單克隆抗體與基因工程抗體的制備

單克隆抗體與基因工程抗體的制備

第一頁，共七十頁?？贵w種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)第二頁，共七十頁。雜交瘤技術的基本原理單克隆抗體的制備一、單克隆抗體的產(chǎn)生二、單克隆抗體的純化三、單克隆抗體的性質鑒定四、單克隆抗體的特性基因工程抗體制備一、基因工程抗體種類二、原理三、重組抗原制備過程第三頁，共七十頁?；靖拍羁乖瓫Q定簇（抗原表位）細胞克隆多克隆抗體單克隆抗體是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱表位(epitope).由一個B淋巴細胞增殖而成的細胞集團針對多種抗原決定簇的混合抗體由單個B細胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體第四頁，共七十頁。雜交瘤技術的理論基礎淋巴細胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學說，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細胞融合技術產(chǎn)生的雜交瘤細胞可以保持雙方親代細胞的特性利用代謝缺陷補救機理篩選雜交瘤細胞，并克隆化，制備McAb當兩個細胞緊密接觸時，細胞膜可能融合在一起。融合細胞含有兩個不同的細胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞，稱為雜交細胞（hybridcell）。第五頁，共七十頁。雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術原理：聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨髓瘤細胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體第六頁，共七十頁。流程雜交瘤技術第七頁，共七十頁。不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細胞第八頁，共七十頁。動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）免疫脾細胞第九頁，共七十頁。細胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫小鼠第十頁，共七十頁。細胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同第十一頁，共七十頁。骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3-10)50%PEG1min內加完;10ml培養(yǎng)液終止反應融合方法第十二頁，共七十頁。SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無菌，預溫37℃）在1分鐘內滴完,靜置45秒,時間一到,將事先準備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個。融合后7-14天，換用HT培養(yǎng)液細胞融合第十三頁，共七十頁。7～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細胞的早期培養(yǎng)第十四頁，共七十頁。HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)第十五頁，共七十頁。HAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻第十六頁，共七十頁。雜交瘤細胞：長期生長繁殖利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力第十七頁，共七十頁。有限稀釋法特點：不需任何特殊設備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細胞陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存第十八頁，共七十頁。單克隆抗體的制備經(jīng)過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。第十九頁，共七十頁。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動物體內誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除第二十頁，共七十頁。腹腔注射法第二十一頁，共七十頁。鹽析沉淀親和層析離子交換層析二、McAb的純化第二十二頁，共七十頁。Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數(shù)法及微機集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 單克隆抗體的性質鑒定第二十三頁，共七十頁。四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復性弱凝集反應和不呈現(xiàn)沉淀反應對環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性第二十四頁，共七十頁。優(yōu)點：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療單克隆抗體的優(yōu)點與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體制備技術復雜、費時費工、價格較高第二十五頁，共七十頁。

McAbPcAb抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低

穩(wěn)定低高沉淀反應無有成本高低McAb與PcAb的比較第二十六頁，共七十頁。McAbandPcAb第二十七頁，共七十頁?；蚬こ炭贵w制備基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。第二十八頁，共七十頁。將小鼠Ig基因敲除，轉染人Ig基因，在小鼠體內產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術，產(chǎn)生大量完全人源化抗體一、人源化抗體第二十九頁，共七十頁。Fab：抗原結合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段SdAb：單區(qū)抗體

二、小分子抗體第三十頁，共七十頁。其它生物活性蛋白融合三、抗體融合蛋白第三十一頁，共七十頁。許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗體連結在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。四、雙特異性抗體第三十二頁，共七十頁。定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性五、噬菌體抗體庫技術第三十三頁，共七十頁。原理與操作技術基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術的方法，把DNA作為組件，在細胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉入宿主細胞，使外源基因DNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（cloning，克?。?，或最后得到表達，最終獲得基因表達產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。第三十四頁，共七十頁?；蚬こ痰牟僮骷夹g

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfection

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、體外基因重組

目的基因的制備

載體的構建：質?；蚴删w

目的基因與載體重組2、重組體DNA的轉化增殖和表達

轉化

篩選

增殖和基因表達第三十五頁，共七十頁。PCR(聚合酶鏈式反應)第三十六頁，共七十頁。

PCR技術原理示意圖

靶序列變性和引物復姓循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3變性和引物復姓鏈延伸Tag酶鏈延伸第三十七頁，共七十頁。抗原的原核表達以脂肪酸結合蛋白（FABP）為例：首先要合成或購買表達FABP的基因序列并設計合成引物第三十八頁，共七十頁。ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAAAGAATGGGGACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAGAACACAGAGATCAGCTTTAAGTTGGGGGTGGAGTTCGATGAGACAACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATGGAGGGAAACTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACCACACTTGTGCGGGAGCTAATTGATGGAAAACTCATCCTGACACTCACCCACGGCACTGCAGTTTGCACTCGCACTTATGAGAAAGAGGCATGA上游引物：HF1>5’CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC3’>

下游引物：HF2>5’GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT3’>

基因序列酶切位點第三十九頁，共七十頁。NdeIXbaICA

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T限制性內切酶限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應。第四十頁，共七十頁。通過擴增獲取足夠的聯(lián)結片段PCR擴增第四十一頁，共七十頁。實驗步驟去離子水緩沖液dNTP引物模板DNA聚合酶混勻1、按下列體系配制反應混合液，混勻，

TemplatecDNA

5.0μL10×buffer

2.5μLMgCl2（25mmol/L）

1.0μLPrimer1(10μmol/L)

0.5μLPrimer2(10μmol/L)

0.5μLdNTP（2mmol/L）

2.0μLTaq酶（5U/μL）

0.25μL加ddH2O至

50μL2、PCR反應循環(huán)條件設置

94℃變性反應1min；55℃退火反應45s；72℃延伸反應1min。進行25個循環(huán)后，最后一個循環(huán)72℃延長至10min。迅速冷卻4℃。第四十二頁，共七十頁。實驗結果121.PCR產(chǎn)物2.MarkerPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳第四十三頁，共七十頁。PCR片段的TA克隆第四十四頁，共七十頁。實驗原理T載體的特點是將普通的克隆載體切成線狀，并使之在3'末端含有一個凸出堿基T；Taq

DNA聚合酶具有末端轉移酶的活性，可在DNA片段的3'末端添加一個核苷酸，通常為A。因此，TaqDNA聚合酶擴增的產(chǎn)物可與T-載體進行粘端互補連接，達到高效克隆的目的。因為TA克隆法操作最簡單，快速和高效的原因，成為Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳克隆方法。第四十五頁，共七十頁。試劑與器材1、材料：純化的PCR產(chǎn)物2、試劑

（1）LB液體培養(yǎng)基（2）1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基（3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）儲存液(20mg/mL)（4）異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）儲液(20mg/mL)（7）pEASY-Blint載體系統(tǒng)3、儀器

全自動高壓滅菌鍋、恒溫水浴槽、高速冷凍離心機、

超凈工作臺、恒溫搖床、電泳儀及電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)第四十六頁，共七十頁。實驗步驟PCR產(chǎn)物T載體連接緩沖液連接酶室溫10min轉化大腸桿菌37℃過夜鋪平板TA質粒的構建

⑴連接反應一般在滅菌的0.5mL離心管中進行。

⑵10μL體積反應體系中：pEasy載體1μL純化的PCR產(chǎn)物3μL⑶輕輕混勻，室溫下放置反應10min。第四十七頁，共七十頁。轉化（1）取一裝有的100μL感受態(tài)細胞的EP管，加入上一步聯(lián)結產(chǎn)物，冰浴上放置30min。（2）將該EP管放入預加溫至42℃的水浴中，熱激45s，快速轉移到冰浴中放置2min。（3）向每個EP管加入500μL的LB培養(yǎng)基，轉移至37℃恒溫搖床上，150r/min，溫育45min以復蘇菌株。

（4）將200μL上述培養(yǎng)物加到含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal40μL和20mg/mL的IPTG40μL），以玻璃涂布棒輕輕地將轉化細胞平鋪于瓊脂平板表面。

（5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過夜培養(yǎng)。第四十八頁，共七十頁。實驗結果重組載體的藍白篩選第四十九頁，共七十頁。連接第五十頁，共七十頁。CA

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A

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ACTCT

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TCT實驗原理第五十一頁，共七十頁。試劑與器材1、材料純化的片段及載體2、試劑

（1）LB液體培養(yǎng)基（2）1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基（3）T4連接酶及緩沖液3、儀器

全自動高壓滅菌鍋、恒溫水浴槽、高速冷凍離心機、

超凈工作臺、恒溫搖床、電泳儀及電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)第五十二頁，共七十頁。實驗步驟表達載體目的片段SolutionI16℃30min轉化大腸桿菌37℃過夜鋪平板表達載體的構建

⑴連接反應一般在滅菌的0.5mL離心管中進行。

⑵10μL體積反應體系中：目的片段3μL表達載體2μLSolutionI5μL⑶輕輕混勻，16℃30min。第五十三頁，共七十頁。重組子的鑒定質粒的提取陽性重組子的酶切鑒定陽性重組子的PCR鑒定第五十四頁，共七十頁。實驗結果第五十五頁，共七十頁。誘導表達第五十六頁，共七十頁。實驗步驟1、將工程菌接種LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)OD600=0.62、加入終濃度為1mmol/L的IPTG。3、繼續(xù)培養(yǎng)5小時。第五十七頁，共七十頁。表達產(chǎn)物的SDS鑒定第五十八頁，共七十頁。實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是對蛋白質及小分子核酸進行量化、比較和特性鑒定的一種快速方法。在蛋白質樣品中加入SDS后，所有的蛋白質分子都與SDS結合并帶有負電荷，因此蛋白質在電場中的移動主要取決于蛋白質分子量的大小，而于蛋白質本身的等電點無關。為了增加分辨率通常采用不連續(xù)凝膠體系，該體系是由濃縮膠、分離膠兩部分組成。濃縮膠與分離膠由于有不同的凝膠濃度和緩沖液pH值，蛋白質樣品在濃縮膠中受到濃縮效應、電荷效應和分子篩效應的影響，可被濃縮成一條極為狹窄的條帶，因此當?shù)鞍踪|樣品進入分離膠時就形成了彼此分離的清晰條帶，大大提高了分辨率。第五十九頁，共七十頁。試劑與器材試劑

1、丙烯酰胺溶液中含有甲叉雙丙稀酰胺2、過硫酸銨（聚合的引發(fā)劑）3、四甲基乙二胺（加速劑，可加快聚合的速度）儀器

垂直板電泳槽和電泳儀第六十頁，共七十頁。實驗步驟1、倒制膠板。將兩玻璃板密封好，將所需濃度的分離膠溶液按比例加入燒杯混勻。倒入密封好的玻璃板間隙中，用少量正丁醇覆蓋液面，以隔絕空氣，并產(chǎn)生整齊的上液面。膠液的聚合大約需要半小時，隨后倒掉膠板上沿的液體并加入配置好的濃縮膠溶液，插入梳子，聚合后移去梳子。2、加樣與電泳蛋白質樣品在加樣前需要和樣品緩沖液混合并煮沸5min，使蛋白質發(fā)生溶解、變性。3、將制膠板中的密封膠條除去，裝入電泳槽，在正負極水槽中加入電極緩沖液，將預處理后的蛋白質樣品加入對應的梳空，裝好電泳槽，接好電源，開始電泳。4、染色與脫色電泳結束后，分離玻璃板，取出凝膠進行染色，可將無色的凝膠直接放入考馬氏亮藍中振蕩染色約1h，再轉入脫色液中脫色。5、用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。第六十一頁，共七十頁。實驗結果

１、低分子量標準蛋白２,3、經(jīng)IPTG誘導的工程菌４、未經(jīng)IPTG誘導的工程菌1234第六十二頁，共七十頁。表達產(chǎn)物的分離純化胞內產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細胞破碎固液分離包含體細胞碎片分離變性復性濃縮初步分離高度純化發(fā)酵液細胞分離第六十三頁，共七十頁。在細菌細胞內，集聚狀態(tài)和共價修飾的蛋白質不能進入復性過程，因此永遠成為無活性的蛋白質。包含體中的蛋白質就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進行人工變性（解除共價修飾和驅散集聚體）復性操作實驗原理第六十四頁，共七十頁。試劑與器材試劑洗滌緩沖液（50mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）洗滌液（20mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，2mol/LUrea，0.5%TritonX-100，pH8.0）溶解液（10mmol/LTris-HCl，8mol/LUrea，50mmol/Lβ-巰基乙醇，1mmol/LMEDTA，pH8.0）稀釋液（3mol/LUrea，10mmol/LTris-HCl，pH8.0）復性緩沖液（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）器材低溫高速離心機、超聲波粉碎儀、光學顯微鏡材料透析袋、燒杯等第六十五頁，共七十頁。實驗步驟包含體分離包含體溶解包含體復性菌體裂解包涵體洗滌先用洗滌緩沖液離心洗滌菌體3次后用洗滌緩沖液將菌體稀釋成1g/10ml濃度混懸液，在冰浴下超聲破碎菌體，然后4℃、10000g離心20分鐘，收集包