免疫檢測新技術

免疫檢測新技術第一頁，共三十四頁，2022年，8月28日章節(jié)安排第一節(jié)生物素-親和素免疫檢測新技術第四節(jié)免疫轉印技術的因素第二節(jié)免疫膠體金檢測新技術第2節(jié)影響第三節(jié)免疫電鏡技術第二頁，共三十四頁，2022年，8月28日[目的與要求]

1、了解標生物素-親和素免疫檢測技術的原理及種類。

2、理解免疫膠體金檢測技術的原理及常用的檢測方法。

3、了解免疫電鏡技術的應用。

4、了解免疫轉印技術的原理及應用。

[難點與重點]

重點：免疫膠體金檢測技術的原理。難點：免疫膠體金檢測技術的原理。第三頁，共三十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)生物素-親和素免疫檢測新技術第四頁，共三十四頁，2022年，8月28日

利用生物素與親和素專一性結合以及生物素、親和素既可標記抗原或抗體，又可被標記物所標記的特性，可建立生物素-親和素系統(tǒng)來顯示抗原抗體特異性反應的各種免疫檢測技術。第五頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、生物素與親和素的特性1、生物素生物素(biotin)是一種廣泛分布于動、植物組織的生長因子，亦稱輔酶R或維生素H，尤以蛋黃、肝、腎組織中含量較高。結構式中的咪唑酮環(huán)是與親和素結合的主要部位。利用生物素的羧基加以化學修飾后，可以制成各種活性基團的衍生物，稱為活化生物素。針對不同的被標記物可以應用不同類型的活化生物素。第六頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、生物素與親和素的特性2、親和素

(avidin)：是一種存在于雞蛋清中的堿性糖蛋白，結晶呈白色粉末狀，易溶于水。在pH2～13緩沖液中性質穩(wěn)定，消化道多種蛋白水解酶不能使其失活。它對熱的耐受性較強，經80℃溫度作用2min仍保持活性。親和素是由4個相同的亞單位組成的四聚體，富含色氨酸，通過色氨酸與生物素的咪唑環(huán)呈十分牢固的結合。親和素的每個亞單位可結合1個分子生物素，因此1個親和素分子可結合4個生物素分子。鏈霉親和素

第七頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術類型1、親和素-生物素-過氧化物酶技術(ABC法)

（1）原理：ABC法是利用親和素分別連接生物素標記的第2抗體和生物素標記的酶。生物素標記的第2抗體與ABC復合物相連接，最后加底物進行顯色反應。其中，ABC復合物是將過氧化酶結合在生物素上，再將生物素-過氧化酶連接物與過量的親和素蛋白反應而制備的。第八頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術類型1、親和素-生物素—過氧化物酶技術(ABC法)

（2）應用：①組織切片和細胞懸液中抗原的檢測②在免疫電鏡中的應用標記抗體滲透性是免疫電鏡技術的關鍵，小分子的生物素就可得到更高的滲透力，且生物素化抗體可在組織包埋前或包埋后加入，因此ABC法進行抗原的亞細胞水平定位分析得到較好的應用。第九頁，共三十四頁，2022年，8月28日目前最靈敏的免疫組化二抗檢測系統(tǒng)

由于親和素和生物素有極強的親和力（其親和力比抗體和大多數(shù)抗原的親和力高100萬倍），因而親和素和生物之間的結合是不可逆的。此外，親和素具有4個生物素結合位點，大多數(shù)蛋白質包括酶可以和多個生物素分子結合。利用這些特征，可以把親和素和生物素化的酶結合為大分子復合物（ABC’s）。第十頁，共三十四頁，2022年，8月28日

使用步驟：1．加入一抗，與切片孵育。如加入兔抗腫瘤相關抗原的抗體。2．加入生物素化二抗，如生物素化抗-兔IgG。3．加入親和素-生物素化酶復合物（ABC）。4．加入酶作用底物，定位抗原。第十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術類型2、橋親和素-生物素技術(BRAB)

原理及應用：方法是用生物素分別標記抗體和酶，然后以親和素為橋，把兩者連接起來。檢查抗原時，先用生物素標記的抗體與細胞(或組織內)的抗原反應，洗去未結合的抗體，加人親和素孵育后，洗去未結合的親和素，再加入已標記酶的生物素孵育，洗片，以細胞化學方法呈色反應。第十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術類型3、標記生物素-親和素技術(LAB)

LAB法是以生物素標記抗體作第1抗體，酶標記親和素作為第2抗體。

BRAB法和LAB法都需以生物素標記第1抗體，應用不如ABC法普遍。但是，用于免疫細胞中免疫球蛋白的顯示具有特異性。第十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、親和素-生物素系統(tǒng)免疫檢測技術類型4、生物素-親和素或鏈霉親和素ELISA檢測技術

包括BAB-ELISA，BA-ELISA和ABC-ELISA等技術。第十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日第2節(jié)免疫膠體金檢測技術第十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日

免疫膠體金標記技術是以膠體金顆粒為示蹤標記物或顯色劑，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術。已廣泛應用于光鏡、電鏡、流式細胞儀、免疫轉印、體外診斷試劑的制造等領域。膠體金即水溶膠，是一種帶負電荷的疏水膠體溶液，具有一般溶膠的特性，主要通過還原劑將氯化金分子聚合成特定大小金顆粒的方法而產生?？赏ㄟ^采用檸檬酸、抗壞血酸鈉和白磷等還原氯金酸或四氯化金而制備膠體金。膠體金顆?？赏ㄟ^靜電吸引及其表面的物理特性與多種生物分子(如抗體、SPA)相結合，形成蛋白質-金顆粒復合物，即膠體金標記物(膠體金探針)。一、概述第十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。第十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。第十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。

第二十頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、原理

免疫金標記技術(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。第二十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術1、免疫膠體金光鏡染色法

細胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，以銀顯影液增強標記，使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。第二十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術2、免疫膠體金電鏡染色法

可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結合，然后進行負染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。第二十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術3、斑點免疫金滲濾法

應用微孔濾膜(如NC膜)作載體，先將抗原或抗體點于NC膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體檢測相應的抗原或抗體。第二十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日三、常用的免疫膠體金檢測技術4、膠體金免疫層析法

將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在NC膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發(fā)生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。第二十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日第二十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日四、免疫膠體金檢測技術的應用

免疫膠體金檢測技術主要應用于組織化學染色、基礎免疫學研究(如通過膠體金標記的CD分子單克隆抗體采用流式細胞術檢測淋巴細胞亞群)和疾病診斷。第二十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日第3節(jié)免疫電鏡技術第二十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日

免疫電鏡技術(immuneelectronmicroscopy，IEM)是將抗原抗體反應的特異性與電鏡的高分辨能力相結合的檢測技術，該方法始建于1941年。IEM主要包括兩個方面應用：①在電鏡下利用標記抗體，直接對抗原在分子水平上進行定位；②利用特異性抗體捕獲、濃縮相應的病毒，經負染后在電鏡下檢查病毒粒子，可用于病毒病的診斷。第二十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日一、抗原定位

用酶、鐵蛋白、膠體金標記的特異性抗體，對組織切片進行染色，結合電鏡技術，可對細胞或組織內抗原的分布進行定位。根據(jù)標記物的不同，免疫電鏡技術可分為電鏡免疫酶細胞化學技術、免疫鐵蛋白標記技術、免疫膠體金技術等。第三十頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、病毒檢測

在所檢病毒樣中加入已知抗血清，使形成抗原(病毒)—抗體復合物，經過超速離心或瓊脂、濾紙濃縮、過濾系統(tǒng)后將此抗原—抗體復合物濃集于電鏡銅網(wǎng)的For-mar膜上，負染色后進行電鏡觀察。由于抗體將病毒濃縮在一起，比直接觀察散在病毒粒子的方法大大提高了敏感性。第三十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日

目前有幾種方法：①經典的免疫電鏡法是將待檢樣品與抗血清混合反應后，超速離心，吸取沉淀物染色觀察；②快速法是在瓊脂糖凝膠上打孔，下墊濾紙，孔中加入待檢樣品與抗血清混合液，然后將銅網(wǎng)膜漂浮于孔中的免疫反應液滴上，待液滴被濾紙吸下后取出銅網(wǎng)膜、