基因工程的基本操作程序修改

1.2基因工程的基本操作程序補充：基因的結(jié)構(gòu)（1）原核生物基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達（調(diào)控程序）啟動子終止子…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………...G…T‥…......TACACGTGCATCAAT………...C編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。

RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)的序列。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)的序列。編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②是調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。（也就是啟動子）（2）真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子

不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：

外顯子：

真核細胞的一個基因的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄出前體mRNA，需把其中的內(nèi)含子切除，外顯子拼接成成熟mRNA。真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼真核基因長1.2基因工程的基本操作程序二.基因表達載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細胞四、目的基因的檢測與鑒定一.目的基因的獲取基本操作的四個步驟一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴增（3）人工合成生物抗逆性相關(guān)基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1、基因文庫（一）從基因文庫中直接獲取一、目的基因的獲取限制酶酶基因組組DNA基因重重組轉(zhuǎn)化細細菌體外包包裝1)基因組組文庫庫(Genomiclibrary)是指將將某種種生物物體的的全部基基因組組DNA，用限制性性內(nèi)切切酶或機械械力量量切割成一定定長度度范圍圍的DNA片段段，再再與合合適的的載體在體外外重組組后，，導(dǎo)入入受體菌菌的群群體中中儲存存，這個個群體體就稱稱為該該生物物基因組組文庫庫。其目的的是分分離有有用的的目的的基因因和保保存某某種生生物的的全部部基因因。cDNA(互補DNA)：是用某某種生生物發(fā)發(fā)育的的某個個時期期的mRNA反轉(zhuǎn)錄錄產(chǎn)生的的多種種互補DNA（也叫叫cDNA）片段，與載體連連接后儲存存在一一個受受體菌菌群中中，這這個受受體菌菌群就就叫做做這種種生物物的cDNA文庫2)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因重重組反轉(zhuǎn)錄錄酶mRNAcDNA提取某種種生物的的全部DNA一定大小小的DNA片段導(dǎo)入受體體菌中儲儲存用適當?shù)南拗泼盖懈顚NA片段與載體連接基因組文文庫直接分離離法(鳥槍法)多用于原原核生物物2、基因組文文庫的建建立方法法某種生物物的單鏈鏈mRNA單鏈互補補DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體體菌中儲儲存cDNA文庫反（逆））轉(zhuǎn)錄酶酶DNA聚合酶3、cDNA文庫的的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄法多用于真核生物物文庫類型

cDNA文庫基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）基因多少物種間的基因交流小大無有無有某種生物物的部分分基因某種生物物的全部部基因可以部分基因因可以基因組文文庫和部部分基因因組文庫庫(cDNA文庫)比較基因組文文庫與部部分基因因文庫的的關(guān)系怎樣從基基因文庫庫中得到到我們所所需的目目的基因因呢?依據(jù)：目目的基因因的有關(guān)關(guān)信息。。如：根據(jù)據(jù)基因的的核苷酸酸序列基因的功功能基因在染染色體上上的位置置基因的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物物mRNA基因翻譯譯產(chǎn)物蛋蛋白質(zhì)等等特性4、從基因文文庫中得得到目的的基因的的方法尋根問底底——為什么要要構(gòu)建基基因文庫庫？直接接從含有有目的基基因的生生物體內(nèi)內(nèi)提取不不行嗎？？提示：構(gòu)構(gòu)建基因因文庫是是獲取目目的基因因的方法法之一，，并不是是惟一的方方式。如果所所需要的的目的基基因序列已知知，就可以以通過PCR方式從含有該該基因的的生物的的DNA中，直接接獲得，，也可以以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，，不一定定要構(gòu)建建基因文文庫。但但如果所所需要的的目的基基因的序列完全全不知，或只知知道目的的基因序列的一一段，或想從從一種生生物體內(nèi)內(nèi)獲得許多多基因，或者想想知道這這種生物物與另一一種生物物之間有多少基基因不同同，或者想想知道一一種生物物在個體體發(fā)育的的不同階段段表達的的基因有有什么不不同，或者想想得到一一種生物物的全基基因組序序列，往往往就需需要構(gòu)建建基因文文庫。18（二）利利用PCR擴增目的的基因(二)利用PCR技技術(shù)擴增增(二)利用PCR技技術(shù)擴增增①概念念：PCR全稱為_______________，是一項項在生物____復(fù)制___________的核酸合合成技術(shù)術(shù)③條件：：_______________________、_______________、、___________(做啟啟動子)、___________。②原理：：__________④方式：：以_____方式擴增增，即____（n為擴增循循環(huán)的次數(shù)數(shù)）⑤結(jié)果：：聚合酶鏈鏈式反應(yīng)應(yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因因的核苷苷酸序列列四種脫氧氧核苷酸酸一對引物物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（（Taq酶）指數(shù)2n使目的基基因的片片段在短短時間內(nèi)內(nèi)成百萬萬倍地擴擴增前提條件件⑥過程：：a、DNA變性（90℃-96℃℃）：：雙雙鏈鏈DNA模板板在熱熱作作用用下下，，_____斷裂裂，，形形成成___________b、、退退火火（復(fù)復(fù)性性55℃℃-65℃℃））：：系系統(tǒng)統(tǒng)溫溫度度降降低低，，引物物與DNA模板結(jié)結(jié)合，形形成局部部________。。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在DNA聚聚合酶的作用用下，從從引物的的5′端→→3′端端延伸，合合成與模模板互補補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈DNA合成方向向總是從從子鏈的的5′端→→3′端端延伸PCR技術(shù)擴增增與DNA復(fù)制的比比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補補配對四種脫氧氧核苷酸酸模板、能能量、酶酶DNA在高溫下下變性解解旋解旋酶催催化體外復(fù)制制細胞核內(nèi)內(nèi)熱穩(wěn)定DNA聚合酶細胞內(nèi)的的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個個DNA分子（三）、人工合合成法：：基因較小，核苷酸酸序列已知知，可以利利用DNA合成儀人工合成成反轉(zhuǎn)錄法目的基因因的信使使RNA目的基因因化學(xué)合成成法肽鏈氨基基酸序列列信使RNA序列基因的核核苷酸序序列目的基因因合成逆轉(zhuǎn)錄人工合成成法推測推測單鏈DNA合成1、下列屬屬于獲取取目的基基因的方方法的是是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄錄形成②②從基因因組文庫庫中提取取③從受體細細胞中提提?、堍芾肞CR技技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄錄⑥⑥人人工合成成A.①②②③⑤B.①②⑤⑤⑥C.①②②③④D.①①②④⑥⑥2、有關(guān)基基因工程程的敘述述正確的的是（（））A、限制制酶只在在獲得目目的基因因時才用用B、重組組質(zhì)粒的的形成在在細胞內(nèi)內(nèi)完成C、質(zhì)粒粒都可作作為運載載體D、蛋白白質(zhì)的結(jié)結(jié)構(gòu)可為為合成目目的基因因提供資資料D1.作用：二.基因表達達載體的的構(gòu)建———核心心IMN2.組成：①使目的基基因在受受體細胞胞中穩(wěn)定定存在并并遺傳給給子代。②同時使使目的基基因能表表達和發(fā)發(fā)揮作用用。(3)終止子子：(4)標記基基因：：(2)啟動子子：(1)目的基基因。。（5）復(fù)制制原點點：不同受受體細細胞，，目的的基因因?qū)肴胧荏w體細胞胞的方方法不不同，，基因因表達達載體體的構(gòu)構(gòu)建有有所差差異。。是RNA聚合酶酶識別別和結(jié)結(jié)合部部位。。是使轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄在在需要要的地地方停停止。。是鑒別別受體體細胞胞中是是否含含有目目的基基因從而將將含有有目的的基因因的細細胞篩篩選出出來。。是復(fù)制制的起起點。。①載體與表達載載體的區(qū)別別：二二者都都有標標記基基因和和復(fù)制制原點點兩部部分DNA片段。。表達載載體在在載體體基礎(chǔ)礎(chǔ)上增增加了了目的的基因因、啟啟動子子、終終止子子三部部分結(jié)結(jié)構(gòu)②用到的的工具具酶：：既用到到限制制酶切切割載載體，，又用用到DNA連接酶酶將目目的基基因和和載體體拼接接，兩兩種酶酶作用用的化化學(xué)鍵鍵都是是磷酸酸二酯酯鍵③啟動子子、終終止子子對于目目的基基因表表達必必不可可少④目的基基因不不能單單獨進進入受受體細細胞，，必需以以表達達載體體的方方式攜攜帶進進去。。注意尋根問問底：：將目目的基基因直直接導(dǎo)導(dǎo)入受受體細細胞不不是更更簡便便嗎？？如果果這么么做，，結(jié)果果會怎怎樣？？提示：有人人采用總DNA注射法進行行遺傳轉(zhuǎn)化化，即將一一個生物中中的總DNA提取出來，，通過注射射或花粉管管通道法導(dǎo)導(dǎo)入受體植植物，沒有有進行表達達載體的構(gòu)構(gòu)建，這種種方法針對對性差，完完全靠運氣氣，也無法法確定什么么基因?qū)肴肓耸荏w植植物。此法法目前爭議議頗多，嚴格來講講不算基基因工程程。思考與探探究：1.作為基因因工程表表達載體體，只需需含有目目的基因因就可以以完成任任務(wù)嗎？？為什么么？不可以。。因為目目的基因因在表達達載體中中得到表表達并發(fā)發(fā)揮作用用，還需需要有其其他控制制元件，，如啟動動子、終終止子和和標記基基因等。。必須構(gòu)構(gòu)建上述述元件的的主要理理由是：：（1）生物物之間進進行基因因交流，，只有使使用受體體生物自自身基因因的啟動動子才能能比較有有利于基基因的表表達；（2）通過過cDNA文庫庫獲得的的目的基基因沒有有啟動子子，只將將編碼序序列導(dǎo)入入受體生生物中無無法轉(zhuǎn)錄錄；（3）目的的基因是是否導(dǎo)入入受體生生物中需需要有篩篩選標記記；（4）為了了增強目目的基因因的表達達水平，，往往還還要增加加一些其其他調(diào)控控元件，，如增強強子等；；（5）有時時需要確確定目的的基因表表達的產(chǎn)產(chǎn)物存在在于細胞胞的什么么部位，，往往要要加上可可以標識識存在部部位的基基因（或或做成目目的基因因與標識識基因的的融合基基因），，如綠色色熒光蛋蛋白基因因等。3、將目的的基因?qū)?dǎo)入受體體細胞轉(zhuǎn)化——方法將目的基基因?qū)肴胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)肴雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)肴胛⑸锛毤毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法基因槍法法花粉管通通道法——顯微注射射法——感受態(tài)細細胞法目的基因因進入_________內(nèi)，并且且在受體體細胞內(nèi)內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞胞穩(wěn)定表達常用的受受體細胞胞：有大腸桿桿菌、枯枯草桿菌菌、土壤壤農(nóng)桿菌菌、酵母母菌和動動植物細細胞等。。1、將目的的基因?qū)?dǎo)入植物物細胞的的方法：：（1）農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化法法①農(nóng)桿菌菌特點：：易感染雙雙子葉植植物和裸裸子植物物，對大大多數(shù)單單子葉植植物沒有有感染能能力②原理：：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移移到受體體細胞，，并整合到受受體細胞胞染色體體的DNA上。雙子葉植植物、祼子植物物適用生物物?目的基因因Ti質(zhì)粒上的的T－DNA插入植物細胞胞農(nóng)桿菌染色體DNA上維持穩(wěn)定定和表達達并整合到到導(dǎo)入感染同時T-DNA導(dǎo)入③過程：：④優(yōu)點：比較經(jīng)濟濟和有效效思考與探探究：2.根據(jù)農(nóng)桿桿菌可將將目的基基因?qū)肴腚p子葉葉植物的的機理,你能分析析出不能能導(dǎo)入單單子葉植植物的原原因嗎?若將一個抗病病基因?qū)胄⌒←溨?理論上講你應(yīng)應(yīng)該怎樣做?①要選擇合適的的農(nóng)桿菌菌株株，因為不是是所有的農(nóng)桿桿菌菌株都可可以侵染單子子葉植物；②要加趨化和誘誘導(dǎo)的物質(zhì)，，一般為乙酰酰丁香酮等，，目的是使農(nóng)農(nóng)桿菌向植物物組織的受傷傷部位靠攏（（趨化性）和和激活農(nóng)桿菌菌的Vir區(qū)區(qū)（誘導(dǎo)）的的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移并插入到到染色體DNA上。37（2）基因槍法：利用壓縮氣體體產(chǎn)生的動力力，將包裹裹在金屬粒表表面的表達載載體DNA打入受體細胞胞中，使目的的基因與其整整合并表達的的方法①操作方法：：②金屬粒：將目的基因?qū)?dǎo)入單子葉植植物細胞鎢粉粒子和金金粉粒子，粒子的直徑一一般在0.6～4um。④適用：單子葉葉植物③缺點：成本較高（3）花粉管通道法法：將目的基因?qū)?dǎo)入植物細胞胞①操作方法：：②特點：在植物受粉后后，花粉形成成花粉管還末愈合前前期，剪去柱柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因因）使目的基基因借助花粉管通通道進入受體體細胞十分簡便經(jīng)濟濟③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉棉2.將目的基因?qū)?dǎo)入動物細胞胞顯微注射技術(shù)術(shù)提純含目的基基因的表達載體體取出受精卵顯微注射受精卵移植入輸卵管或子宮發(fā)育成具新性狀的動物①方法：②程序：培養(yǎng)成早期胚胎①原核生物特特點：繁殖快、多為為單細胞、遺遺傳物質(zhì)相對對較少，故早早期常作為受受體細胞。大腸桿菌細胞胞感受態(tài)細胞用Ca2+處理重組表達載體體DNA溶于緩沖液混合轉(zhuǎn)入②方法：常用菌：大腸桿菌3.將目的基因?qū)?dǎo)入微生物細細胞通過標記基因因，進行篩選選和檢測導(dǎo)入過程完成成后，全部受受體細胞都能能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重重組DNA分子的受體細細胞很少。所以要對受體體細胞作怎樣樣的處理？對受體細胞中中是否導(dǎo)入了了目的基因進進行檢測怎樣進行檢測測？4、目的基因的的檢測與鑒定定——檢查是否成功功檢測鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基因因生物染色體的DNA上是否否插入②檢測測目的③檢測測目的的基因因是否翻翻譯成成蛋白白質(zhì)抗蟲鑒鑒定、、抗病病鑒定定、活活性鑒鑒定等等方法——方法——方法——DNA分子雜雜交分子雜雜交抗原抗抗體雜雜交DNA分子雜雜交示示意圖圖采用一一定的的技術(shù)術(shù)手段段，將將兩種種生物物的DNA分子的的單鏈鏈放在在一起起，如如果這這兩個個單鏈鏈具有有互補補的堿堿基序序列，，那么么，互互補的的堿基基序列列就會會結(jié)合合在一一起，，形成成雜合合雙鏈鏈區(qū)；；在沒沒有互互補堿堿基序序列的的部位位，仍仍然是是兩條條游離離的單單鏈。。堿基互互補配配對原理：：1.檢測轉(zhuǎn)基因因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢檢測轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因生物物染色色體的的DNA上上是否否插入入了目目的基基因基因探探針：：放射性性同位位素等等標記記含有有目的的基因因的DNA片段段方法——DNA分子雜雜交技技術(shù)方法——分子雜雜交技技術(shù)（2）檢測測目的的基因因是否轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄出出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因因生物物的mRNA14N提?。?）檢測測目的的基因因是否否翻譯譯成蛋蛋白質(zhì)質(zhì)方法———蘇云金桿菌Bt毒素蛋蛋白將Bt毒蛋白白注射射小鼠鼠體內(nèi)內(nèi)從小鼠鼠血管管抽出出血液液分離離出抗抗Bt毒素的的抗體體抗體Bt毒素蛋蛋白（（抗原原）出現(xiàn)雜雜交帶帶脫分化化組織培培養(yǎng)證明：：提取蛋蛋白質(zhì)質(zhì)與Bt毒素蛋蛋白質(zhì)質(zhì)一樣樣抗原-抗體雜雜交例：用用棉鈴鈴飼喂喂棉鈴鈴蟲，，如蟲蟲吃后后不出出現(xiàn)中中毒癥癥狀，，說明明未攝攝入目目的基基因或或攝入入目的的基因因未表表達。。如蟲蟲吃后后中毒毒死亡亡，則則說明明攝入入了抗抗蟲基基因并并得到到表達達。2.鑒定———個體生物物學(xué)水平平的鑒定定（1）多細胞胞個體抗蟲、抗抗病結(jié)種種實驗，，活性比比較實驗驗不能，受受體細胞胞必須表表現(xiàn)出特特定的性性狀，才才能說明明目的基基因完成成了表達。受體細胞胞攝入DNA分分子后就就說明目目的基因因完成了表表達嗎？？若不能表表達，要要對抗蟲蟲基因再再進行修飾。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物細菌的檢檢測，將將每個受體細胞胞單獨培培養(yǎng)形成菌落落，檢測菌菌落中是是否有目目的基因因的表達達產(chǎn)物。。淘汰無無表達產(chǎn)產(chǎn)物的菌菌落，保保留有表表達產(chǎn)物物的進一一步培養(yǎng)養(yǎng)、研究究。（2）單細胞胞生物3.利用大腸腸桿菌可可以生產(chǎn)產(chǎn)出人的的胰島素素，聯(lián)系系前面有有關(guān)細胞胞器功能能的知識識，結(jié)合合基因工工程操作作程序的的基本思思路，思思考一下下，若要要生產(chǎn)人人的糖蛋蛋白，可可以用大大腸桿菌菌嗎？有些蛋白白質(zhì)肽鏈鏈上有共共價結(jié)合合的糖鏈鏈，這些些糖鏈是是在內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)和高高爾基復(fù)復(fù)合體上上加工完完成的，，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)和高爾爾基復(fù)合合體存在在于真核核細胞中中，大腸腸桿菌不不存在這這兩種細細胞器，，因此，，在大腸腸桿菌中中生產(chǎn)這這種糖蛋蛋白是不不可能的的。思考與探探究：53（1）從小鼠鼠中克隆隆出β-珠蛋白白基因的的編碼序序列（cDNA）（2）將將cDNA前接接上在大大腸桿菌菌中可以以適用的的啟動子子和終止子，另外加加上抗四四環(huán)素的的基因，，構(gòu)建成成一個表表達載體體。（3）將表達達載體導(dǎo)導(dǎo)入無四四環(huán)素抗抗性的大大腸桿菌菌中，然然后在含含有四環(huán)環(huán)素的培培養(yǎng)基上上培養(yǎng)大大腸桿菌菌。如果果表達載載體未進進