免疫組織化學(xué)概述與制片優(yōu)秀課件

免疫組織化學(xué)概述與制片第一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日第一章緒論

目錄一、定義和意義二、發(fā)展簡(jiǎn)史三、免疫學(xué)概念四、基本類型與原理五、種類六、基本過(guò)程第二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

一、免疫組織化學(xué)的定義及意義1、定義免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)，又稱免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry)。已知的標(biāo)記抗體（或抗原）原位顯示細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）的方法,進(jìn)行定性、定量、定位檢測(cè)。原理：抗原、抗體特異性結(jié)合

第三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)酶或其他物質(zhì)標(biāo)記抗體抗原-抗體反應(yīng)抗原-抗體復(fù)合物呈色化學(xué)反應(yīng)底物在酶作用下產(chǎn)生有色物質(zhì)2、基本理論組織化學(xué)呈色反應(yīng)顏色（原位）第四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日3、優(yōu)點(diǎn)高特異性高敏感性方法步驟統(tǒng)一形態(tài)、機(jī)能與代謝相結(jié)合,可定性、定位與定量第五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日4、免疫組織化學(xué)的意義（1）腫瘤診療腫瘤組織起源診斷腫瘤分型診斷確定腫瘤的良惡性確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位指導(dǎo)腫瘤的治療、判斷預(yù)后

（2）病原微生物（腫瘤病因）的檢查（3）免疫性疾病的診斷（4）科學(xué)研究第六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日二、發(fā)展簡(jiǎn)史1、1941：COON首次用熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)肺炎雙球菌2、1968：中根一穗建立酶標(biāo)記抗體技術(shù)3、1974年代:sternberger建立PAP技術(shù)4、1975：KoeHler等發(fā)明了單克隆抗體5、1981：許世明建立抗生物素-生物素標(biāo)記抗體技術(shù)（ABC）6、免疫電鏡技術(shù)、雜交-免疫細(xì)胞化學(xué)等7、新發(fā)展：Envision二步法、90年代建立的葡萄球菌A蛋白標(biāo)記法（SPA）第七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

三、免疫學(xué)概念

（一）抗原:

1、定義：刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞,結(jié)合抗體或致敏淋巴細(xì)胞的物質(zhì)。2、抗原的兩種特性：①免疫原性（immunogenicity）：誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。②反應(yīng)原性（antigenicity）：與抗體或致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合的能力。第八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日3、抗原決定族（抗原表位）：特殊的化學(xué)活性基團(tuán)區(qū)域第九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（二）抗體:1、定義:機(jī)體受抗原刺激后，漿細(xì)胞產(chǎn)生的，與相應(yīng)抗原特異性反應(yīng)的球蛋白（免疫球蛋白：Ig）。2、基本結(jié)構(gòu):

一“Y”字型的四肽鏈重鏈(heavychain,H)：兩條、完全相同輕鏈(lightchain,L)：兩條、完全相同二硫鍵：連接四肽鏈。二端:氨基端（可變區(qū)，V區(qū)）羧基端（恒定區(qū)，C區(qū)）第十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（1）可變區(qū)（variableregion,V

）：

Ig分子氨基端，Aa的組成和排列順序有變異，決定了抗體結(jié)合的特異性。

（2）恒定區(qū)（constantregion,C）：

Ig分子的羧基端，Aa組成和排列在同一動(dòng)物種屬中同類抗體比較恒定。具有免疫原性第十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日同一種屬動(dòng)物對(duì)不同抗原產(chǎn)生的同類抗體:V區(qū):不同，C區(qū):相同，免疫原性:相同?？贵w抗抗體（二抗：種屬特異性抗體）免疫第十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

四、基本類型與原理（一）直接法（一步法）原理：第十三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（二）間接法原理：

第十四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）非標(biāo)記抗體酶法1、酶橋法：以第二抗體作橋，任何抗體都未標(biāo)記原理：一抗和三抗來(lái)源于同一種屬動(dòng)物的同類抗體第十五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日2、PAP法（peroxidase–Antiperoxidase,過(guò)氧化物酶－抗過(guò)氧化物酶法）原理：預(yù)先制備PAP復(fù)合物一抗和PAP復(fù)合物中的抗體來(lái)源于同一種屬動(dòng)物的同類抗體第十六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（四）親和素-生物素法親和素-生物素－過(guò)氧化物酶法（AvidinBiotinComplex：ABC法）原理：預(yù)先制備ABC復(fù)合物第十七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日五、分類:按標(biāo)記物的不同免疫熒光組織化學(xué)免疫酶組織化學(xué)親和免疫組織化學(xué)免疫金-銀標(biāo)記技術(shù)免疫雙重和多重組織化學(xué)雜交免疫組織化學(xué)第十八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日六.基本過(guò)程(1)抗原的提取和純化(2)免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合(3)抗體提取與效價(jià)檢測(cè)(4)標(biāo)記抗體(5)細(xì)胞與組織切片標(biāo)本的制備(6)免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)和細(xì)胞化學(xué)顯色(7)觀察和記錄結(jié)果第十九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日第二章組織學(xué)制片技術(shù)一、定義和意義二、方法三、基本程序四、免疫組織化學(xué)石蠟切片制作第二十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日一、定義和意義

（一）概念將機(jī)體的組織、器官做成能在顯微鏡下觀察的標(biāo)本的技術(shù)（二）意義1、是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)等生命科學(xué)研究組織細(xì)胞的正常與病理形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要方法。2、是顯示組織、細(xì)胞中某些化學(xué)成分、基因的定位分布和含量變化的不可缺少的手段。第二十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日二、制片方法（一）非切片法：

1、定義：不經(jīng)切片機(jī)切片手續(xù)制成標(biāo)本的方法。2、類型：①整裝片（胚胎）：雞胚②鋪片（柔軟組織）③涂片（液體）④磨片（骨、牙）⑤印片（淋巴結(jié)）類型：非切片法、切片第二十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日2、類型：根據(jù)所用支持劑（包埋劑）的不同，分為：①石蠟切片②冰凍切片③火棉膠切片法（二）切片法:1、定義：用切片機(jī)(microtome)切成微米厚的薄片，制出標(biāo)本切片的方法第二十三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

三、基本程序切片法2、冰凍切片取材冷凍切片染色封片1、石蠟切片

取材固定脫水透明浸蠟包埋切片染色封片第二十四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（一）取材：從人或動(dòng)物體內(nèi)取下所需組織材料的過(guò)程1、材料來(lái)源（1）人體材料：手術(shù)、活檢、尸檢（2）動(dòng)物材料①來(lái)源廣泛②大多數(shù)動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)與人體相似③有的結(jié)構(gòu)比人類更典型四、免疫組織化學(xué)石蠟切片制作第二十五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（1）麻醉：

①吸入麻醉：將浸有乙醚或氯仿的棉球連同動(dòng)物一起放入密閉容器內(nèi)麻醉。適用對(duì)象：小動(dòng)物缺點(diǎn)：乙醚麻醉：肺部充血、呼吸道分泌物增多

②注射麻醉：靜脈、肌肉或腹腔內(nèi)注射麻醉劑：3%戊巴比妥等適用對(duì)象：較大動(dòng)物缺點(diǎn)：內(nèi)臟淤血2、動(dòng)物的致死方法第二十六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）空氣栓塞：向動(dòng)物靜脈內(nèi)注入一定的空氣

適用對(duì)象：較大動(dòng)物，如兔、犬缺點(diǎn)：血管、內(nèi)臟淤血（3）斷頭：用剪刀剪去動(dòng)物頭部適用對(duì)象：小動(dòng)物，如青蛙、小鼠（4）其他方法：擊頭法、斷髓法、股動(dòng)脈放血法等第二十七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日3、致死原則：（1）選擇合適的致死方法：利于取材和觀察（2）快速致死，避免掙扎4、取材注意事項(xiàng)（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇動(dòng)物的種類：肝臟—豬肝、胃—狗、卵巢—貓

（2）組織材料要新鮮：在心跳未停時(shí)即取材固定。

神經(jīng)系統(tǒng)：10秒鐘變性消化系統(tǒng)上皮：15分鐘自溶亞細(xì)胞：變性更快。第二十八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（5）組織塊大小適宜：結(jié)構(gòu)完整，組織塊：小、薄：1cm×1cm×0.2cm,最厚不能超過(guò)0.5厘米（6）修剪附帶的其他組織（3）選好部位和切面：胃：胃底；胰腺：胰尾部；肺：肺門管性器官:橫切，小腸環(huán)行皺襞:縱切頭皮:順毛根縱切，腎臟:縱切（包括皮質(zhì)和髓質(zhì)）（4）避免損傷組織：避免手拽、有齒鑷子夾、刀剪不鋒利第二十九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（8）保持清潔：尤其是消化管用生理鹽水洗去血液、污物、粘液及食物殘?jiān)?）防止收縮變形骨骼肌、神經(jīng)在離體后：用木刺扎于木板上或?qū)⑵鋬啥擞镁€捆于小棒上第三十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（二）固定

1、概念：用化學(xué)試劑使蛋白質(zhì)凝固或沉淀，保持其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)的過(guò)程。固定劑（液）：用來(lái)固定的化學(xué)試劑。2、目的（1）防止自溶與腐?。?）維持形態(tài)：使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)凝固或沉淀下來(lái)，保存各種抗原成份原有的結(jié)構(gòu)（3）利于切片：增加硬度（4）利于鑒別和觀察：使細(xì)胞內(nèi)成分產(chǎn)生不同的折光率（5）利于染色：媒介作用，使細(xì)胞各部易于受色第三十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日3、固定劑（1）固定劑的必備特性①滲透力強(qiáng)②迅速使組織及細(xì)胞成分凝固或沉淀③不致使組織過(guò)度收縮與膨脹

④能使組織獲得較佳的折光率第三十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）固定劑的種類按作用原理分：

①凝固性：甲醛，重鉻酸鉀②沉淀性：酒精、升汞等

按化學(xué)性質(zhì)分①還原劑：醛類、醇類②氧化劑：鋨酸、重鉻酸鉀③酸類：苦味酸、醋酸第三十三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日①單一固定劑：一種試劑組成只對(duì)細(xì)胞的某種成分固定得較好，不能將所有的成分都保存下來(lái)②混合固定劑：兩種以上的試劑組成

按組成成分第三十四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）常用單一固定劑的性質(zhì)及用法名稱福爾馬林（甲醛）性質(zhì)概要1、無(wú)色、刺激味的液體。還原劑，凝固蛋白質(zhì)。2、保存脂類、糖，線粒體及高爾基體的固定劑。3、硬化劑，冰凍切片的優(yōu)良固定劑。對(duì)染色的影響固定后的處理硬化程度其他常用的單純固定劑，對(duì)細(xì)胞的保存好。甲醛能與任何比例的水、醇及乙醚混合。滲透速度及小塊組織（2mm3）固定時(shí)間較快4~12小時(shí)適度可入70%酒精或水沖洗對(duì)蘇木素著色好，對(duì)伊紅著色困難。收縮與膨脹情況收縮較小，脫水會(huì)使收縮變大。第三十五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日名稱性質(zhì)概要對(duì)染色的影響固定后的處理硬化程度其他滲透速度及小塊組織（2mm3）固定時(shí)間重鉻酸鉀1、橙紅色結(jié)晶體，有毒、氧化力極強(qiáng)，能溶于水，不溶于醇，凝固蛋白質(zhì)2、保存類脂體，線粒體的固定劑，溶解染色質(zhì)。較快，24小時(shí)在切片技術(shù)中是良好的藥品收縮與膨脹情況起初收縮不顯著，組織經(jīng)酒精脫水會(huì)繼續(xù)收縮中等用水沖洗對(duì)酸性染料著色很好第三十六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）混合固定劑的優(yōu)點(diǎn)及配制原則

優(yōu)點(diǎn)：取長(zhǎng)補(bǔ)短原則：相互彌補(bǔ)快+慢脹+縮(5)常用混合固定劑①A、F液（酒精+甲醛）組成：無(wú)水酒精90毫升，40%甲醛10毫升特點(diǎn)：簡(jiǎn)單、皮下組織鋪片、肥大細(xì)胞固定好、對(duì)彈性纖維、膠原纖維染色好第三十七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日③Carnoy液組成：冰醋酸1份，氯仿3份，無(wú)水酒精6份特點(diǎn)：快、用于糖原、神經(jīng)細(xì)胞尼氏體、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA固定。

②Bouin液

組成：飽和苦味酸水溶液，40%甲醛，冰醋酸。（15：5：1）特點(diǎn)：常用，固定時(shí)間12~24小時(shí)，適用于大多數(shù)組織，以細(xì)胞核、細(xì)胞分裂為好，對(duì)腎臟固定不好?，F(xiàn)配現(xiàn)用第三十八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日④Zenker′S液組成：重鉻酸鉀2.5克，升汞5克，蒸餾水100毫升貯備液：棕色瓶保存，臨用前加冰醋酸5毫升。特點(diǎn)：常用，固定時(shí)間12~24小時(shí)，水沖洗，加碘去汞，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色好。第三十九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（5）固定的方法①灌注法：經(jīng)血管途徑將固定液灌注到所需要固定的器官（超微結(jié)構(gòu)）類型：心插管固定；股動(dòng)脈插管灌注②浸泡法：組織直接浸泡在固定液中。固定液的量：足夠、組織塊大小的15~30倍，瓶底墊紗布③微波固定：固定的組織收縮?、苷羝潭ǎ罕苊饪扇苄猿煞衷诠潭ㄒ褐衼G失，對(duì)人危害大第四十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（6）組織固定后的變化①體積改變：脹或縮酒精、升汞、苦味酸——縮小重鉻酸鉀、醋酸——膨脹②硬度增加：酒精、甲醛——增加多鋨酸、苦味酸——增加較少③抗張力增加④折光率增加⑤著色性增加第四十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（7）固定注意事項(xiàng)④標(biāo)本大小適宜：組織塊體積：1cm×1cm×0.2cm⑤標(biāo)本固定要及時(shí)⑥最好在低溫下固定①固定液的選擇要合理②固定液配制要新鮮(除貯存液外，要現(xiàn)配現(xiàn)用）③固定液的量要足夠：組織塊大小的15~30倍，瓶底墊紗布。⑦固定時(shí)間適當(dāng)：避免太長(zhǎng)、太短。⑧固定后要徹底沖洗第四十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）洗滌和脫水1、洗滌

（1）目的

去除固定液，終止固定作用，去除固定劑的重金屬離子或顆粒（2）原則①什么配的固定劑就用什么洗（苦味酸固定的，用低濃度乙醇洗），固定劑為酒精或酒精混合液可不洗第四十三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日②洗滌時(shí)≧固定時(shí)

③特殊成分加特殊洗滌劑：脫黃（70%乙醇），碘酊脫貢（固定液含升汞的），硫代硫酸鈉脫碘2、脫水

（1）概念：用化學(xué)試劑將標(biāo)本中的水置換出來(lái)的過(guò)程

（2）目的：

①利于浸蠟（水不能與石蠟等包埋劑混合）②利于組織的永久保存（水使組織分解）第四十四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）脫水劑

脫水劑的特性與水任意混合，也能與透明劑混合的液體脫水劑的類型①單純脫水劑如：酒精、丙酮等②脫水兼透明的脫水劑如：正丁醇等最常用：酒精，缺點(diǎn)：組織硬化和變脆（尤其是高濃度酒精）。

第四十五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）酒精脫水

原則：循序漸進(jìn)，酒精濃度逐步增大一般為70%80%90%95%100%柔軟組織、胚胎組織:30%開(kāi)始暫不包埋的組織:70%~80%的酒精保存更換乙醇:吸水紙吸去組織塊表面的水脫水時(shí)間：組織種類、體積大小而定(一般6~24小時(shí)）第四十六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（四）透明2、目的：便于浸蠟包埋1、定義：用一種既可與脫水劑相容又能和石蠟相容的物質(zhì)置換脫水劑，組織塊呈現(xiàn)透明狀態(tài)。3、透明劑：透明所用的藥劑透明劑：苯、甲苯、二甲苯、香柏油、丁香油等常用：二甲苯、香柏油第四十七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（1）二甲苯①優(yōu)點(diǎn)：透明力強(qiáng)，作用快。②缺點(diǎn)：容易使組織收縮、變硬、變脆。③注意：先經(jīng)1/2純酒精+1/2二甲苯混合液過(guò)度，再進(jìn)二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ（可通過(guò)肉眼觀察來(lái)決定時(shí)間）。透明過(guò)度,組織變脆,切片時(shí)易破碎第四十八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）香柏油優(yōu)點(diǎn)：組織收縮及硬化小缺點(diǎn)：慢，12小時(shí)以上；香柏油透明后需浸二甲苯（因不易被石蠟取代）問(wèn)題：如果組織塊在透明時(shí)，呈白色渾濁不透明狀態(tài)，是何原因？答：脫水不徹底所致。第四十九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（五）浸蠟與包埋

浸蠟：支持劑石蠟透入組織內(nèi)部，置換透明劑的過(guò)程。1、浸蠟?zāi)康闹脫Q透明劑，將軟組織變?yōu)橄瀴K，以便切片。第五十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日軟蠟Ⅰ軟蠟Ⅱ硬蠟Ⅰ硬蠟Ⅱ30～40分鐘30～40分鐘20～30分鐘20～30分鐘2、浸蠟過(guò)程軟蠟硬蠟第五十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日3、浸蠟注意點(diǎn)①選用適當(dāng)熔點(diǎn)的蠟：南方硬蠟，北方軟蠟冬軟，夏硬②充分透入要使石蠟完全滲入細(xì)胞的每個(gè)部分③浸蠟時(shí)間不能太長(zhǎng)，烤箱溫度不可太高，否則組織收縮變脆。第五十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日4、包埋：浸透石蠟的組織塊入新的石蠟中冷卻凝固。包埋：硬蠟（1）包埋劑石蠟：最常用，類型（熔點(diǎn)不同）：軟蠟和硬蠟。軟蠟：熔點(diǎn)＜50℃，硬蠟：熔點(diǎn)＞50℃第五十三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）材料：L形金屬包埋框，玻璃底版、酒精燈、小鑷子（3）包埋中注意要點(diǎn)①小尖鑷不時(shí)烤熱②標(biāo)本切面方向朝下，標(biāo)本間要有一定的距離③動(dòng)作快④快速冷卻：石蠟表面凝固，立即放入冷水中第五十四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）包埋后可能出現(xiàn)的問(wèn)題①組織內(nèi)空泡：脫水或透明或浸蠟不夠。②組織外空泡：包埋動(dòng)作太慢。

有空泡第五十五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（5）標(biāo)本分塊修切蠟塊：正面：正方形或長(zhǎng)方形，兩邊兩兩平行。標(biāo)本四周:1-2mm寬的石蠟側(cè)面：梯形第五十六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日1、切片前玻片的處理清潔液泡12～24h自來(lái)水沖洗蒸餾水洗95％酒精浸泡2h烤干防脫片處理（多聚賴氨酸)（六）切片第五十七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日2、切片機(jī)分類①輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（本室常用）刀固定，材料前進(jìn)，主要用于石蠟切片主要構(gòu)造①載物臺(tái)②持刀架③切片厚度調(diào)整器②推拉式切片機(jī)

材料固定，刀移動(dòng)主要用于火棉膠切片第五十八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（2）切片注意事項(xiàng)：

①刀片:鋒利，切片機(jī)的螺絲:旋緊。

②組織塊的切面和切片刀間的夾角:5℃。

③切片速度:均勻

④石蠟切片正面朝上放（與刀片接觸的面為反面）第五十九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）石蠟切片中常遇的問(wèn)題及解決辦法蠟帶變彎刀鋒銳不一致，蠟塊四方不對(duì)稱，蠟塊與刀口不平行。移動(dòng)刀口位置，修整蠟塊，調(diào)整刀或蠟塊。蠟帶上卷刀不利，斜度大，蠟片太厚，蠟邊留太少，硬度過(guò)大，室溫過(guò)低。磨刀，調(diào)刀角度，調(diào)片厚度，重包，加溫。蠟片起皺刀不利，斜度過(guò)小，刀口不潔，蠟太軟，室溫過(guò)高。磨刀，調(diào)刀角度，二甲苯擦，冰凍，降溫。蠟片有裂痕或劃破刀有缺口，蠟中有氣泡或沙粒。移動(dòng)刀口位置，包埋前去氣，濾蠟問(wèn)題原因解決第六十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日組織與蠟分離脫水、透明、浸蠟不夠。退回，選擇適當(dāng)時(shí)間。蠟片厚薄不一推進(jìn)裝置失靈，夾具松動(dòng)，蠟塊過(guò)大。修理切片機(jī)，上緊夾具，取材宜小。問(wèn)題原因解決切片脆爛高濃度酒精，透明,浸蠟太久，蠟溫過(guò)高。無(wú)法彌補(bǔ)，控制蠟溫和浸蠟時(shí)間

。第六十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）石蠟切片的詳細(xì)過(guò)程詳細(xì)過(guò)程

步驟本室參考時(shí)間取材

固定24小時(shí)左右洗滌等于固定時(shí)第六十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日脫水：70%酒精6~12小時(shí)

80%酒精4~8小時(shí)95%酒精Ⅰ2~4小時(shí)95%酒精Ⅱ2~4小時(shí)100%酒精Ⅰ1~2小時(shí)100%酒精Ⅱ1~2小時(shí)1/2

純酒精+1/2二甲苯20~30分鐘第六十三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日透明：二甲苯Ⅰ15~30分鐘

二甲苯Ⅱ15~30分鐘浸蠟：軟蠟30~45分鐘硬蠟30~45分鐘包埋

切片

貼片（溫水撈片）烤片（370C過(guò)夜）第六十四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（七）脫蠟和水合:脫蠟:二甲苯脫去石蠟切片的蠟，兩次水合（水化、下行入水）：酒精濃度：逐步降底100%酒精→95%酒精→80%酒精→蒸餾水第六十五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（八）抗原修復(fù)1、原因：甲醛使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固，分子間會(huì)發(fā)生交聯(lián)2、目的：抗原再現(xiàn)

3、方法：酶消化、熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)

（1）熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)：

①定義：高溫、高壓對(duì)石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)或復(fù)原。②修復(fù)方式：a微波b煮沸c高壓鍋。第六十六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（2）酶消化：

①去除覆蓋于抗原決定簇表面的雜蛋白

②斷交聯(lián)蛋白酶的種類

0.05%～0.1％胰蛋白酶：細(xì)胞內(nèi)抗原

0.4%胃蛋白酶：細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)抗原第六十七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（九）封閉原因:蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上解決辦法:

滴加第二抗體來(lái)源動(dòng)物之非免疫血清

抗體稀釋液中加入牛血清白蛋白第六十八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日1、滴加抗體：抗體濃度要合適的2、溫育時(shí)間:370C,30~60分鐘,濕盒中；40C,過(guò)夜，呈色（十）免疫染色第六十九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日

（十一）復(fù)染

（1）目的：將機(jī)體組織細(xì)胞染上顏色，襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

（2）部位：染細(xì)胞核

（3）復(fù)染劑：蘇木素、甲基綠、核固紅

第七十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（4）染料（復(fù)染劑）的特性①有顏色②與被染組織有親和力發(fā)色團(tuán)：產(chǎn)生顏色的原子團(tuán)助色團(tuán)：使染料對(duì)組織有親和力的原子團(tuán)。發(fā)色團(tuán)：硝基、亞硝基、偶氮基、羰基、烯基、醌型苯環(huán)發(fā)色團(tuán)多的染料，顏色深第七十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日助色團(tuán)：—OH、—COOH、—NH2、—NCH3CH3有色物：只有顏色，無(wú)親和力第七十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日③染料的分類

根據(jù)來(lái)源分類天然：蘇木素（植物），胭脂紅（動(dòng)物胭脂蟲(chóng)）人工合成：苦味酸，偶氮染料

根據(jù)化學(xué)反應(yīng)分酸性染料堿性染料第七十三頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日※酸性染料：酸性助色團(tuán)（—COOH，—SO3H等），帶負(fù)電荷。伊紅※堿性染料：堿性助色團(tuán)（—NH2、—NCH3等），帶正電荷。美蘭、蘇木素※中性染料：酸性、堿性助色團(tuán)。瑞氏粉、姬姆薩第七十四頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)染色對(duì)象分①胞核染料：蘇木素，胭脂紅②胞漿染料：伊紅、苦味酸③脂肪染料：蘇丹Ⅲ、Ⅳ，油紅O第七十五頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（5）染色原理物理和化學(xué)綜合作用

物理作用：①滲透作用：不牢固②吸附作用：分子引力作用，色素粒子被吸附③吸收作用：牢固第七十六頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)作用細(xì)胞主要成分：蛋白質(zhì)含—NH2與酸性染料（帶負(fù)電荷）—COOH與堿性染料（帶正電荷）（堿性）（酸性）細(xì)胞核（酸性物質(zhì)多）：與堿性染料親和力強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)（堿性物質(zhì)多）：與酸性染料親和力強(qiáng)第七十七頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（十二）分化與封藏1、分化（分色）概念：把過(guò)染的部分褪至適當(dāng)?shù)某潭?，去掉不?yīng)著色的顏色。對(duì)蘇木素染色的組織分色:用0.5~1%的鹽酸酒精。分化劑（脫色劑）:脫去切片上過(guò)染的顏色的試劑以酸褪堿性染料，以堿褪酸性染料（含堿的自來(lái)水）第七十八頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日2、封藏（固）（1）目的防止退色、受潮、干裂及磨損等，使切片永久保存（2）常用封藏（固）劑①干性（常用）：保存時(shí)間長(zhǎng)，封固前：須脫水、透明中性樹(shù)膠（液態(tài)或固態(tài)）便宜加拿大樹(shù)膠（固態(tài)）較貴香柏油凝固太慢第七十九頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日②水性：甘油：液態(tài)，圖象清晰度不佳甘油明膠：固態(tài)，凝固性不需脫水、透明，保存時(shí)間短第八十頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（3）封固注意事項(xiàng)：①樹(shù)膠不能攪拌②樹(shù)膠量要合適③標(biāo)本表面二甲苯不能揮發(fā)干④蓋玻片大小適宜：標(biāo)本周圍留2mm空白⑤封片時(shí)都避免產(chǎn)生氣泡第八十一頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日（十三）免疫組化結(jié)果的觀察和記錄1、結(jié)果判斷:

陽(yáng)性細(xì)胞的染色特征(1)陽(yáng)性細(xì)胞染色部位:胞漿;胞核;胞膜。胞漿：多(3)陽(yáng)性細(xì)胞分布：局灶性和彌漫性(2)不同陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度：不一。非特異染色：所有的細(xì)胞染色強(qiáng)度相同(4)陽(yáng)性染色細(xì)胞與陰性細(xì)胞：相互夾雜分布;非特異染色：累及一片細(xì)胞(5)切片邊緣、刀痕或皺褶區(qū)域、擠壓的細(xì)胞以及結(jié)締組織：假陽(yáng)性第八十二頁(yè)，共八十九頁(yè)，2022年，8月28日2、對(duì)照(1)陽(yáng)性對(duì)照:用已知抗原陽(yáng)性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫染色,對(duì)照切片：陽(yáng)性(2)陰性對(duì)照:用已知抗原陰性的切片與待檢標(biāo)