免疫學(xué)檢測技術(shù)及在食品中的應(yīng)用

免疫學(xué)檢測技術(shù)及在食品中的應(yīng)用第一頁，共五十九頁，2022年，8月28日利用免疫學(xué)技術(shù)可以檢測細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、各種毒素、蛋白還可檢測激素、藥物殘留、抗生素及其他生理活性物質(zhì)第二頁，共五十九頁，2022年，8月28日1酶免疫技術(shù)——ELISA檢測技術(shù)第三頁，共五十九頁，2022年，8月28日ELISA全稱：酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay）

第四頁，共五十九頁，2022年，8月28日將抗原抗體的特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié)合，使得食品在未經(jīng)分離提取的前提下，即能進(jìn)行定性或定量檢測廣泛用于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、各種毒素等大分子蛋白，以及激素、農(nóng)獸藥殘留、抗生素能小分子物質(zhì)的檢測第五頁，共五十九頁，2022年，8月28日可檢測標(biāo)本類型廣泛體液：血清、血漿、胸腹水、灌洗液、腦脊液分泌物：唾液排泄物：尿液、糞便等細(xì)胞培養(yǎng)上清組織勻漿第六頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.1ELISA的發(fā)展歷程免疫酶標(biāo)記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來的一大新型的血清學(xué)技術(shù)。1966年，Nakane和Avrameas等分別報(bào)道用酶代替熒光素標(biāo)記抗體，建立了酶標(biāo)抗體技術(shù)用于生物組織中抗原的定位和鑒定。1971年，Engvall，VanWeemen等報(bào)道了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，從而建立了酶標(biāo)抗體的定量檢測技術(shù)目前，免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。第七頁，共五十九頁，2022年，8月28日ELISA板酶標(biāo)儀測吸光度第八頁，共五十九頁，2022年，8月28日ELISA是一種免疫測定技術(shù)：基于抗原抗體反應(yīng)酶聯(lián)：抗原或抗體的酶標(biāo)記吸附：抗原或抗體的固相化測定：加入酶反應(yīng)的底物后，被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定1.2解釋：酶聯(lián)免疫吸附測定第九頁，共五十九頁，2022年，8月28日YY第十頁，共五十九頁，2022年，8月28日間接法夾心法競爭法捕獲法1.3類型第十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日酶抗抗體酶標(biāo)記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。（1）間接法第十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日間接法——測抗體洗滌洗滌洗滌待測抗體酶標(biāo)抗抗體病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷第十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日（2）雙抗體夾心法固相載體抗體抗原酶抗體酶標(biāo)記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。第十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日夾心法——測抗原

洗滌洗滌洗滌待測抗原在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等第十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日產(chǎn)品舉例氟苯尼考（FF）ELISA快速檢測試劑盒（GreenSpring）可用于動(dòng)物組織（肌肉、肝臟）、尿液、血清、蜂蜜、腸衣、牛奶以及水產(chǎn)品等樣品中氟苯尼考藥物殘留的檢測。人金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)ELISA檢測試劑盒第十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日（3）酶標(biāo)抗原競爭法固相載體抗體抗原酶酶標(biāo)記抗原1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則優(yōu)先競爭結(jié)合抗體，結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.同時(shí)加入酶標(biāo)記抗原，抗原沒有結(jié)合的位點(diǎn)酶標(biāo)記抗原去占據(jù)，則結(jié)合為酶標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。抗原第十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日競爭法——測小分子抗原洗滌洗滌待測抗原酶標(biāo)抗原小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。第十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日4捕獲法示意圖酶抗體酶標(biāo)記抗體抗原抗抗體固相載體抗體1.將抗抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體復(fù)合物。3.加入抗原及酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。第十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日固相抗IgM特異IgM非特異IgM標(biāo)本特異抗原抗原特異酶標(biāo)抗體底物此法常用于病毒性感染的早期診斷。捕獲法第二十頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.4操作流程第二十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。（1）包被第二十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日包被的條件

pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2的磷酸鹽緩沖液

pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。第二十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日（2）封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉。第二十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日（3）加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚即加樣本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。第二十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日（4）保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。第二十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日（5）洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。第二十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日(6)顯色

顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。第二十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日酶在ELISA中，可以采用的有HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP（辣根過氧化物酶）是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。第二十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日底物HRP的底物

DH2+H2O2

D+2H2ODH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等。第三十頁，共五十九頁，2022年，8月28日OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長為450nm。第三十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.5ELISA影響因素固相載體：ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。抗原：可溶性、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。試驗(yàn)樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗(yàn)樣品。結(jié)合物：酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低。底物：各種酶都有對底物的特異性，不同種類的酶要求有不同的底物。作用時(shí)間：加底物后終止時(shí)間？結(jié)果判斷:ELISA的試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷，也可用分光光度計(jì)作精確測定。試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度）：通常用變異系數(shù)來表示。第三十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日思考：如何研發(fā)商品化的ELISA試劑盒？需要什么原料，得到哪些組分，摸清哪些條件，才能夠進(jìn)行組裝？第三十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日2免疫膠體金技術(shù)（膠體金試紙條檢測技術(shù)、膠體金層析）第三十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日大腸桿菌O157:H7快速檢測試紙（膠體金）第三十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日2.1簡介膠體金試紙條診斷是采用膠體金免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是90年代初在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等檢測。第三十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日膠體金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。故稱膠體金第三十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無棱角。質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀各異。膠體金的質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)第三十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日膠體金標(biāo)記的原理：膠體金在堿性條件下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)靜電吸引而形成牢固結(jié)合。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中

第三十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日2.2膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測抗原/抗體。第四十頁，共五十九頁，2022年，8月28日檢測線質(zhì)控線吸收墊樣品墊硝酸纖維素膜膠體金墊背襯（底板）膠體金試紙條示意圖第四十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日

2.3分類間接法----測抗體雙抗夾心法----測大分子抗原----食品中沙門氏菌的檢測競爭法----測小分子抗原----食品中瘦肉精、黃曲霉毒素的檢測第四十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日沙門氏菌單克隆抗體可能含有沙門氏菌的樣品（1）雙抗夾心法檢測抗原——測大分子抗原沙門氏菌多克隆抗體抗抗體第四十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日第四十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日（2）思考競爭法的原理？檢測線噴的是純化的抗原，與待檢測抗原競爭這種情況下的結(jié)果判定？第四十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日2.4膠體金快速診斷技術(shù)的特點(diǎn)

簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時(shí)間更長。結(jié)果易于判定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。特異性好：因?yàn)樵摷夹g(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，這決定了它具有很好的特異性。第四十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日2.5技術(shù)分項(xiàng)樣品墊吸水墊粘性底板NC膜膠體金墊干燥方法抗原抗體生物原料膠體金制備標(biāo)記技術(shù)溶液噴點(diǎn)溶液體系分析裝配\切條\包裝第四十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日（1）金標(biāo)墊與樣品墊的處理1，金標(biāo)墊裁剪成長10㎝，寬8㎜長條2，樣品墊裁剪成長30㎝，寬2.5㎝長條3，將裁剪好的金標(biāo)墊與樣品墊，分別用金標(biāo)墊處理液與樣品墊處理液浸潤，放入37℃溫箱中烘干儲存在干燥器中置4℃冷庫中備用。第四十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日抗體Antibody來源差異:鼠抗,兔抗和羊抗種類差異:單抗,多抗腹水的處理:飽和硫酸銨沉淀法特異性:親和層析柱濃度:濃縮溶解液:不含鹽,例如PB（2）抗原抗體生物原料抗原Antigen偶聯(lián)抗原物質(zhì):BSA,OVA等毒品檢測來源:合成抗原第四十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日（3）標(biāo)記技術(shù)Conjugate容器硅化處理金顆粒制備(負(fù)電)顏色與顆粒的關(guān)系.最佳標(biāo)記顆粒大小40nm.蛋白質(zhì)最適用量測定:鹽析法第五十頁，共五十九頁，2022年，8月28日（4）膠體金制作流程

1，向硅化過的三角瓶中加入100ml去離子水，再加入1ml濃度為1%的氯金酸

2,將三角瓶放入微波爐中加熱，沸騰時(shí)取出，一次性迅速加入1850μl濃度1%檸檬酸三鈉，搖動(dòng)約20s（檸檬酸三鈉經(jīng)0.22濾膜過濾）

3,再將三角瓶放入微波爐中大火1分鐘，調(diào)中火繼續(xù)加熱五分鐘。

4，拿出來冷卻，待溫度降至室溫時(shí)用去離子水補(bǔ)足到100ml,用0.1M的碳酸鉀調(diào)節(jié)PH至略高于待標(biāo)記蛋白的等電點(diǎn)，0.22過濾轉(zhuǎn)移至硅化過的平底藍(lán)蓋瓶中。

第五十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日5，藍(lán)蓋瓶中放入攪拌子，攪拌，向金溶液中加入蛋白,標(biāo)記量為2μg/ml，緩慢加入標(biāo)記蛋白。6,攪拌,半小時(shí)后加入濃度為10%的BSA至終濃度為0.2%，繼續(xù)攪拌一小時(shí)。7，將標(biāo)記好的溶液轉(zhuǎn)至50ml離心管中，3500rpm/min，4℃離心30min.棄去沉淀，收集上清。第五十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日8，上清轉(zhuǎn)入另外的50ml離心管中，7500rpm/min，4℃離心30min,棄上清收集沉淀。9，用1/2原體積的洗滌液洗滌沉淀，