克隆基因的表達(dá)與產(chǎn)物純化外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)

克隆基因的表達(dá)與產(chǎn)物純化外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)第一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等。真核或病毒啟動(dòng)子MCSPolyA信號(hào)終止子外源基因第二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日CONTENTS一、酵母基因工程二、昆蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)四、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)三、外源基因在植物中表達(dá)第三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日一、酵母基因工程酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征酵母菌的宿主系統(tǒng)酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母菌）、半知菌類(lèi)（半知酵母菌），共由56個(gè)屬和500多個(gè)種組成。如果說(shuō)大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。A酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征酵母菌的分類(lèi)學(xué)特征第五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物第六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日B酵母菌的宿主系統(tǒng)廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴(lài)型蛋白降解作用的突變宿主菌第七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）

畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）

其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。第八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類(lèi)型突變類(lèi)型生物效應(yīng)作用位點(diǎn)Ssc1改善重組蛋白分泌鈣離子依賴(lài)型的ATP酶ssc2

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄后加工rgr1提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平ose1

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平Ssc11改善重組蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平第九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日抑制超糖基化作用的突變宿主菌

許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。突變類(lèi)型生物效應(yīng)mnn

甘露糖生物合成缺陷型alg

天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型Och

外側(cè)糖鏈添加缺陷型能抑制超糖基化的突變類(lèi)型第十頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日C酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌中的野生型質(zhì)粒酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建第十一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌中的野生型質(zhì)粒釀酒酵母中的2μ環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2μ雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個(gè)。含有自主復(fù)制起始區(qū)（ori）和STB區(qū)，STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定。

2μplasmid：從酵母菌天然的質(zhì)粒上截取一段包含復(fù)制序列的2μDNA。

其特點(diǎn)是非常穩(wěn)定，可確保細(xì)胞分裂時(shí)，質(zhì)粒的性狀可移交到子代中不會(huì)遺失。

而且是high-copynumber的質(zhì)粒。第十二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌中的野生型質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中的線(xiàn)狀質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同的雙鏈線(xiàn)狀質(zhì)粒pGKL1和pGKL1

拷貝數(shù)為50-100個(gè)，分別攜帶K1K2兩種能使多種酵母菌致死的毒素蛋白編碼基因（αβγ），同時(shí)含有毒素蛋白抗性基因。第十三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建ARSplasmid：從酵母菌的染色體中截取一段ARSelement，

ARS是表示Autonomouslyreplicatingsequence。

ARS-containingplasmid的穩(wěn)定性較差，質(zhì)粒常被分解而無(wú)法代代相傳。

但是若加入一段centromere(CEN)sequence(稱(chēng)CENplasmid)，就可使質(zhì)粒穩(wěn)定性提高。

但是其copynumber較低，一般只有singlecopy。

第十四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，，染色體上每30-40kb就有一個(gè)ARS元件。酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括復(fù)制子、標(biāo)記基因、提供克隆位點(diǎn)的大腸桿菌質(zhì)粒DNA。以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱(chēng)為YRp

以2μ質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱(chēng)為YEp上述兩類(lèi)質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè)，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。第十五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列將CEN

DNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱(chēng)為YCp

（酵母著絲粒質(zhì)粒）YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1-5個(gè)第十六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來(lái)的質(zhì)粒稱(chēng)為Yip。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。第十七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日D酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化程序轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因第十八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。但該程序操作周期長(zhǎng)，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25-33%第十九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌的轉(zhuǎn)化程序堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線(xiàn)型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極為罕見(jiàn)第二十頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過(guò)程中應(yīng)避免使用PEG，它對(duì)受電擊的細(xì)胞具有較很大的負(fù)作用。電擊轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)是不依賴(lài)于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105

/μgDNA。第二十一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)單雙鏈DNA均可轉(zhuǎn)化酵母菌，但單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，能高效地同源整合入染色體這對(duì)于體內(nèi)定點(diǎn)突變酵母基因組極為有利克隆在YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因，如果含有受體細(xì)胞的染色體DNA的同源序列，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%第二十二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類(lèi)營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA尿嘧啶等

但對(duì)于多倍體酵母來(lái)說(shuō)，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的受體非常困難第二十三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因顯性標(biāo)記基因顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物只要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型aph氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418cat氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素Dhfr二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺Cup1銅離子螯合物耐受銅離子suc2蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑第二十四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日E酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)酵母菌啟動(dòng)子的可控性外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇第二十五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌啟動(dòng)子的可控性溫度控制型啟動(dòng)子pho4TS-PHO5啟動(dòng)子：

釀酒酵母PHO5啟動(dòng)子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時(shí)才能打開(kāi)PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動(dòng)子的正調(diào)控因子PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35℃時(shí)失活因此，裝在pho4TS-PHO5啟動(dòng)子下游的外源基因在35℃時(shí)關(guān)閉23℃誘導(dǎo)表達(dá)第二十六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日酵母菌啟動(dòng)子的可控性超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子釀酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和GAL10基因編碼半乳糖誘導(dǎo)效果不明顯，基因基底水平表達(dá)第二十七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性

在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%

以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的第二十八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日

酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH

、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問(wèn)題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)彌補(bǔ)。第二十九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日

酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無(wú)選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。第三十頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日

酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長(zhǎng)迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。第三十一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日

酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)多型漢遜酵母也是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列HARS已被用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細(xì)胞有絲分裂時(shí)顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。第三十二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日F利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有200萬(wàn)病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒(méi)有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。第三十三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母第三十四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒。顆粒呈球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化結(jié)構(gòu)和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。第三十五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因第三十六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來(lái)的。雖然這種質(zhì)膜來(lái)源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。第三十七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母20世紀(jì)80年代開(kāi)始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的1%-2%。進(jìn)一步的研究表明，M多肽和L多肽對(duì)S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì)S抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。第三十八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日

產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建第三十九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日

產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母重組巴斯德畢赤酵母的性能由于巴斯德畢赤酵母染色體DNA上還擁有第二個(gè)乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重組菌仍能在含有甲醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。重組菌首先在含有甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待甘油耗盡后，加入甲醇誘導(dǎo)HBsAg表達(dá)，最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的3%

。在大規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬(wàn)份乙肝疫苗。第四十頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日二、昆蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1.桿狀病毒（Baculovirus）廣泛侵染包括許多昆蟲(chóng)在內(nèi)的無(wú)脊椎動(dòng)物。（1）侵染周期：第四十一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第四十二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）桿狀病毒的表達(dá)特點(diǎn)①感染后36-48h，病毒開(kāi)始合成大量的多角蛋白。②多角蛋白的啟動(dòng)子特別強(qiáng)。③多角蛋白基因可以被替換掉而不影響病毒的繁殖。第四十三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化過(guò)程①轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因②轉(zhuǎn)移載體與野生型AcMNPVDNA共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞③轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換④外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中⑤重組病毒侵染宿主4-5天后即可收獲重組蛋白。第四十四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第四十五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第四十六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日2.最普遍應(yīng)用的宿主細(xì)胞株3.轉(zhuǎn)化子篩選源自草地夜蛾的細(xì)胞株，在這種細(xì)胞中，多角蛋白的啟動(dòng)子特別活躍。多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面體。通過(guò)顯微鏡檢查看是否有多面體形成。第四十七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日4.目前已經(jīng)用桿狀病毒在真核生物細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白第四十八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日桿狀病毒侵染昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，在幼蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)外源蛋白，成為“低成本蛋白工廠(chǎng)”。22只粉蚊夜蛾幼蟲(chóng)4天后表達(dá)的人腺苷酸脫氫酶占幼蟲(chóng)總蛋白的2%-5%。共產(chǎn)出9mg很純的產(chǎn)物。5.桿狀病毒大規(guī)模表達(dá)存在的問(wèn)題（1）壽命短（2）共同轉(zhuǎn)染率低感染4-5天后宿主細(xì)胞裂解或幼蟲(chóng)死亡。重組率更低。0.1%-1%。第四十九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日6.構(gòu)建可持續(xù)表達(dá)的載體利用AcMNPV的一個(gè)早期基因IE1的啟動(dòng)子。IE1基因的轉(zhuǎn)錄不依賴(lài)于病毒的其他基因產(chǎn)物，而且在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)正常。把外源基因插入到IE1啟動(dòng)子和IE1終止子之間，構(gòu)成整合型載體。載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后隨即整合到宿主染色體上，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的持續(xù)表達(dá)。載體IE1啟動(dòng)子外源基因

IE1終止子載體第五十頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日三、外源基因在植物中表達(dá)1.Ti質(zhì)粒存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱(chēng)腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）。第五十一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)環(huán)狀雙鏈DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相當(dāng)于細(xì)菌染色體的3%-5%）。第五十三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日①T-DNA（transfer-DNA）轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成，能隨機(jī)整合到植物的染色體上。長(zhǎng)度一般為12-24kb，是Ti質(zhì)粒最重要的部分。生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素

冠癭堿基因基因

合成右邊界左邊界生長(zhǎng)素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）編碼合成吲哚乙酸（植物生長(zhǎng)激素）的酶iaaM:色氨酸-2-單加氧酶，iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶第五十四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日②毒性基因（vir）決定土壤農(nóng)桿菌對(duì)植物的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移，進(jìn)入和整合。vir的產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫離后，可與vir的產(chǎn)物VIRD2蛋白結(jié)合，并在VIRD4和VIRB蛋白的幫助下穿過(guò)濃桿菌內(nèi)膜、外膜、壁和植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。單鏈的5’端是右邊界區(qū)域，含有25bp重復(fù)序列，參與整合。第五十六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日③冠癭堿代謝基因④不相容性基因章魚(yú)堿代謝基因和胭脂堿代謝基因：分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長(zhǎng)?？刂芓i質(zhì)粒的不相容性。第五十七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日2.農(nóng)桿菌的感染和生存（1）第一步:植物受傷植物受傷后能分泌酚類(lèi)化合物（如乙酰丁香酮、α羥基乙酰丁香酮），誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達(dá)。第五十八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）第二步：感染植物（3）第三步：毒性基因（vir）表達(dá)（4）第四步：T-DNA轉(zhuǎn)移（5）第五步：誘導(dǎo)冠癭瘤農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。virA、virG、virD、virBT-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來(lái)，并運(yùn)送到植物細(xì)胞核里，整合到植物基因組中T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過(guò)量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，形成植物冠癭瘤。第五十九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第六十頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（6）第六步：土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿第六十一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日3.Ti質(zhì)粒的種類(lèi)根據(jù)所編碼的冠癭堿（opine），分為（1）章魚(yú)堿（octopine)型質(zhì)粒第六十二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）胭脂堿（nopaline）型質(zhì)粒（3）農(nóng)桿堿（agropine）型質(zhì)粒第六十三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日4.Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)象5.Ti質(zhì)粒作為載體的可能性（1）能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。（2）能轉(zhuǎn)化多種植物。（3）強(qiáng)啟動(dòng)子：T-DNA的opine合成酶基因上有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類(lèi)單子葉植物（玉米）。第六十四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日6.天然Ti質(zhì)粒作載體的缺點(diǎn)（1）分子量太大（200kb）！（2）限制性酶切位點(diǎn)太多。（3）被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞成為腫瘤，不能再分化。（4）在大腸桿菌中不能復(fù)制。第六十五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日7.Ti質(zhì)粒的改造（1）保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分（vir基因，左右邊界）。（4）冠癭堿合成對(duì)于植物無(wú)意義。應(yīng)剔除掉。（2）減少限制性酶切位點(diǎn)，引入單一插入位點(diǎn)。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不再成為腫瘤，能正常分化。（5）加入大腸桿菌的ori和選擇標(biāo)記。（6）加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號(hào)和結(jié)束信號(hào)以及添加polyA的信號(hào)序列。第六十六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第六十七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日8.Ti載體的類(lèi)型（1）共整合載體（cointegratevectors）最早獲得廣泛應(yīng)用的Ti質(zhì)粒是比利時(shí)科學(xué)家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850需要同源重組才能插入外源基因。①pGV3850的特點(diǎn)：是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質(zhì)粒作為中間載體。第六十八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第六十九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日②選擇標(biāo)記1）膿桿菌選擇標(biāo)記宿主土壤農(nóng)桿菌的選擇標(biāo)記是位于中間載體pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。2）最終受體植物的選擇標(biāo)記卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素對(duì)植物有劇毒?。┪挥赥-DNA右半部分的胭脂堿合成酶基因（nos）。第七十頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日③外源基因插入pGV3850的過(guò)程第七十一頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日pBR322不能在土壤農(nóng)桿菌中復(fù)制，只能同pGV3850重組。只有這樣，土壤農(nóng)桿菌才能得到抗卡那霉素性狀。第七十二頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第七十三頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）雙元載體（binaryvectors）既有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)也有農(nóng)桿菌復(fù)制起點(diǎn)，是個(gè)穿梭載體。①雙元載體的結(jié)構(gòu)Ti質(zhì)粒被剔除了T-DNA、冠癭堿代謝基因、vir基因。大幅度減小質(zhì)粒的體積。（<10kb）Ti的精髓：Vir基因（轉(zhuǎn)移）和左右界（整合）第七十四頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第七十五頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日②雙元載體的轉(zhuǎn)化1）基因插入轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之前，所有的克隆步驟都在大腸桿菌里操作。Vir產(chǎn)物使雙元載體上的T-DNA左右邊界及其外源基因轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞，并整合到植物染色體上。2）幫助質(zhì)粒（helperplasmid）受體農(nóng)桿菌內(nèi)要求帶有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右邊界）的“幫助質(zhì)?！碧峁﹙ir產(chǎn)物。第七十六頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日第七十七頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日四、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)1.動(dòng)物細(xì)胞基因克隆和表達(dá)載體—SV40病毒2.人乳多空BK病毒載體第七十八頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日1.動(dòng)物細(xì)胞基因克隆和表達(dá)載體—SV40病毒常用的SV40載體，是從猿猴空泡病毒SV40（simianvacuolatingvirus40）改造而來(lái)的。第七十九頁(yè)，共九十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）SV40病毒的結(jié)構(gòu)