病毒感染的檢測(cè)方法與防治原則精品課件

病毒感染的檢查方法

與防治原則11/19/2023012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION病毒感染檢測(cè)：病毒感染的檢測(cè)方法:（針對(duì)病原體，針對(duì)特異性免疫反應(yīng)）細(xì)胞培養(yǎng)鑒定病毒直接觀察檢測(cè)病毒抗原檢測(cè)病毒核酸中和檢測(cè)IgM檢測(cè)IgG4倍以上升高細(xì)胞因子檢測(cè)1/19/20233特異性檢測(cè)病毒特異性檢測(cè)抗病毒免疫標(biāo)本采集與運(yùn)送

標(biāo)本的采集采樣時(shí)間盡可能在發(fā)病的初期，急性期或患者人院的當(dāng)天進(jìn)行。1/19/20234標(biāo)本的采集標(biāo)本種類的選擇根據(jù)臨床感染的癥狀及流行病學(xué)資料，判斷可能感染病毒種類，選擇相應(yīng)部位采取標(biāo)本。1/19/20235常見分離病毒標(biāo)本的選擇1/19/20236病毒咽拭子糞便血液腦脊液唾液組織柯薩奇A和B組+++心單純皰疹病毒+腦膜腮腺炎病毒+++流感病毒+輪狀病毒+HAV+HIV+

精液常見標(biāo)本的采集方法血液：以無(wú)菌取抗凝血10ml?？鼓x用100n／ml肝素鈉。用于分離CMV、HSV、黃病毒、EBV、HIV-1及新生兒腸道病毒。腦脊液：以無(wú)菌取腦脊液1～2ml，冰浴立即送檢。在4℃可存放72h。用于分離柯薩奇病毒、ECHO病毒、腸道病毒、腮腺炎病毒。宮頸或陰道拭子：采取病灶部位分泌物，或?qū)⑹米由烊藢m頸約lcm停留5秒取出，冰浴立即送檢。用于分離HSV、CMV。糞便標(biāo)本：取2～4ｇ糞便加10ml運(yùn)送液立即送檢，用于分離腺病毒、腸道病毒和輪狀病毒。1/19/20237常見標(biāo)本的采集方法含漱液：用無(wú)菌生理鹽水讓患者含漱。用于分離流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。喉拭子：用壓舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分離腺病毒、CMV、腸道病毒、HSV、流感病毒等。尿道拭子及尿液標(biāo)本：尿道拭子伸入尿道4cm轉(zhuǎn)動(dòng)3次，以獲得較多的上皮細(xì)胞，用于分離CMV和HSV。尸檢標(biāo)本：死亡后盡早采集各種器官，分別使用器械和容器。1/19/20238標(biāo)本的運(yùn)送和保存病毒抵抗力弱，室溫中容易滅活，用于分離培養(yǎng)的標(biāo)本要盡快送檢，4℃下數(shù)ｈ或-70℃。凍存液中加入甘油或二甲基亞砜(DMSO)等作保護(hù)。病毒傳送培養(yǎng)基以Hanks液為基礎(chǔ)加滅活的小牛血清。為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)加青霉素100U／ml和鏈霉素100μg／ml，為了抑制真菌的生長(zhǎng)加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。1/19/20239病毒感染檢測(cè)（標(biāo)本采集）：病毒感染的檢測(cè)方法:（針對(duì)病原體，針對(duì)特異性免疫反應(yīng)）細(xì)胞培養(yǎng)鑒定病毒直接觀察檢測(cè)病毒抗原檢測(cè)病毒核酸中和檢測(cè)IgM檢測(cè)IgG4倍以上升高細(xì)胞因子檢測(cè)1/19/202310特異性檢測(cè)病毒（感染位點(diǎn)/血液）特異性檢測(cè)抗病毒免疫（血液）病毒培養(yǎng)細(xì)胞分離培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)：由供體組織直接分離培養(yǎng)的細(xì)胞，稱之為原代細(xì)胞。二倍體細(xì)胞株：仍保持二倍體特性。壽命一般為40～50代，如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。傳代細(xì)胞系：來(lái)于腫瘤細(xì)胞，染色體特征類似腫瘤細(xì)胞。常用的有人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人喉上皮癌細(xì)胞(Hep-2)。1/19/202311（常作為確證檢測(cè)的第一步）常用于病毒分離的細(xì)胞1/19/202312雞胚接種雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。雞胚對(duì)多種病毒敏感。一般采用孵化9～14天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標(biāo)本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。動(dòng)物接種動(dòng)物對(duì)病毒的敏感性是不同的，選擇合適動(dòng)物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分離病毒。1/19/202313細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)：細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，細(xì)胞溶解出現(xiàn)空斑，細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，胞漿內(nèi)或核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體等；不出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象。（紅細(xì)胞吸附）細(xì)胞培養(yǎng)液pH的變化。1/19/202314基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)手段Transformation

lossofcontactinhibition1/19/202315CPE:Measles(風(fēng)疹病毒)onhumanlungcarcinoma(A549)FieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202316CPE:vaccinia(痘病毒)UninfectedInfectedFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202317RSV(呼吸道合胞病毒)-syncytia1/19/202318CPE:inclusionbodiesNegribodiesNegribodiesneuronImmunohistochemicalstainingofintra-cytoplasmicviralinclusionsintheneuronofahumanrabiespatient.(FieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.39.9)1/19/202319紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)正粘病毒，副粘病毒感染的宿主細(xì)胞，病毒增殖后產(chǎn)生細(xì)胞病變，但在細(xì)胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞。可作為初步鑒定。如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清后，不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，是為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽(yáng)性，可作為病毒鑒定的依據(jù)。1/19/202320紅細(xì)胞吸附addredbloodcells1/19/202321Hemadsorptionoferythrocytestocellsinfectedwithinfluenzaviruses,mumpsvirus,parainfluenzaviruses,ortogaviruses.Thesevirusesexpressahemagglutininontheirsurfaces,whichbinderythrocytesofselectedanimalspecies.(FromMedicalMicrobiology,5thed.,Murray,Rosenthal&Pfaller,MosbyInc.,2005,Fig.51-5.)Hemadsorption1/19/202322Plaqueformation1/19/202323PlaqueFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202324Plaqueformation1/19/2023251:1001:101:101:101:101:1010-210-310-410-510-610-7virusserialdilutionplate1mlplaques100101(1000)(100,000)(10,000)Titer=1x107pfu/mlPlaqueassay:method1/19/202326PlaqueassayTiter=1.2x108pfu/ml1/19/202327免疫熒光1/19/202328免疫熒光可以直接用來(lái)檢測(cè)采集的標(biāo)本中是否含有病毒抗原、細(xì)胞培養(yǎng)的病毒，或者用來(lái)檢測(cè)血清中是否存在特異性抗體。細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè)1/19/20232900h4h6h4h8h10h12h14h16h18h20h22h24h1/19/202330=infected=uninfectedEndpointtitrationFivereplicatewellsofcellsareinfectedwithonemlofeachoffourdifferentvirusdilutions,incubated,andscoredforinfectionbylookingforCPE.Inthisexample,thefinaltiteris106.3TCID50perml.(TCID=tissuecultureinfectivedose)10-510-610-710-85replicatesamplings12345dilution1/19/202331Endpointtitration1/19/202332106.35

TCID50perml病毒中和實(shí)驗(yàn)(特異性抗體檢測(cè))1/19/2023331/19/202334Hemagglutination(血凝檢測(cè))RBC1/19/202335Titer=32HAunits/mlHemagglutinationtest1:81:21:21:21:21:28163264128256virusserialdilutiontopviewmixwithredbloodcellssideview1/19/202336Hemagglutinationassay.Sevendifferentsamplesofinfluenzavirus,numbered1through7attheleft,wereseriallydilutedasindicatedatthetop,mixedwithchickenredbloodcells(RBC),andincubatedonicefor1to2hours.Wellsinthebottomrowcontainnovirus.AgglutinatedRBCscoatwellsevenly,incontrasttononagglutinatedcells,whichformadistinctbuttonatthebottomofthewell.TheHAtiter,shownattheright,isthelastdilutionthatshowscompletehemagglutinationactivity.(FromFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.9)Hemagglutinationassay:influenzavirus1/19/202337血凝抑制實(shí)驗(yàn)1/19/2023381/19/202339核酸類型鑒別及序列測(cè)定利用5—溴-2-脫氧尿苷(BUDR)抑制DNA復(fù)制的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入該物質(zhì)，可抑制DNA病毒的復(fù)制和增殖，抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，但對(duì)RNA病毒無(wú)抑制作用，以此判斷病毒核酸類型。對(duì)病毒核酸特異序列或全序列的堿基排列測(cè)定或DNA雜交、DNA-RNA雜交來(lái)鑒定病毒。1/19/202340耐酸試驗(yàn)?zāi)c道病毒對(duì)酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。乙醚敏感試驗(yàn)病毒外圍如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞?？勺鳛椴《臼欠窬哂蓄愔さ囊罁?jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗(yàn)。1/19/2023412、電鏡觀察病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查。對(duì)于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。1/19/202342雞痘病毒（超薄切片）1/19/202343Adenovirus電鏡負(fù)染1/19/202344腺病毒HumanRotavirus電鏡負(fù)染1/19/202345輪狀病毒Paramyxovirus(Parainfluenza)電鏡負(fù)染1/19/202346副流感病毒1/19/202347免疫電鏡1/19/202348通過(guò)測(cè)定病毒的特異標(biāo)志成分，如特殊形態(tài)、特異的抗原成分及病毒的核酸，早期確認(rèn)病毒的感染，是病毒學(xué)診斷的重大發(fā)展。——分子診斷3、快速診斷1/19/202349免疫檢測(cè)核酸檢測(cè)檢測(cè)機(jī)體免疫反應(yīng)檢測(cè)病毒抗原檢測(cè)病毒核酸檢測(cè)特異性抗體檢測(cè)病毒組成1/19/202350方法學(xué)A間接法Ab1Ab2B夾心法Ab2Ab1C捕獲法D競(jìng)爭(zhēng)法抗原標(biāo)記物抗體支持介質(zhì)免疫檢測(cè)ELISA1/19/2023511/19/2023521/19/2023531/19/202354A、納米微球膠體金彩色乳膠微球納米磁性微球納米熒光微球B、酶免紙條免疫檢測(cè)進(jìn)展－化學(xué)發(fā)光1/19/202355

所謂化學(xué)發(fā)光(CL),就是化學(xué)反應(yīng)的能量把體系中共存的某種分子從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)從而產(chǎn)生發(fā)光的現(xiàn)象。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)能級(jí)圖時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光與輝光及其測(cè)量方式的差別酶促發(fā)光化學(xué)發(fā)光1/19/202356免疫檢測(cè)進(jìn)展－時(shí)間分辨熒光1/19/202357Antibodydetection:westernblot1/19/202358病毒感染檢測(cè)：病毒感染的檢測(cè)方法:（針對(duì)病原體，針對(duì)特異性免疫反應(yīng)）細(xì)胞培養(yǎng)鑒定病毒直接觀察檢測(cè)病毒抗原檢測(cè)病毒核酸中和檢測(cè)IgM檢測(cè)IgG4倍以上升高細(xì)胞因子檢測(cè)1/19/202359特異性檢測(cè)病毒特異性檢測(cè)抗病毒免疫012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION核酸檢測(cè)模板擴(kuò)增－PCR、NASBA、TMA、HDA、SDA探針擴(kuò)增－RCA、Expar信號(hào)擴(kuò)增－Invader、雜交1/19/202361RealtimePCR1/19/2023625’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PCR-probe1/19/2023635’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission1/19/202364RQExcitationXRQQRExcitationEmissionMolecularBeacon1/19/2023651/19/202366Taqman1/19/202367Scorpionprimers5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQRAmplifluorProbe1/19/202368Isothermal-NASBA1/19/202369Isothermal-TMA1/19/2023701/19/2023國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心福建省醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)研究中心71Amplification1/19/2023國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心福建省醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)研究中心72Detection(TMA)AE：吖啶酯InhighpHIsothermal-RCA1/19/202373Isothermal-HDA1/19/202374Isothermal-SDA1/19/202375Isothermal-Expar1/19/2023761/19/202377012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION病毒感染的特異性預(yù)防

主動(dòng)免疫–疫苗被動(dòng)免疫–免疫球蛋白1/19/202379HEV疫苗可預(yù)防的28種疾病Smallpox天花Rabies狂犬Cholera霍亂Typhoidfever傷寒Diphteria白喉Pert