章基因工程二

第二十章基因工程第一節(jié)自然界的基因重組一、轉化作用二、轉導作用三、轉位（轉座）一、Transformation轉化作用InsertionCrossingover二、Transduction轉導作用轉導Transduction:

由病毒介導的DNA由一個細胞向另一個細胞轉移的現(xiàn)象。隨后DNA會整合到受體細胞的基因組中。三、基因重排將一個基因從遠離啟動子的地方移到距它很近的位點從而啟動轉錄，這種方式被稱為基因重排。通過基因重排調節(jié)基因活性的典型例子是免疫球蛋白結構基因和T－細胞受體基因的表達。在所有物種中，胚系Ig基因的構成基本上相同。Ig重鏈和輕鏈(λ和κ鏈)基因座都由多個編碼V區(qū)(可變區(qū)）和C區(qū)（恒定區(qū)）蛋白質的基因組成，并被非編碼的DNA（連接區(qū)，J區(qū)）所分隔。V、C、J區(qū)在胚胎期細胞中相距較遠，細胞發(fā)育分化時，免疫球蛋白重鏈基因DNA重排，大量間隔序列被切除，使位于J-Cμ之間的增強子序列得以發(fā)揮作用，增強基因轉錄。四、（轉位））轉座能將自身插入入基因組新位位置的DNA序列。1轉座子子的定義（1）含短的的末端反向重重復序列;（2）含編碼碼轉座酶的基基因;（3）靶位點點存在5-9bp的的短正向重重復序列。第二節(jié)基基因克隆的工工具酶識別DNA的的特異序列，，并在識別位位點或其周圍圍切割雙鏈DNA的一類類內切酶，與與相伴的甲基基化酶共同構構成細菌防御御機制——限限制修飾體系系（限制外源源DNA，保保護自身DNA）HindⅢ流感噬血桿菌菌種屬d株第第三種種內切酶限制性核酸內內切酶命名：：屬名、種種名、株名限制性核酸內內切酶（restrictionendonuclease）切割DNA后后有粘端與平端之分或產(chǎn)生平末端識別位點常為為4-6個堿堿基對、具有有回文結構的的DNA片段段AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸內內切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAG

CTGN---3’3’---NGTC

GACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）錯位切割垂直切割限制性核酸內內切酶的切割割頻率DNA分子中中核苷酸序列列是隨機排列列的，一個識識別四個核苷苷酸序列的內內切酶平均每每隔256bp（44）出現(xiàn)一次該該酶的識別切切割位點。那么，識別6或8核苷酸酸序列的內切切酶的切割頻頻率是多少？基因工程其他他常用的工具具酶酶的種類功能能DNA連接酶酶催化DNA中中相鄰的5'磷酸基和3'羥基末端端之間形成磷磷酸二酯鍵，，使DNA切切口封合或使使兩個DNA分子或片段段連接DNA聚合酶酶I①合成雙鏈cDNA的第第二條鍵②缺口平移制制作高比活探探針③DNA序列列分析④填補3'末末端反轉錄酶以RNA為模模板合成cDNA第一鏈鏈多聚核苷酸激激酶催化多聚核苷苷酸5'羥基基末端磷酸化化，或標記探探針末端轉移酶在3'羥基末末端進行同質質多聚物加尾尾切除末端磷酸酸基團堿性磷酸酶TaqDNA聚合酶PCR擴增第三節(jié)基因因克隆的載體體載體（vector）是是由在細胞中中能夠自主復復制的ＤＮＡＡ分子構成的的一種遺傳成成分，通過實實驗手段可使使其它ＤＮＡＡ片段(外源源基因)連接接在它的上面面，進行擴增增或表達。理想載體應具具備的幾個條條件能在宿主細胞胞內攜帶目的的基因復制擴擴增，具有有較高拷貝數(shù)數(shù)。有多個限制性性內切酶單一一位點，便便于外源基因因的插入。有易檢測的遺遺傳篩選標記記，如抗生素素抗性基因，，用于陽性克克隆的篩選。。分子量量小，，允許許插入入外源源基因因的容容量較較大。。載體分分類（（按功功能分分）克隆載載體：：用于于外源源DNA的的克隆隆和擴擴增。。表達載載體：：用于于外源源基因因的表表達（（轉錄錄翻譯譯生成成蛋白白質））一、克克隆載載體質粒載載體噬菌體體載體體病毒載載體（一））質質粒粒（plasmid）載載體質粒是是一種種獨立立于染染色體體外的的小分分子環(huán)環(huán)狀DNA，一一般大大小約約106~108D，可可自身身復制制和表表達，，有的的質粒粒還帶帶有可可做為為選擇擇性標標記的的抗藥藥性基基因，，所以以質粒粒經(jīng)過過適當當改選選后便便可成成為良良好的的載體體。作作為為載體體的質質粒大大多是是由天天然質質粒經(jīng)經(jīng)人工工適當當改造造而成成的，，目前前已有有多種種經(jīng)改改造的的良好好的質質粒載載體。。質粒（（plasmid））是存在在于細細菌染染色體體外的的小型型環(huán)狀狀雙鏈鏈DNA分子。。大小小約為為數(shù)千堿堿基對對。常常有1~3個個抗藥藥性基因因，以以利于于篩選。。質粒載載體克隆的的質粒粒載體體允許外外源的的DNA插插入，，儲存存。主主要是是DNA水水平上上的操操作。?；虮肀磉_的的質粒粒載體體允許外外源DNA的插插入、、儲存存和表表達。。質粒的的生物物學特特性：：1、質粒DNA的構構型：：SC型型共共價價閉合合環(huán)形形DNA（（cccDNA）OC型型開開環(huán)DNA（ocDNA）L型型線線性DNA（cDNA））2、不不同質質粒的的分子子量大大小差差異相相當顯顯著：：106~108D3、作作為載載體的的質粒粒都含含有三三種共共同的的組分分：復制基基因（（replicator）、、選擇擇性記記號、、克隆隆位點點LOCSC質粒DNA的復復制類類型：：低拷貝貝的質質粒（（1～～十幾幾個））：嚴嚴緊型型復制制控制制的質質粒高拷貝貝的質質粒（（幾十十~幾幾百個個）：：松弛弛型復復制控控制的的質粒粒重要的的大腸腸桿菌菌質粒粒載體體1、pBR322質質粒載載體；；2、pUC質粒粒載體體；以Ampr和Tetr為選擇擇性標標記，，克隆隆位點點在這這兩個個選擇擇性標標記的的單酶酶切位位點上上。（4363bp）oripBR322的的結構構來源源pBR322質質粒載載體的的特點點：1、、具具有有較較小小的的分分子子量量；；它的的分分子子量量為為4363bp。?？丝寺÷≥d載體體的的分分子子量量大大小小不不要要超超過過10kb。。2、、具有有兩兩種種抗抗菌菌素素抗抗性性基基因因可可供供作作轉轉化化子子的的選選擇擇記記號號。。pBR322DNA分分子子中中總總共共有有24種種核核酸酸內內切切酶酶只只具具有有單單一一的的酶酶切切識識別別位位點點。。其其中中7種種內內切切酶酶的的識識別別位位點點在在四四環(huán)環(huán)素素抗抗性性基基因因內內部部，，2種種識識別別位位點點在在于于這這個個基基因因的的啟啟動動區(qū)區(qū)內內，，所所以以9個個限限制制酶酶切切位位點點插插入入外外源源片片斷斷可可以以導導致致tetr基因因的的失失活活；；另另外外有有3種種限限制制酶酶在在氨氨芐芐青青霉霉素素抗抗性性基基因因有有單單一一的的識識別別位位點點，，Example:a.在在pBR322質質粒粒的的BamH或SalⅠ位點點插插入入外外源源DNA片片斷斷，，切切斷斷了了tetr基因因編編碼碼序序列列的的連連續(xù)續(xù)性性，，使使之之失失去去活活性性，，產(chǎn)產(chǎn)生生出出AmprTets表型的重組pBR322質粒，轉化入入AmpsTets的大腸桿菌細細胞。先涂布布在含氨芐青青霉素的選擇擇培養(yǎng)基上，，篩選出具Ampr菌落，再將它它們涂布于含含四環(huán)素的選選擇性培養(yǎng)基基上。插入外外源片斷的重重組質粒不能能在這種培養(yǎng)養(yǎng)基上生長。。b.在PstⅠ或ScaⅠ識別位點插入入外源片斷會會導致Ampr基因的失活，，產(chǎn)生AmpsTetr表型的質粒。。轉化大腸桿桿菌之后，獲獲得的重組子子可以比較快快的檢測出來來。其依據(jù)是是Ampr表型的細胞可可以合成β––內酰胺酶酶，它能使青青霉素轉變成成青霉酮酸，，而這種青霉霉酮酸能與碘碘結合。在含含有可溶性淀淀粉和四環(huán)素素的富裕培養(yǎng)養(yǎng)基上選擇轉轉化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過過夜后，在此此平板上加入入少量的碘指指示劑溶液產(chǎn)產(chǎn)生青霉素ββ–內酰胺胺酶Ampr的菌落，其周周圍的碘指示示劑溶液變得得明亮，而Amps菌落無此反應應。3、具有較高高的拷貝數(shù)，，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后每個細胞胞中可積累1000~3000個拷拷貝。pUC質粒載載體人們應用多克克隆位點技術術，在pBR322的基基礎上，組入入了一個在其其5’-端帶帶有一段多克克隆位點的lacZ’基基因，而發(fā)展展的具有雙功功能檢測特性性的新型質粒粒載體系列。。一種典型的pUC系列的的質粒載體，，包括以下四四個部分：1、來自pBR322質質粒的復制起起點（ori）；2、氨芐青霉霉素抗性基因因（ampr）,但它的DNA核苷酸酸序列已經(jīng)發(fā)發(fā)生了變化，，不在含有原原來的核酸內內切限制酶的的但識別位點點。

3、、大腸桿菌β-半乳糖基基因（lacZ）的啟動動子及編碼αα-肽鏈的DNA序列，，此結構稱之之為lacZ’基因；4、位于于lacZ’’基因中的靠靠近5’-端端的一段多克克隆位點（MCS）區(qū)段段。但它并不不破壞該基因因的功能。AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites,多克隆位點））LacpromoterlacZ’MCS(Multiplecloningsites,多克隆隆位點）：指人工合成的的含有多種限限制性內切酶酶單一識別切切割位點的DNA序列。。乳糖操縱子結結構與調控模模式圖pUC質粒載載體的優(yōu)點第一，具有有較小的分子子量和更高的的拷貝數(shù);僅僅保留了pBR322的氨芐青霉霉素抗性基因因和復制起點點；在操作過過程中復制起起點內部發(fā)生生了自發(fā)突變變造成了基因因rop的缺缺失，它是控控制質粒的特特殊因子，從從而使拷貝數(shù)數(shù)增加，平均均每個細胞500~700個拷貝。。第二，適用于于組織化學檢檢測重組體；；具有來自大腸腸桿菌lac操縱子的lacZ’基基因，所編碼碼的α-肽鏈鏈可參與α-互補作用用，用X-gal顯色對對重組子進行行鑒定，而pBR322質粒的重組組子要進行兩兩步的選擇。。第三，具有多多克隆位點MCS區(qū)段．．方便具有不同同粘性末端的的外源片斷的的插入。穿梭質粒載體體（shuttleplasmidvector）是指一類由人人工構建的具具有兩種不同同復制起點和和選擇記號，，因而可在兩兩種不同的寄寄主細胞存活活和復制的質質粒載體。早期發(fā)現(xiàn)的大大腸桿菌-枯枯草桿菌穿梭梭質粒載體大腸桿菌-釀釀酒酵母穿梭梭質粒載體大腸桿菌-牛牛乳頭瘤病毒毒迄今還沒有發(fā)發(fā)展出適用的的大腸桿菌-植物細胞穿穿梭載體。（二）噬噬菌體體載體（Bacteriophage，簡稱phage）噬菌體的生命命周期噬菌體的溶菌生命周期只具有溶菌生生長周期的噬噬菌體顆粒叫叫烈性噬菌體體。烈性噬菌體溶溶菌生長的基基本過程：1、吸附吸吸附到位于于感染細胞表表面的特殊接接受器上。2、注入噬噬菌體DNA穿過細胞胞壁注入寄主主細胞。3、轉變被被感染的細細胞成為制造造噬菌體顆粒粒的場所。4、合成大大量合成噬噬菌體特有的的核酸和蛋白白質。5、組裝包包裝了DNA頭部和尾尾部組裝成噬噬菌體的顆粒粒。6、釋放合合成的子代代噬菌體顆粒粒從寄主細胞胞內釋放出來來。噬菌體的生命命周期噬菌體的溶源生命周期是指在感染過過程中沒有產(chǎn)產(chǎn)生出子代噬噬菌體顆粒，，噬菌體的DNA是整合合到寄主細胞胞染色體DNA上，成為為它的一個組組成部分?，F(xiàn)知道只有雙雙鏈DNA的的噬菌體才具具有溶源周期期溫和噬菌體：：既能進入溶溶菌生命周期期又能進入溶溶源生命周期。。溶源性細菌：：具有一種完完整的噬菌體體基因組的細細菌溶源化：用用溫和噬菌體體感染細菌培培養(yǎng)物使之形形成溶源性細菌的過過程整合：噬菌菌體的DNA是被包容在在寄主細胞染染色體DNA中原噬菌體：在在溶源細菌內內存在的整合合的或非整合合的噬菌體超感染免疫性性：溶源性細細菌不能夠被被頭一次感染染并使之溶源化的的同種噬菌體體再感染。λ噬菌體載體體λ噬菌體基因組長48.5kb基因組可為線線狀和環(huán)狀兩兩種形式(cosends)溶菌階段溶源階段5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’剪切連連接(包裝過程)(侵侵染細菌細胞胞后)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosends環(huán)狀線狀AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS頭部基因尾尾部基基因功功能能不明區(qū)溶源化重重組早早期控制制阻阻遏DNA合成溶溶菌生長非必須區(qū)區(qū)段cI基因：溶源過過程控制基因因。λ噬菌體的基基因組結構體外包裝λ噬菌體DNA體外重組組后，一般必必須經(jīng)過體外外包裝，然后后以噬菌體感感染的方式將將重組DNA導入E.coli細胞內。這是是因為以感染方式導入細胞胞的頻率可達達106~108/μgDNA，λ噬菌體的包裝限制為野生噬菌體體DNA（約約48.5kb）的75%~105%。

由于λ噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpλ噬菌體載體體的主要類型型1.插入式載體一種只具有一一個可供外源源DNA插入入的克隆位點點的派派生載體。2.替換型型載體（取代代型載體）具有成對的克克隆位點，在在這兩個位位點之間的λDNA區(qū)段段可以被外源源插入的DNA片段所取取代。插入式載體：：cI基因插入入失活：如λgt10等載體體，在cI基基因上有EcoRI及HindIII的的酶切位點。。外源基因插插入后將導致致cI基因的的失活。cI基因失活后后將導致噬菌菌體不能溶原原化，產(chǎn)生清清晰的噬菌斑斑。相反，產(chǎn)產(chǎn)生混濁的噬噬菌斑。LacZ基基因插入失活活：如charon16A載體，在非非必須區(qū)段引引入lacZ基因，在在lacZ基因上有EcoRI位點，，插入失活后后利用X-gal法篩選選（蘭白篩選選）。cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16Aλ替換型載載體（取代型型載體）外源DNA取取代噬菌體染染色體中對于于噬菌體的感感染和復制非非必需的片段段(約20kb)這些載體是用用Lac5（乳糖操縱縱子的大部分分系列，包括括完整的LacZ）替替換入噬菌體體的中間區(qū)段段，同時將Lac5作作為選擇標記記，使用時用用EcoRⅠ水解，去去掉中間的片片段，再與欲欲克隆片段在在體外進行重重組、包裝。。而后，感染染E.coli使之在E.coli內繁殖，并裂裂解E.coli，形成空斑。。如EMBL系列Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40替換型載體克克隆外源DNA的步驟1.應用用適當?shù)暮怂崴醿惹忻赶溯d體，除去可取代的的DNA片段段；2.將上上述所得的λDNA載體體臂同外源DNA片段的的連接；3.對重重組體的λDNA分子進進行包裝和增增殖，以得到有有感染性的λλ重組噬菌體體（左右臂連接接）（（三段自自身連接）（（插插入片段）根據(jù)噬菌斑的的透明度或顏顏色來進行重重組子的篩選選（黏性質粒））柯斯質粒載載體柯斯質粒載體體cosmid載體：也稱粘粒、、柯斯載體。。這是一類用于于克隆大片段段DNA的載載體，它是由由λ噬菌體的cos（cohesivesite）末端及質粒（plasmid）重組組而成的載體體。cosmid載體帶有質質粒的復制起起點、克隆位位點、選擇性性標記以及λλ噬菌體用于于包裝的cos末端等，，因此該載體體在體外重組組后，可利用用噬菌體體外外包裝的特性性進行體外包包裝，利用噬噬菌體感染的的方式將重組組DNA導入入受體細胞。。但它不會產(chǎn)產(chǎn)生子代噬菌菌體，而是以以質粒DNA的形式存在在于細胞內。。設計構建的柯斯質粒一般長4～6kb。其上的cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質?？上笫删wλ一樣感染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制?？滤官|粒載體體的特點具有λ噬菌體體的特性；具有質粒載體體的特性；具有較高容量量的克隆能力力(40Kb)；柯斯質粒pHC79系由質粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構成全長4.3kb單鏈DNA噬噬菌體載體(M13)M13噬菌體體載體M13是一種種含單鏈（+）DNA（（ssDNA）的絲狀大大腸桿菌噬菌菌體，其基因因組大小為6.4kb。。這類載體主主要用來獲得得大量的單鏈鏈ＤＮＡ片段段，這種單鏈鏈ＤＮＡ片段段在遺傳學研研究中主要用用來測定ＤＮＮＡ序列（sanger雙脫氧法））、基因的定定點突變研究究、異源雙鏈鏈DNA的分分析等。RFDNAM13載載體體具有有多多克克隆隆位位點點(MCS)，，方方便便克克隆隆。。許許多多M13載載體體的的多多克克隆隆位位點點與與質質粒粒載載體體pUC序序列列的的多多克克隆隆位位點點是是相相同同的的，，在在克克隆隆位位點點選選擇擇上上更更為為方方便便。?？梢砸远ǘㄏ蛳虻氐乜丝寺÷NA片片段段，，克克隆隆在在M13RFDNA分分子子上上的的雙雙鏈鏈DNA片片段段，，到到了了子子代代噬噬菌菌體體便便成成了了單單鏈鏈的的形形式式。。所所以以如如果果要要同同時時分分離離ＤＤＮＮＡＡ分分子子中中的的雙雙鏈鏈，，則則需需要要兩兩種種獨獨立立的的克克隆隆。。Blue-whiteselectionM13載載體體系系列列的的優(yōu)優(yōu)點點1.在在這這類類載載體體的的基基因因組組中中有有一一條條飾飾變變的的ββ-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因片片段段，，其其中中插插入入了了一一段段具具有有密密集集的的多多克克隆隆位位點點的的序序列列；；2.M13載載體體系系列列是是應應用用基基因因工工程程技技術術成成對對構構建建的的，，可可有有效效地地克克隆隆雙雙鏈鏈DNA分分子子中中的的每每一一條條鏈鏈。。M13克克隆隆載載體體分分子子結結構構圖圖噬菌菌粒粒載載體體噬菌菌粒粒載載體體由質粒粒載體體和和單鏈鏈噬噬菌菌體體載體體結結合合而而成成的的新新型型的的載載體體系系列列。。它具具有有質質粒粒的的復復制制起起點點、、選選擇擇性性標標記記、、多多克克隆隆位位點點等等，，方方便便DNA的的操操作作，，可可在在細細胞胞內內穩(wěn)穩(wěn)定定存存在在；；又又具具有有單單鏈鏈噬噬菌菌體體的的復復制制起起點點，，在在輔助助噬噬菌菌體體的存存在在下下，，可可進進行行噬噬菌菌體體的的繁繁殖殖，，產(chǎn)產(chǎn)生生單單鏈鏈的的子子代代噬噬菌菌體體。。常用用的的噬噬菌菌粒粒載載體體pUC118和和pUC1191.具具有有較較小小分分子子量量的的共共價價、、閉閉合合、、環(huán)環(huán)形形的的基基因因組組DNA，，可可克克隆隆10kb的外外源源DNA片片段段，，并并易易于于進進行行分分離離與與操操作作；；2.編編碼碼一一個個ampr基因因作作為為選選擇擇記記號號，，因因此此只只有有攜攜帶帶pUC118或或pUC119噬噬菌菌粒粒載載體體的的大大腸腸桿桿菌菌轉轉化化子子細細胞胞，，才才能能夠夠在在含含有有氨氨芐芐青青霉霉素素的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中生生長長，，便便于于轉轉化化子子的的選選擇擇；；3.拷拷貝貝數(shù)數(shù)含含量量高高，，每每個個寄寄主主可可高高達達500個個，，所所以以只只要要用用少少量量的的大大腸腸桿桿菌菌細細胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)物物，，便便可可制制備備出出大大量量的的載載體體DNA；；4.存存在在著著一一個個多多克克隆隆位位點點區(qū)區(qū)，，因因此此許許多多種種不不同同類類型型的的外外源源DNA片片段段，，不不經(jīng)經(jīng)修修飾飾便便可可直直接接插插入入到到載載體體分分子子上上；；5.由由于于多多克克隆隆位位點點區(qū)區(qū)阻阻斷斷了了大大腸腸桿桿菌菌lacZ基基因因的的5’’-端端編編碼碼區(qū)區(qū)，，可可按按照照IPTG組組織織化化學學顯顯色色反反應應試試驗驗，，篩篩選選重重組組子子；；6.lacZ基基因因是是置置于于lac啟啟動動子子的的控控制制之之下下，，這這樣樣插插入入的的外外源源基基因因便便會會以以融融合合蛋蛋白白質質的的形形式式表表達達；；7.含含有有質質粒粒的的復復制制起起點點，，在在沒沒有有輔輔助助噬噬菌菌體體的的情情況況下下，，克克隆隆的的外外源源基基因因可可以以像像質質粒粒一一樣樣按按常常規(guī)規(guī)的的方方式式，，復復制制形形成成大大量量的的雙雙鏈鏈DNA分分子子8.帶帶有有一一個個M13噬噬菌菌體體的的復復制制起起點點，，在在有有輔輔助助噬噬菌菌體體感感染染的的寄寄主主細細胞胞中中，，可可以以合合成成出出單單DNA拷拷貝貝，，并并包包裝裝成成噬噬菌菌體體顆顆粒粒分分泌泌到到培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中；；9.在在pUC118和和pUC119這這兩兩個個載載體體中中，，多多克克隆隆位位點點區(qū)區(qū)的的核核苷苷酸酸序序列列取取向向是是彼彼此此相相反反的的，，于于是是它它們們當當中中的的一一個個可可轉轉錄錄克克隆隆基基因因的的正正鏈鏈DNA，，另另一一個個則則可可轉轉錄錄出出負負鏈鏈DNA；；10.可以以直接對克隆隆的DNA片片斷進行核苷苷酸的序列測測定，免去了了從質粒載體體到噬菌體的的這一煩瑣的的亞克隆步驟驟。pBluescript噬菌粒載體體基本結構：1.在多克克隆位點的兩兩側，有一對對T3和T7噬菌體的啟啟動子，可以以定向指導外外源基因的轉轉錄活動；2.同時時具有一個單單鏈噬菌體M13或f1的復制起點點和一個來自自ColE1質粒的復制制起點，在不不同的情況下下，可以采取取不同的復制制形式，分別別合成單鏈或或雙鏈的DNA；3.編碼碼有一個氨芐芐青霉素抗性性基因，供作作轉化子記號號；4.含有l(wèi)acZ基因，，可用Xgal-IPTG組織顯色色反應法篩選選噬菌粒載體體。T7T3用于體外轉錄錄（三）其他載載體酵母人工染色色體載體（yeastartificialchromosome,YAC）細菌人工染色色體（bacterialartificialchromosome,BAC）動物病毒DNA改造的載載體（如腺病病毒、腺病毒毒相關病毒、、逆轉錄病毒毒）人基因組十分分龐大，約含含3×109bp，建立和和篩選人的基基因組文庫，，要求有容量量更大的載體體，酵母人工工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應運運而生。YAC含有酵母母染色體端粒粒（telesome））、著絲點(centromere)及復制起起點等功能序序列，可插入入長度達200-500kb的外源源DNA，導導入酵母細胞胞可以隨細胞胞分裂周期復復制繁殖供作作克隆，成為為人基因組研研究計劃的重重要載體。正常酵母人工工染色體含有有：*四膜蟲端端粒（tel)*酵母自主主復制序列（（ARS)*酵母著絲絲點(CEN)*酵母的選選擇標記(TRP1、、URA1)YAC載體質粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構建時一般都把細菌質粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細胞中表達或試驗其功能、或作基因治療等。

質粒*受體細胞結構插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒載體的種類和和特征質粒λ噬菌體柯斯質粒單鏈噬菌體克隆DNA大片段±*++-構建基因組文庫-++-構建DNA文庫+---常規(guī)的亞克隆化+---構建新型的DNA結構+---序列分析+--+單鏈探針+**--+外源基因在大腸桿菌中的表達+---四種常用載體的比較*外源DNA如超過10kb，則重組質粒的轉化率和DNA得率都非常低**已有個別材料可用于此目的二表達載體大腸桿桿菌（（原核核）表表達載載體表達載載體：：按按特殊殊設計計構建建的，，能使使克隆隆在其其中特特定位位點的的外源源真核核基因因的編編碼序序列，，在大大腸桿桿菌細細胞中中正常常轉錄錄并轉轉譯成成相應應蛋白白質的的克隆隆載體體。表達載載體除除了具具有克克隆載載體所所具備備的復復制起起始位位點，，抗性性基因因和多多克隆隆位點點外，，還需需具備備轉錄錄和翻翻譯所所必需需的元元件。。如：具有功功能（（強））啟動動子；；具有核核糖體體結合合位點點；轉錄終終止序序列。。核糖體體結合合位點點啟動子子轉錄終終止子子復制起點PL啟動子子的表表達載載體是一種種最廣廣泛使使用大大腸桿桿菌表表達載載體的的啟動動子之之一。。λ噬菌菌體的的阻遏遏物－－操作作系統(tǒng)統(tǒng)cI基基因存存在一一個溫溫度敏敏感突突變等等位基基因。。42度度時，，阻遏遏蛋白白失活活；28-30度時時，PL啟動子子完全全被阻阻遏蛋蛋白抑抑制。。通過改改變溫溫度來來控制制PL啟動子子的開開閉真核表表達載載體真核表表達載載體的的構建建有：：原核生生物的的序列列，來來自質質粒的的復制制起始始序列列、抗抗生素素抗性性標記記基因因。真核生生物表表達調調控的的元件件，包包括啟啟動子子，增增強子子、轉轉錄終終止和和polyA加加尾信信號。。真核細細胞的的復制制起始始序列列，可可篩選選標記記基因因等。。真核表表達載載體主要包包括質質粒載載體和和病毒毒載體體，使使用的的調控控表達達元件件最初初多來來源于于病毒毒SV40病病毒載載體逆轉錄錄病毒毒載體體腺病毒毒載體體腺相關關病毒毒載體體第四節(jié)節(jié)基基因克克隆的的一般般過程程基因克克隆的的基本本過程程1．載載體的的選擇擇和制制備2．制制備目目的基基因片片段3．目目的基基因和和載體體間的的重組組連接接4．重重組DNA導入入受體體細胞胞5．重重組組子的的篩選選和鑒鑒定6．重重組子子的擴擴增或或表達達一、目的的基因的的獲取1.用用PCR技術獲獲取基因因2.用用RT-PCR（逆轉轉錄-PCR））獲得基基因3.從從基因組組文庫或或cDNA文庫庫中獲取取基因4．人工工合成基基因是根據(jù)DNA半半保留復復制和DNA聚聚合酶的的特性建建立起來來的體外外復制擴擴增DNA片段段的技術術1.用PCR技技術獲取取基因（聚合酶鏈鏈式反應應,polymerasechainreaction）KaryB.Mulis1985年發(fā)發(fā)明,獲獲1993年諾諾貝爾化化學獎可將微量量的目的的DNA在體外外擴增100萬萬倍以上上PCR技技術2.用RT-PCR（（逆轉錄錄-PCR）獲獲得基因因以mRNA為模模板，先先進行逆逆轉錄得得到cDNA（（complementaryDNA，，cDNA），，再進行行的PCR反應應模板為mRNA需逆轉錄錄酶產(chǎn)物為cDNART-PCR與與PCR區(qū)別3.從基基因組文文庫或cDNA文庫中中獲取基基因基因組文文庫（genomicDNAlibrary）含有某種種生物體體全部基基因片段段的重組組DNA克隆群群體cDNA文庫（（cDNAlibrary）含有某一一組織細細胞中的的全部mRNA信息基因文庫庫genelibrary文庫構建建提取染色色體DNA↓DNA片片段↓插入適當當?shù)目寺÷≥d體↓轉入受體體菌擴增增↓基因組文文庫基因組文文庫的構構建機械法或或限制性性內切酶酶切割細胞總mRNA↓反轉錄酶酶cDNA↓插入合適適載體↓轉入受體體菌↓cDNA文庫cDNA文庫的的構建基因文庫庫構建示示意圖4．人工工合成基基因已知目的的基因的的堿基序序列可用用DNA合成儀儀合成基基因片段段，然后后用其他他反應將將基因片片段連接接起來優(yōu)點可修飾基因

可在基因兩端設計接頭可選擇各種宿主生物偏愛的密碼子二、克隆隆載體的的選擇與與制備1.根根據(jù)克隆隆片段的的大小。。2.根根據(jù)實驗驗目的（（表達或或擴增））等等三、目的的基因與與克隆載載體的連連接（一）粘粘性末端端連接1.利用用相同的的酶切位位點———單酶單單切點用同一種種酶分別別切割目目的基因因/載體體，然后后進行連連接。優(yōu)點：二者產(chǎn)生生相同的的粘性末末端，彼彼此很易易按堿基基配對退退火，在在ligase作用下下生成DNA分分子重組組體。如：geneEcoRⅠvectorEcoRⅠⅠ問題與解解決辦法法：（1）自自身環(huán)化化粘性末端端自發(fā)形形成雙鏈鏈，連接接產(chǎn)物含含大量的的目的基基因和載載體自身身環(huán)化的的假重組組體－>若轉化化則出現(xiàn)現(xiàn)假陽性性克隆。。解決辦法法是用高濃度度的DNA（目目的基因因：載體體為3：：1）和和堿性磷磷酸酶（（AP：：BIP/CIP）處處理載體體，去除除5’－－P使之之不能自自身環(huán)化化，缺口口在宿主主內可得得到修復復。（2）不能定定向克隆/插插入由于是單一位位點，目的基基因可以以不不同方向插入入載體。對于于克隆擴增問問題不大，因因為克隆上去去的基因再重重組時又要切切下來；對于于表達載體目目的基因必須須按5‘－3’方向克隆隆在啟動子下下游而不能反反之。2.利利用用相相同同的的酶酶切切位位點點————雙雙酶酶雙雙切切點點（（定定向向克克隆?。﹥?yōu)點點（（1））避避免免載載體體/目目的的基基因因的的自自身身環(huán)環(huán)化化，，提提高高連連接接效效率率；；（（2））可可控控制制外外源源基基因因插插入入方方向向。。構建建表表達達載載體體時時最最好好使使用用雙雙酶酶雙雙切切點點，，這這樣樣方方式式也也稱稱定定向向克克隆隆。。如：：目目的的基基因因和和載載體體都都有有EcoRⅠⅠ，，PstⅠⅠ酶酶切切位位點點，，產(chǎn)產(chǎn)生生各各自自互互補補粘粘端端，，分分別別配配對對連連接接。。3.通通過過同同聚聚物物加加尾尾連連接接同聚聚物物加加尾尾是是指指用用末末端端脫脫氧氧核核苷苷酸酸轉轉移移酶酶將將某某種種脫脫氧氧核核苷苷酸酸加加到到目目的的基基因因的的3’’末末端端的的羥羥基基上上（（polydC)，，又又將將與與之之互互補補的的脫脫氧氧核核苷苷酸酸（（polydG)加加到到載載體體3’’末末端端的的羥羥基基上上，，制制造造出出粘粘性性末末端端。。dC：：dG同同源源多多聚聚尾尾是是連連接接DNA片片段段克克隆隆cDNA的的有有效效方方法法。。4.加加人人工工接接頭頭連連接接人工工接接頭頭（（linker，，接接頭頭））是指指人人工工合合成成的的，，連連接接目目的的基基因因兩兩端端的的含含有有某某些些限限制制酶酶位位點點的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段，，如如含含EcoRⅠⅠ的的linker與與目目的的基基因因的的連連接接圖圖（（p371））。。5.聚聚合合酶酶鏈鏈反反應應特特異異引引物物連連接接利用用PCR技技術術，，將將PCR引引物物的的5’’端端加加上上限限制制性性內內切切酶酶的的切切點點。。6.T載載體體（（A/T克克隆隆法法））在克隆PCR產(chǎn)產(chǎn)物cDNA時時可采用用這一方方法。（1）cDNA末端添添加AA利利用Taqpol延延伸活性性，以不不依賴模模板的方方式在已已完成延延伸的PCR產(chǎn)產(chǎn)物的3’端添添加AA（利用用DNApol活性性可成））。（2）末末端為TT的線線性化的的T載體體可用下下述2種種方法得得到：①MbcⅡ、XcmⅠⅠ或HphⅠ酶酶切產(chǎn)生生單個T突出末末端；②將T加加到酶切切產(chǎn)生的的平端的的載體上上；T載體已已商品化化。（二）平平頭末端端的連接接平端的4個來源載體目的基因連接或克隆策略①少數(shù)限制酶如HaeⅡ對稱切產(chǎn)生平端√√cDNA①目的基因載體平端平端連接②機械剪切DNA產(chǎn)生平端√√cDNA②加人工接頭連接（cDNA/vector）③逆轉錄生成cDNA是平端√cDNA③用銜接接頭取代人工接頭連接（cDNA/vector）④5’端突出，用酶切平，或用酶填平3’端；3’端突出只能切平，不能填平產(chǎn)生平端√√cDNAcDNA④通過同聚尾連接(cDNA/vector)（一）序序言1.導導入目的的（1）克克隆擴增增rDNA導入宿宿主細胞胞，利用用宿主的的生理條條件，克克隆擴增增，克隆隆片段隨隨著載體體（如質質粒）一一起擴增增獲得擴擴增DNA片段段（如細細菌分裂裂繁殖））。（2）克克隆表達達利用宿主主的生理理條件，，生產(chǎn)基基因工程程產(chǎn)品或或開展基基因治療療。受體細胞胞接接受rDNA分分子的細細胞稱作作受體細細胞或宿宿主細胞胞。（1）原原核細胞胞既既可以復復制擴增增，也可可以基因因表達。。（2）真真核細胞胞一一般只用用作基因因表達系系統(tǒng)。四、重組組DNA（rDNA））導入受受體細胞胞2.受受體細胞胞的基本本條件(1)易易接納rDNA分子；；(2)對載體體復制擴擴增無嚴嚴格限制制；(3)不降降解，不不修飾外外源DNA分子子。3.轉轉化和轉轉染（transformation/transfection）rDNA導入原原核細胞胞的過程程稱轉化化，導入入真核稱稱轉染。。（二）rDNA導入大大腸桿菌菌1.氯氯化鈣轉轉化法感受態(tài)細細胞2.電電穿孔法法轉化效率率高于方方法13.體體外包裝裝感染法法適用于λ載體和和柯斯質質粒（二）rDNA導入哺哺乳動物物細胞1.DNA-磷酸鈣鈣共沉淀淀2.病病毒感染染法3.顯顯微注射射法4.脂脂質體介介導法五、轉化化菌的篩篩選（一）λλ噬菌感感染E.coli可以以溶菌生生長，形形成很亮亮的噬菌菌斑，溶源生長長多少也也有溶菌菌，形成成噬菌斑斑挑選噬噬菌斑即即可分析析鑒定轉轉化子。。（二）質質粒轉化化E.coli可可用含含抗生素素的平板板篩選，，挑選陽陽性克隆隆分析鑒鑒定轉化化子（圖圖8-3）。六、DNA重組組體的篩篩選轉化子不不一定就就是重組組子。轉化菌中中有一部部分是重重組子，，質粒載載體就是是粘端基基因的重重組體，，含有載載體抗生生素抗性性基因，，可在含含抗生素素平板上上存活。。而酶切不不完全或或酶切后后載體未未與目的的基因重重組而自自身環(huán)化化導入host中去的的另一部部分就可可能不是是的，但但因含抗抗生素抗抗性基因因也可在在抗生素素平板上上生長，，所需要要rDNA篩選選。確定定外源DNA片片段是否否插入并并與載體體連接。。五重組組體的篩篩選與鑒鑒定（一）遺遺傳學方方法1.抗抗生素抗抗性篩選選（插入入失活））此法適用用于帶有有抗生素素抗性標標記基因因的克隆隆載體，，將外源DNA插插入到其其一抗抗生素基基因序列列內，該該基因就就失活，，據(jù)此特特性，設設計一套套藥物平平板，可可篩選出出重組子子。插入失活活應用舉舉例1.PBR322含含Ampr和tetr,后者含含BamHI和和SalI2個單一一限制酶酶切點，，具有Ampr和tetr表型。（（雙抗））2.在tetr任何一個個酶切點點插入外外源基因因片斷，，都會導導致tetr失活。3.將含含有插入入外源基基因的PBR322的細菌菌先涂布布于含Amp的的瓊脂板板上，存存活者必必定是轉轉化子。。（Ampr）4.將存存活菌復復印在tet的的瓊脂板板上，對對照2個個平板，，凡在Amp平平板上生生長而在在tet上不生生長的菌菌落，必必定是帶帶有外源源基因的的重組子子。五重組組體的篩篩選與鑒鑒定（一）遺遺傳學方方法2.遺遺傳標記記補救篩篩選A二氫葉酸酸還原酶酶（DHFR)標記基基因用于外源源基因導導入哺乳乳動物細細胞后陽陽性克隆隆的篩選選。B.αα－互補補（藍白白菌落篩篩選或稱稱x－gal篩選）⒈載體Puc系系列（PUC18/19）帶有E.coliDNA的的短區(qū)段段，含：：(1)Lacz(N)即編編碼β－－半糖苷苷酸N端端的146個個AA信信息也稱稱α－多肽肽；(2)編編碼區(qū)插插入一個個MCS并不破破壞閱讀讀框，使使少數(shù)幾幾個AA插入到到該酶酶的N端而不不影響其其功能；；(3)Plac可以啟啟動Lacz的的轉錄錄，表達達，但受受阻pr.阻遏遏，IPTG（（異丙基基硫代ββ－半乳乳糖苷））能夠去去阻遏。。⒉JM103受受體菌含含lacz(c)可以以編碼ββ－半乳乳糖苷酶酶的C端部分分⒊α－互補當當載載體轉入入JM103lacz(n)與lacz(c)α互互補，編編碼具有有活性酶酶pr→→使底物物X-gal生生色（5溴4氯氯3吲哚哚β－半半乳糖苷苷產(chǎn)生蘭蘭菌落））。⒋當MCS插入入外源gene片斷時時，幾乎乎無一例例外產(chǎn)生生無α－互補能能力的氨氨基酸酸片段（（插入酶酶失落））導致白白菌落產(chǎn)產(chǎn)生。PUC19PlacLacZ(N)MCSJM103外源基因因片段插插入白菌落I