即DNA克克隆細(xì)胞克克隆個體克克?。ǎ▌游镂锘蛑仓参铮〥NA克隆隆應(yīng)用酶酶學(xué)的的方法法，在在體外外將各各種來來源的的遺傳傳物質(zhì)質(zhì)（同同源的的或異異源的的、原原核的的或真真核的的、天天然的的或人人工的的DNA））與載載體DNA接合合成一一具有有自我我復(fù)制制能力力的DNA分子子———復(fù)制制子，，繼而而通過過轉(zhuǎn)化化或轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染宿宿主細(xì)細(xì)胞，，篩選選出含含有目目的基基因的的轉(zhuǎn)化化子細(xì)細(xì)胞，，再進(jìn)進(jìn)行擴擴增提提取獲獲得大大量同同一DNA分子子。也也稱基因克克隆或或重組組DNA。生物技技術(shù)工工程:基因工工程、、蛋白白質(zhì)工工程、、酶工工程、、細(xì)胞胞工程程等目的①分分離獲獲得某某一感感興趣趣的基基因或或DNA②獲獲得感感興趣趣基因因的表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物（（蛋白白質(zhì)））基因工工程(geneticengineering)——實實現(xiàn)現(xiàn)基因因克隆隆所用用的方方法及及相關(guān)關(guān)的工工作稱稱基因因工程程，又又稱重組DNA工藝藝學(xué)。（二））工具具酶限制性性核酸酸內(nèi)切切酶DNA聚合合酶ⅠⅠ逆轉(zhuǎn)錄錄酶T4DNA連接接酶堿性磷磷酸酶酶末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶酶TaqDNA聚合合酶重組DNA技術(shù)術(shù)中常常用的的工具具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核核酸內(nèi)切切酶定義限制性核核酸內(nèi)切切酶(RE)是識別DNA的特特異序列列,并并在識別別位點或或其周圍圍切割雙雙鏈DNA的一一類內(nèi)切切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基化化酶共同同構(gòu)成細(xì)細(xì)菌的限限制-修修飾系統(tǒng)統(tǒng)，限制制外源DNA，，保護(hù)護(hù)自身DNA。。分類Ⅰ、Ⅱ、、Ⅲ（基因工工程技術(shù)術(shù)中常用用Ⅱ型））第一個字字母取自自產(chǎn)生該該酶的細(xì)細(xì)菌屬名名，用大大寫；第二、第第三個字字母是該該細(xì)菌的的種名，，用小寫寫；第四個字字母代表表株；用羅馬數(shù)數(shù)字表示示發(fā)現(xiàn)的的先后次次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血血桿菌d株的第三三種酶Ⅱ類酶識識別序列列特點——回文結(jié)構(gòu)構(gòu)(palindrome)切口：：平端切口口、粘端切口口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口同功異源源酶來源不同同的限制制酶，但但能識別別和切割割同一位位點，這這些酶稱稱同功異源源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制制性內(nèi)切切酶雖然然識別序序列不完完全相同同，但切切割DNA后，，產(chǎn)生相相同的粘粘性末端端，稱為為同尾酶。這兩個個相同的的粘性末末端稱為為配伍未端端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基基因cDNA基因組DNA目的基因①分離獲得得某一感興趣趣的基因或DNA②獲得感興興趣基因的表表達(dá)產(chǎn)物（蛋蛋白質(zhì)）（四）基因載載體定義為攜帶目的基基因，實現(xiàn)其其無性繁殖或或表達(dá)有意義義的蛋白質(zhì)所所采用的一些些DNA分子子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外外源DNA序序列被擴增而而特意設(shè)計的的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外外源DNA序序列可轉(zhuǎn)錄翻翻譯成多肽鏈鏈而特意設(shè)計計的載體稱為為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；；具有兩個以上上的遺傳標(biāo)記記物，便于重重組體的篩選選和鑒定；有克隆位點（（外源DNA插入點），，常具有多個個單一酶切位位點，稱為多多克隆位點；；分子量小，以以容納較大的的外源DNA。1.質(zhì)粒(plasmid)特點能在宿主細(xì)胞胞內(nèi)獨立自主主復(fù)制；帶有有某些遺傳信信息,會賦賦予宿主細(xì)胞胞一些遺傳性性狀。目錄λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)統(tǒng)λgt系列（（插入型，適適用cDNA克?。〦MBL系列列（置換型，，適用基因組組克?。?.噬菌體體(phage)M13噬菌體體DNA改造造系統(tǒng)（含lacZ基因因）M13mp系系列pUC系列M13噬菌體體pUC系列列的物理圖譜譜3.粘性質(zhì)質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載載體（如腺病毒，，腺病毒相關(guān)關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒）其他二、重組DNA技術(shù)基本本原理克隆基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄（一）目的基基因的獲取1.化學(xué)合合成法要求：已知目目的基因的核核苷酸序列或或其產(chǎn)物的氨氨基酸序列。。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章章）*1、化學(xué)學(xué)合成法獲取取目的基因由已知氨基酸酸序列推測可可能的DNA序列組織或細(xì)胞染染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分分子含重組分子的的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)細(xì)胞內(nèi)由克隆隆載體所攜帶帶的所有基因因組DNA的的集合*2、從基基因組DNA文庫獲取目目的基因目錄限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*3、從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄（二）克隆載載體的選擇和和構(gòu)建（三）外源基基因與載體的的連接1.粘性末末端連接方式：(1)同一限限制酶切位點點連接(2)不同限限制酶切位點點連接配伍末端連接接非配伍末端連連接BamHⅠ切割反應(yīng)應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4DNA連接酶酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切切位點連接目錄BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA不同限制酶切切位點（配伍伍末端）的連連接配伍末端的連連接情況和同同一限制酶切切位點連接相相似。不同限制酶切切位點（非配配伍末端）的的連接EcoRⅠ切割位點點BglⅡ切割位點點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體目錄2.平端連連接適用于：限制性內(nèi)切酶酶切割產(chǎn)生的的平端粘端補齊或切切平形成的平平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同聚物物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶酶(terminaltransferase)的作用下，在在DNA片段段末端加上同同聚物序列、、制造出粘性性末端，再進(jìn)進(jìn)行粘端連接接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄4.人工接接頭(linker)連接由平端加上新新的酶切位點點，再用限制制酶切除產(chǎn)生生粘性末端，，而進(jìn)行粘端端連接。人工接頭及其其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄受體菌條件安全宿主菌（從大腸桿菌菌K-12改改造）限制酶和重組組酶缺陷處于感受態(tài)導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染感染（四）重組DNA導(dǎo)入受受體菌（五）重組體體的篩選1.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)記選選擇(2)標(biāo)志志補救(markerrescue)(3)分子子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)學(xué)方法如免疫化學(xué)方方法及酶免檢檢測分析等(插入失活法法)抗藥性標(biāo)記選選擇目錄組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油油磷酸脫水酶基因因促進(jìn)組氨酸合合成λDNA重組體標(biāo)志補救目錄α互補目錄α互補的檢檢測目錄原位雜交目錄Southern印跡目錄雞的β肌球蛋蛋白的克隆和和檢出目錄重組DNA技技術(shù)操作過程程可形象歸納納為小結(jié)結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組組DNA技技術(shù)術(shù)操操作作的的主主要要步步驟驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄錄表達(dá)達(dá)體體系系的的建建立立表達(dá)達(dá)載載體體的的構(gòu)構(gòu)建建受體體細(xì)細(xì)胞胞的的建建立立表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物的的分分離離純純化化（六六））克克隆隆基基因因的的表表達(dá)達(dá)1.原原核核表表達(dá)達(dá)體體系系（E.coli表表達(dá)達(dá)體體系系最最為為常常用用））標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)：：選擇擇標(biāo)標(biāo)志志強強啟啟動動子子翻譯譯調(diào)調(diào)控控序序列列多多接接頭頭克克隆隆位位點點E.coli表表達(dá)達(dá)體體系系的的不不足足不宜宜表表達(dá)達(dá)真真核核基基因因組組DNA不能能加加工工表表達(dá)達(dá)的的真真核核蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)表達(dá)達(dá)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)常常形形成成不不溶溶性性包包涵涵體體(inclusionbody)很難難表表達(dá)達(dá)大大量量可可溶溶性性蛋蛋白白大鼠鼠胰胰島島素素原原cDNA的表表達(dá)達(dá)和和分分泌泌目錄錄優(yōu)點點：：可表表達(dá)達(dá)克克隆隆的的cDNA及及真真核核基基因因組組DNA可適適當(dāng)當(dāng)修修飾飾表表達(dá)達(dá)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物分分區(qū)區(qū)域域積積累累缺點點：：操作作技技術(shù)術(shù)難難、、費費時時、、經(jīng)經(jīng)濟(jì)濟(jì)轉(zhuǎn)染染———將表表達(dá)達(dá)載載體體導(dǎo)導(dǎo)入入真真核核細(xì)細(xì)胞胞的的過過程程方法法：：磷酸酸鈣鈣轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染DEAE葡葡聚聚糖糖介介導(dǎo)導(dǎo)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染電穿穿孔孔脂質(zhì)質(zhì)體體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染顯微微注注射射2.真真核核表表達(dá)達(dá)體體系系酵母母、、昆昆蟲蟲、、乳乳類類動動物物細(xì)細(xì)胞胞表達(dá)達(dá)載載體體pFASTBACI的的物物理理圖圖譜譜目錄錄目錄錄（一一））疾疾病病基基因因的的發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)與與克克隆隆根據(jù)據(jù)基基因因定定位位克克隆隆之之并并研研究究其其性性質(zhì)質(zhì)，，而而認(rèn)認(rèn)識識疾疾病病的的分分子子機機制制。。三、、重重組組技技術(shù)術(shù)與與醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)的的關(guān)關(guān)系系（二二））生生物制制藥藥重組組DNA醫(yī)醫(yī)藥藥產(chǎn)產(chǎn)品品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子