免疫學技術概論

免疫學技術概論第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日[目的與要求]1、了解最新的免疫學診斷技術以及細胞免疫技術的種類與用途；

2、掌握常用的免疫血清學技術及其實驗原理、影響因素；

3、掌握生物技術公司常用的免疫制備技術；

4、了解免疫學技術的應用及其發(fā)展趨向。[難點與重點]

重點：常用的免疫血清學技術及其實驗原理、影響因素；生物技術公司常用的免疫制備技術。難點：常用的免疫血清學技術及其實驗原理、影響因素。第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日

免疫學技術是指利用免疫反應的特異性原理，建立各種檢測與分析技術以及建立這些技術的各種制備方法，包括：①用于抗原或抗體檢測的體外免疫反應技術，或稱免疫檢測技術，這類技術一般都需要血清進行試驗，故又稱為免疫血清學反應或免疫血清學技術；②用于研究機體細胞免疫功能與狀態(tài)的細胞免疫技術；③用于建立免疫檢測方法的免疫制備技術，如抗體或抗原的純化技術、抗體的標記技術。第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日E-玫瑰花環(huán)實驗正常人外周血中T細胞在體外能直接和綿羊紅細胞(SRBC)結合形成玫瑰花樣細胞團。這是因為人的T細胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相結合的受體，稱為E受體。已證實E受體是人T細胞所特有的表面標志，因此本試驗可作為人外周血T細胞的鑒定和計數(shù)，同時作為人細胞免疫功能狀態(tài)的一個檢測指標，也是分離T細胞的常用方法之一。免疫標記技術第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日第1節(jié)免疫血清學技術概述

抗原與相應抗體在體內和體外均能發(fā)生特異性結合反應，因抗體主要來自血清，因此在體外進行的抗原抗體反應稱為血清學反應或免疫血清學技術，是建立在抗原抗體特異性反應基礎上的檢測技術。免疫血清學技術自19世紀建立了最早和最簡單的凝集試驗開始，不斷發(fā)展，尤其是近20余年來，各種新方法、新技術層出不窮，應用面也日益擴大，已深入到生物學科的各個研究領域。第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日

免疫血清學技術按抗原抗體反應性質不同可分為凝聚性反應(包括凝集試驗和沉淀試驗)、標記抗體技術(包括熒光抗體、酶標抗體、放射性同位素標記抗體、化學發(fā)光標記抗體技術等)、有補體參與的反應(補體結合試驗、免疫黏附血凝試驗等)、中和反應(病毒中和試驗等)等已普遍應用的技術，以及免疫復合物散射反應(激光散射免疫測定)、電免疫反應(免疫傳感器技術)、免疫轉印(westernb1otting)以及建立在抗原抗體反應基礎上的免疫蛋白芯片技術等新技術。一、免疫血清學技術的類型第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日凝集試驗（血球凝集）凝集試驗（細菌凝集）補體結合試驗抗原-抗體反應模式圖第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日凝集反應沉淀反應對流免疫電泳火箭免疫電泳第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、免疫血清學反應的一般特點(一)特異性與交叉性血清學反應具有高度特異性。這是血清學試驗用于分析各種抗原和進行疾病診斷的基礎。一般血緣越近，交叉反應的程度也越高。除相互交叉反應外，也有表現(xiàn)為單向交叉的，單向交叉在選擇疫苗用菌(毒)株時有重要意義。天花牛痘第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日(二)抗原與抗體結合機理

抗原和抗體的結合為弱能量的非共價鍵結合，其結合力決定于抗體的抗原結合位點與抗原表位之間形成的非共價鍵的數(shù)量、性質和距離，由此可分為高親和力、中親和力和低親和力抗體。

第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日(二)抗原與抗體結合機理

抗原與抗體的結合是分子表面的結合，這一過程受物理、化學、熱力學的法則所制約，結合的溫度應在0～40℃，pH在4～9。如溫度超過60℃或pH降到3以下時，則抗原抗體復合物又可重新解離。利用抗原抗體既能特異性地結合，又能在一定條件下重新分離這一特性，可進行免疫親和層析，以制備免疫純的抗原或抗體。第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日

抗原與抗體在適宜的條件下就能發(fā)生結合反應。但對于常規(guī)的血清學反應，如凝集反應、沉淀反應、補體結合反應等，只有在抗原與抗體呈適當比例時，結合反應才出現(xiàn)凝集、沉淀等可見反應結果，在最適比例時，反應最明顯。這種因抗原過多或抗體過多而出現(xiàn)抑制可見反應的現(xiàn)象，稱為帶(zone)現(xiàn)象。

(二)抗原與抗體結合機理

第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日

為了克服帶現(xiàn)象，在進行血清學反應時，需將抗原和抗體作適當稀釋，通常是固定一種成分而稀釋另一種成分。為了選擇抗原和抗體的最適用量，也可同時遞進稀釋抗原和抗體，用綜合變量法進行方陣測定。(二)抗原與抗體結合機理

第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日(三)免疫血清學反應的影響因素影響免疫血清學反應的因素主要有電解質、溫度、pH值等。1、電解質特異性的抗原和抗體具有對應的極性基(羧基、氨基等)，它們互相吸附后，其電荷和極性被中和因而失去親水性，變?yōu)樵魉到y(tǒng)。此時易受電解質的作用失去電荷而互相凝聚、發(fā)生凝集或沉淀反應。因此，需在適當濃度的電解質參與下，才出現(xiàn)可見反應。故血清學反應一般用生理鹽水作稀釋液，標記抗體技術中，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)作稀釋液。第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日2、溫度在一定溫度下，將抗原抗體保溫一定時間，可促使兩個階段的反應。較高的溫度可以增加抗原和抗體接觸的機會，從而加速反應的出現(xiàn)。將抗原、抗體反應通常在37℃(培養(yǎng)箱或水浴)，也可在室溫下進行；亦可用56℃水浴反應更快。有的抗原或抗體系統(tǒng)在低溫長時間結合反應更充分，如有的補體結合反應在冰箱低溫結合效果更好。(三)免疫血清學反應的影響因素影響免疫血清學反應的因素主要有電解質、溫度、pH值等。第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日3、酸堿度血清學反應常用pH為6～8，過高或過低的pH值可使抗原抗體復合物重新離解。如pH值降至抗原或抗體的等電點時，可引起非特異性的酸凝集，造成假象，出現(xiàn)假陽性。(三)免疫血清學反應的影響因素影響免疫血清學反應的因素主要有電解質、溫度、pH值等。第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第2節(jié)細胞免疫技術的種類與用途細胞免疫技術是指與細胞免疫有關的各種檢測技術，包括對其免疫細胞、細胞因子的檢測及功能分析。由于人們越來越認識到細胞免疫在腫瘤、胞內菌感染、病毒感染等疾病免疫中的重要性，使近幾年來細胞免疫技術在醫(yī)學和獸醫(yī)學研究與臨床中應用越來越廣。

第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日第2節(jié)細胞免疫技術的種類與用途

根據(jù)被檢測的物質性質不同，可將細胞免疫技術分為淋巴細胞計數(shù)及分類技術、淋巴細胞功能測定技術和細胞因子檢測技術以及體內細胞免疫試驗等4大類。CIK是(cytokineinducedkiller)的縮寫，最初是指在正常人體外周血中只占1～5%的cd3+cd56+的T淋巴細胞?目前國內外制備的用于過繼免疫治療的cik細胞，實際上是體外擴增出的以cd3+cd56+?cd3+cd8+為主的異質性細胞群。該細胞群是在多種細胞因子如IL-2?IFN-γ及某些單克隆抗體(anti-cd3mcab)的刺激下，由從外周血?骨髓或臍血中分離出來的單個核細胞在體外培養(yǎng)擴增而成，具有廣泛的非MHC限制的極強的溶瘤活性?第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日第2節(jié)細胞免疫技術的種類與用途

根據(jù)被檢測的物質性質不同，可將細胞免疫技術分為淋巴細胞計數(shù)及分類技術、淋巴細胞功能測定技術和細胞因子檢測技術以及體內細胞免疫試驗等4大類。生物治療技術是一種“自身免疫細胞療法”，它用“人體自身的免疫細胞殺死自己體內的腫瘤細胞”的原理來治療腫瘤，是最具優(yōu)勢、最有前景的腫瘤治療技術之一。通過提取患者自身外周血中的單個核細胞，在GMP超潔凈實驗室中進行誘導，激活和數(shù)量擴增成樹突狀細胞（DC）和細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK），然后再回輸給病人。這兩種細胞對腫瘤細胞有特異性識別作用，能夠廣泛識別各種腫瘤細胞。當DC與CIK細胞聯(lián)合作用將殘留惡性腫瘤細胞完全殺滅或降低并穩(wěn)定在一定水平時，即可達到腫瘤的臨床治療或控制腫瘤的復發(fā)和轉移。第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日

該技術有效修復、增強了人體的免疫系統(tǒng)，減少了腫瘤細胞轉移的幾率，無痛苦，無副作用，對于手術結束后或放療緩解期患者尤為適合。對于部分乙肝患者也可采用該方法治療

生物免疫治療大致分為五個主要步驟，首先是前期檢查，第二是采集外周血中的單個核細胞，第三步就是細胞在實驗室的激活、誘導與質控，第四步是回輸?shù)诙?，共四十八頁?022年，8月28日CIK細胞的特點1、增殖能力強，主要效用細胞CD3+CD56+可增殖1000倍；2、殺傷活力強，遠優(yōu)于傳統(tǒng)的LAK細胞和細胞因子γ干擾素、白細胞介素2等；3、殺瘤譜廣，不受MHC限制，具有廣譜殺腫瘤和病毒的作用，對多重耐藥腫瘤細胞仍敏感，殺瘤活性不受環(huán)孢素A（CsA）和FK506等免疫抑制劑的影響，能抵抗腫瘤細胞引發(fā)的效應細胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，無嚴重不良反應。不過長度超過30bp的dsRNA會由于干擾素α應答引發(fā)非特異性基因抑制。第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日CIK細胞治療技術的優(yōu)勢1、可有清除手術、放化療后殘余的癌細胞及微小病灶，預防腫瘤的復發(fā)和轉移；2、可與放、化療聯(lián)合使用，能降低放化療的毒副作用的感染率，提高放化療的療效；3、可用于放、化療無效的患者，或對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的患者的治療；第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日CIK細胞治療技術的優(yōu)勢4、對于失去手術機會或已復發(fā)轉移的晚期腫瘤患者，能迅速緩解其臨床癥狀，延長生存期；大部分患者出現(xiàn)瘤體減小甚至消失或長期帶瘤生存的治療效果；5、由于CIK細胞具有免疫調節(jié)和體細胞修復作用，在治療腫瘤的同時，大部分患者尤其是放化療后的患者，可出現(xiàn)消化道癥狀減輕或消失，皮膚有光澤，黑斑淡化，靜脈曲張消失，脫發(fā)停止甚至頭發(fā)生長或白發(fā)變黑等“年輕化”表現(xiàn)，及精神狀態(tài)或體力明顯恢復等現(xiàn)象，從而提高腫瘤患者的生存質量，延長生存期。第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日激光共聚焦顯微鏡第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日

細胞免疫技術的特點：（1）方法復雜，根據(jù)不同檢測對象需采用不同的方法，這也是細胞免疫技術發(fā)展不快的原因；（2）目前逐漸發(fā)展用血清學方法檢測細胞免疫，如用單克隆抗體檢測CD抗原進行T細胞亞群分析，血清學反應測定白細胞介素和干擾素等，即細胞免疫技術與血清學技術融為一體。

第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日

細胞免疫技術的特點：此外，近年來各種先進的檢測儀器應用于細胞免疫技術，如流式細胞儀(flowcytometer)、激光共聚焦顯微鏡等，使免疫細胞表面分子的檢測、定位及其功能的研究有了較大的發(fā)展。第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日第3節(jié)免疫制備技術的種類

免疫制備技術是指制備與免疫檢測有關制劑的各種技術，包括抗原制備、抗體制備、抗體純化及抗體標記等技術。第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第4節(jié)免疫學技術的應用一、動物疫病診斷用免疫血清學方法對動物傳染病、寄生蟲病等進行診斷，是免疫學技術最突出的應用。應用免疫血清學技術可以檢測病原微生物抗原或抗體，其中酶標抗體技術，已成為動物多種傳染病的常規(guī)診斷方法，其簡便、快速，又具有高度的敏感性、特異性和可重復性，已有許多商品化的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)診斷試劑盒。第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、動植物生理活動研究動物、植物體中存在一些活性物質，如激素、維生素等，它們在體內含量極微少，但在調節(jié)機體的生理活動中起重要作用，因此可通過分析測定這些生物活性物質的含量及變化來研究機體的各種生理功能(如生長、生殖等)。由于這些物質含量極低，用常規(guī)檢測方法不能準確測出。第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、動植物生理活動研究目前放射免疫測定和酶免疫技術已能精確測出ng(10-9g)及pg(10-12g)級水平的物質，它們已成為測定動物、植物、以及昆蟲體內微量激素及其他活性物質、植物生理和生物防治的重要技術手段。第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日三、物種及微生物鑒定各種生物之間的差異都可表現(xiàn)在抗原性的不同，物種種源越遠，抗原性差異越大，因此可用區(qū)分抗原性的血清學反應進行物種鑒定與物種的分類等工作。血清學反應在細菌、病毒等微生物鑒定和血清型及亞型的分析方面已得到廣泛應用。但在動物種源、植物和昆蟲分類方面還是一個新領域。第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日四、動植物性狀的免疫標記通過分析動物、植物一些優(yōu)良性狀(如高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆性等)的特異性抗原，然后用血清學方法進行標記選擇育種，是一個很有前途的方向，它比分子遺傳標記選擇育種簡便。第四十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日五、生物制品研究生物制品(如疫苗、診斷制品、免疫增強劑等)的研究與開發(fā)，免疫學技術是必不可少的支撐技術。疫苗研究中需用血清學技術和細胞免疫技術作為免疫效力的評價手段。在研究一些免疫增強藥物，尤其研究抗腫瘤藥物時，需用細胞免疫技術分析測定它們對機體細胞免疫功能的增強作用。第四十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日六、動物疫病致病機理研究動物傳染病的病原從機體特定部位感染，并在特定組織細胞內增殖，引起致病。采用免疫熒光抗體染色