分子生物學(xué)-原核表達調(diào)控

二、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控1.轉(zhuǎn)錄調(diào)控的原理2.原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的操縱子學(xué)說乳糖操縱子與負控誘導(dǎo)系統(tǒng)色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)其他操縱子轉(zhuǎn)錄水平上的其他調(diào)控方式

4.色氨酸操縱子(trpoperon)

trp體系參與生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的調(diào)控。色氨酸合成主要分5步完成，有7個基因參與整個合成過程。操縱子中各基因功能：trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶，trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，trpF編碼異構(gòu)酶，trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶，trpA和trpB則分別編碼色氨酸合酶的α和β亞基。在許多細菌中，trpE和trpG，trpC和trpB分別融合成一個基因，產(chǎn)生具有雙重功能的蛋白質(zhì)。分枝酸先在鄰氨基苯甲酸合成酶作用下生成鄰氨基苯甲酸，此后先與磷酸核糖焦磷酸中的磷酸核糖形成磷酸核糖鄰氨基苯甲酸，經(jīng)重排、脫羧和關(guān)環(huán)形成吲哚甘油磷酸，然后在色氨酸合成酶催化下先脫去3-磷酸甘油醛生成吲哚，最后吲哚與一個絲氨酸縮合形成色氨酸。

E.Coli中Trp操縱子的結(jié)構(gòu)

5個色氨酸合成代謝相關(guān)酶的基因構(gòu)成一個操縱子。合成Trp所需要酶類的5個基因E、D、C、B、A頭尾相接串連排列組成結(jié)構(gòu)基因群；受其上游的啟動子P和操縱子O的調(diào)控。這些基因只有在缺乏Trp時，才被有效表達。

trp操縱子

基因產(chǎn)物是5個酶，分別是鄰氨基苯甲酸合成酶(E)、鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(D)、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶-吲哚甘油磷酸合成酶(C)、色氨酸合成酶β(B)和色氨酸合成酶α(A)。色氨酸操縱元的調(diào)控機制

trp操縱元——屬阻遏型操縱元，主要調(diào)控一系列用于色氨酸合成代謝的酶蛋白的轉(zhuǎn)錄合成。

色氨酸操縱子通常處于開放狀態(tài)，其輔阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合而阻遏轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)色氨酸合成過多時，色氨酸作為輔阻遏物與輔阻遏蛋白結(jié)合而形成阻遏蛋白，后者與操縱基因結(jié)合而使基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。

4.1輔阻遏蛋白的負調(diào)控與lac操縱子的調(diào)控不同的是，控制Trp操縱子的阻遏蛋白的效應(yīng)物（Trp）不是一個誘導(dǎo)物（inducer）,而是一個輔阻遏物（corepressor）。也就是說，Trp操縱子的調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物（阻遏物蛋白）無活性，不能與操縱基因結(jié)合；當(dāng)Trp存在時，它與阻遏物蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)該蛋白構(gòu)象變化，能夠結(jié)合在操縱基因上并阻止轉(zhuǎn)錄。調(diào)控基因trpR的位置遠離P-O-結(jié)構(gòu)基因群，在其自身的啟動子作用下，以組成型方式低水平表達調(diào)控蛋白R’；R’并無活性。當(dāng)提供足夠的Trp時，Trp與R’結(jié)合使其構(gòu)象改變而成為活性形式R，R可與操縱基因O特異性結(jié)合，阻遏結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，R的阻遏能力僅為lacI產(chǎn)物的1/1000。trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠。后者位于大腸桿菌染色體圖上25分鐘處，而前者則位于90分鐘處。在位于65分鐘處還有一個trpS（色氨酸t(yī)RNA合成酶），它與攜帶有色氨酸的tRNATrp共同參與trp操縱子的調(diào)控作用。trpS(色氨酰tRNA合成酶)trpa當(dāng)有足夠的Trp時，操縱子自動關(guān)閉。細菌直接利用外界的Trp。缺乏Trp時，Trp操縱子被打開，5個結(jié)構(gòu)基因表達，產(chǎn)生3個酶催化分支酸合成為Trp。這是一種負性調(diào)控，操縱子通常是開放轉(zhuǎn)錄的。當(dāng)有效應(yīng)物(Trp)作用時，誘導(dǎo)使阻遏蛋白R’構(gòu)象發(fā)生變化，能夠結(jié)合于操縱基因，則阻遏轉(zhuǎn)錄。4.2色氨酸操縱子的衰減調(diào)控研究表明色氨酸操縱子存在兩種機制的調(diào)控。如果trp操縱子只受trpR編碼的阻遏物調(diào)控，那么在缺乏或存在色氨酸時，trpR突變使trp操縱子表達的酶量應(yīng)該是相同的?？墒牵趖rpR缺失突變體中，培養(yǎng)基中缺乏色氨酸比有色氨酸存在時操縱子的表達水平更高，說明色氨酸操縱子除受阻遏物調(diào)控外，還受另一機制的調(diào)控。4.2.1弱化子與前導(dǎo)肽當(dāng)阻遏物對trp操縱子的阻遏作用被解除，但細胞內(nèi)仍有一定濃度的色氨酸時，第二種調(diào)控機制使trp操縱子的轉(zhuǎn)錄在抵達trpE之前被提前終止，這種現(xiàn)象稱為弱化作用（attenuation），DNA中導(dǎo)致mRNA合成提前終止的一段序列稱為弱化子（attenuator）。弱化作用產(chǎn)生的關(guān)鍵在于trpmRNA的前導(dǎo)區(qū)。在Trp操縱子Ptrp-O與trpE間有一段162bp的先導(dǎo)序列(leadingsequence,L)。在L內(nèi)有一段123~150bp的序列，它在轉(zhuǎn)錄起始后可調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程的進行。這段堿基序列如果缺失，trp基因表達可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個區(qū)域終止，產(chǎn)生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄。這個區(qū)域被稱為弱化子，該區(qū)mRNA可通過自我配對形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。

弱化子的共同特點是某些外部因素控制著弱化子的發(fā)夾形成。即形成終止子結(jié)構(gòu)。弱化子為結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄設(shè)了一道關(guān)卡。前導(dǎo)肽分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，能產(chǎn)生一個含有14個氨基酸的多肽，這個假設(shè)的多肽被稱為前導(dǎo)肽。在前導(dǎo)序列的第10和第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。組氨酸操縱子含有7個相鄰的組氨酸密碼子，苯丙氨酸操縱子也有7個苯丙氨酸密碼子，這些密碼子參與了操縱子中的轉(zhuǎn)錄弱化機制。

先導(dǎo)序列包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，它編碼了一個14個AA的先導(dǎo)肽。編碼先導(dǎo)肽的第10、11位是相鄰的兩個Trp密碼子。先導(dǎo)序列含有3對反向重復(fù)序列(A=1+2；B=2+3；C=3+4)。如果B(2+3)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，A和C都不能再形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。AC當(dāng)A（1+2）形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，B就不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，卻有利于C（3+4）生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。BC后是poly(U)，即C實際是一個終止子，如果轉(zhuǎn)錄mRNA時它形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，就能使RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄而從mRNA上脫離下來。mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定，引人注目的是其中4個分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進行堿基配對，有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補配對。終止構(gòu)型抗終止構(gòu)型

無色氨酸時操縱子基因開始轉(zhuǎn)錄，此后轉(zhuǎn)錄速率受轉(zhuǎn)錄弱化機制(attenuation)調(diào)節(jié)。在結(jié)構(gòu)基因與O

之間有一衰減子區(qū)域，該區(qū)域含有4段特殊的序列，高濃度色氨酸時能形成不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止信號，RNA聚合酶脫落，轉(zhuǎn)錄終止。低濃度色氨酸時則不能形成轉(zhuǎn)錄終止信號，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)。4.2.2弱化子的負調(diào)控原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時進行，在Trp未達到能起阻遏作用的濃度時，從Ptrp起始轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶沿DNA轉(zhuǎn)錄合成mRNA，同時核糖體結(jié)合在mRNA上開始翻譯。當(dāng)Trp水平高時，已經(jīng)起始了轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶在特定的位點暫停，接著在到達trpE之前終止。但當(dāng)Trp缺乏時，聚合酶不終止，而是通讀trp基因。Trp合成酶類的量與Trp濃度呈負相關(guān)，這種調(diào)控現(xiàn)象與Trp操縱子特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

Trp濃度低時，生成Trp-tRNAtrp量少，使核糖體停止在mRNA上的Trp密碼子UGG處；使A（1與2）不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；而2+3形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，阻止了3+4生成終止子；RNApol可沿DNA繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，trp操縱子就處于開放狀態(tài)。Trp濃度高時，trp-tRNAtrp濃度隨之升高，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達2區(qū)，使2+3不能配對，而3+4區(qū)可以自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止，結(jié)構(gòu)基因被關(guān)閉而不再合成色氨酸。Trp的存在對終止轉(zhuǎn)錄是有效的，弱化子僅允許約10%的RNA聚合酶通過。缺乏Trp時，弱化子允許所有的聚合酶通過。當(dāng)所有的氨基酸都不足時，核糖體翻譯移動的速度就更慢，甚至不能占據(jù)A的序列，結(jié)果有利于1+2和3+4發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，于是RNApol停止轉(zhuǎn)錄。色氨酸操縱子代表了一種衰減調(diào)控模式在trp操縱子上，弱化子的轉(zhuǎn)錄終止作用取決于色氨酸的濃度。a.高色氨酸條件下，序列3和4配對，形成轉(zhuǎn)錄終止發(fā)夾。b.低色氨酸條件下，核糖體停在色氨酸密碼子附近，序列1被核糖體覆蓋，序列2和3配對，因此阻止了3、4之間形成轉(zhuǎn)錄終止發(fā)夾。c沒有蛋白合成時，如果沒有核糖體起始先導(dǎo)肽的翻譯，序列1、2形成發(fā)夾，阻止了2、3發(fā)夾的形成，允許序列3、4形成轉(zhuǎn)錄終止發(fā)夾，酶不表達。

實驗證據(jù)轉(zhuǎn)錄弱化理論得到了大量實驗證據(jù)的支持：（1）影響區(qū)段3和區(qū)段4二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的突變以及改變區(qū)段4后面一串U的突變都會降低弱化子的終止作用，增加trp操縱子的表達，這與終止子的突變效應(yīng)是一樣的；（2）相反，影響影響區(qū)段2和3配對的突變，則增加弱化子的弱化作用；（3）如果前導(dǎo)肽的起始密碼子發(fā)生錯義突變，前導(dǎo)肽的翻譯就不能起始，有利于前導(dǎo)RNA形成1－2、3－4二級結(jié)構(gòu)，則轉(zhuǎn)錄必定在弱化子處終止。

有實驗證明，在不加色氨酸的培養(yǎng)基中，trpmRNA的合成仍然受到部分阻遏，現(xiàn)在一般認為，野生型細胞中同時存在著有活性和無活性的阻遏物，培養(yǎng)基中色氨酸濃度的變化，能夠使這兩種阻遏物間的平衡發(fā)生傾斜，最終做出關(guān)閉或啟動trp操縱子的決定，從而維持一定的色氨酸含量。阻遏與弱化作用的協(xié)調(diào)細菌中為什么需要弱化子系統(tǒng)呢？一種可能是阻遏物從有活性向無活性的轉(zhuǎn)變速度較慢，需要一個能更快地做出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)纳彼崴??；蛘撸趸酉到y(tǒng)主要是對外源色氨酸濃度做出反應(yīng)。外源色氨酸濃度很低的信號雖然足以引起trp操縱子的去阻遏作用，但是這個信號還不足以很快引發(fā)內(nèi)源色氨酸的合成。在這種環(huán)境下，弱化子就通過抗終止的方法來增加trp基因表達，從而提高內(nèi)源色氨酸濃度。

那么為什么還要有阻遏體系呢？沒有阻遏體系，只有弱化，似乎也可以調(diào)節(jié)色氨酸酶系的合成。目前認為阻遏物的作用是當(dāng)有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導(dǎo)mRNA的合成，它使這個合成系統(tǒng)更加經(jīng)濟。事實上，自然界存在著不同類型的合成體系，例如組氨酸操縱子擁有在功能上與trp操縱子完全相同的弱化子結(jié)構(gòu)，但沒有阻遏物，它的表達完全受弱化子調(diào)節(jié)。在trp操縱子中，阻遏蛋白的負調(diào)控起到粗調(diào)的作用，而衰減子起到細調(diào)的作用。細菌通過弱化作用彌補阻遏作用的不足，因為阻遏作用只能使轉(zhuǎn)錄不起始，而對于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，只能通過弱化作用使之中途停頓下來。阻遏作用的信號是細胞內(nèi)色氨酸的多少，弱化作用的信號則是細胞內(nèi)載有色氨酸的tRNA的多少，通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進行。細菌細胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。

5.其他操縱子5.1半乳糖操縱子(galactoseoperon)Galactoseoperon包括3個結(jié)構(gòu)基因（galE、galT、galk）表達產(chǎn)生的異構(gòu)酶(UDP-galactose-4-epimerase)、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶(galactosetransferase)和半乳糖激酶(galactosekinase)參與Gal代謝，形成UDPGal，用于合成細胞壁。5.1.1半乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)及特點激酶KUDP轉(zhuǎn)移酶T差向異構(gòu)酶E半乳糖半乳糖+葡萄糖半乳糖-1-磷酸乳糖UDP-葡萄糖UDP-半乳糖葡萄糖UDP轉(zhuǎn)移酶T細胞壁當(dāng)細胞中缺乏葡萄糖時，這些酶可使Gal轉(zhuǎn)變成G-1-P，供細菌生命活動需要。gal操縱子屬于誘導(dǎo)型操縱子。調(diào)節(jié)基因galR距離結(jié)構(gòu)基因galE、T、K及操縱區(qū)O等很遠，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。Gal是gal操縱子的誘導(dǎo)物。Gal的跨膜運輸需要galP基因產(chǎn)物的參與。gal操縱子的特點：

①它有兩個啟動子，相距僅5bp,每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點S1和S2。其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉(zhuǎn)錄；②有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游-67—53（OE），一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部（OI）。③cAMP-CAP位點在-24~-50之間。gal操縱子有兩個相互重疊的啟動子，可從兩個不同的起始點（S1、S2）開始轉(zhuǎn)錄；gal操縱子有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游-67~53，另一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。galP1的轉(zhuǎn)錄起始依賴于CRP，屬于CRP激活型，因此只有培養(yǎng)基中無葡萄糖時才能進行轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖和CRP。高水平的CRP能抑制galP2的轉(zhuǎn)錄起始，屬于CRP抑制型。因此它完全依賴于葡萄糖。即：當(dāng)有CRP時，轉(zhuǎn)錄從S1開始，當(dāng)無CRP時，轉(zhuǎn)錄從S2開始。葡萄糖存在時若無Gal，GalR可結(jié)合在galOE和OI上，并相互作用形成環(huán)，從S1、S2的轉(zhuǎn)錄都被阻遏。當(dāng)gal存在時，GalR的阻遏解除，但由于葡萄糖的存在，P1不能啟動而只有P2低水平啟動轉(zhuǎn)錄。無葡萄糖存在；若存在gal，gal的阻遏解除，依賴于CRP的P1高水平表達產(chǎn)生利用Gal的酶類，以Gal為能源和碳源。cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1區(qū)復(fù)合物形成開鏈構(gòu)象，從而起始基因轉(zhuǎn)錄。同時，由于S2在S1的上游且核苷酸部分重疊，S2與CAP位點靠近，在空間位置上這一復(fù)合物的存在干擾了RNA聚合酶-S2復(fù)合物的形成，抑制了S2起始的轉(zhuǎn)錄。雙啟動子的實驗證據(jù)一類細菌突變株能在無葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶類（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達，由galP1起始轉(zhuǎn)錄）；另一類突變株中g(shù)al基因的表達完全依賴于葡萄糖，培養(yǎng)基中如無葡萄糖存在，這些細菌的gal基因不表達，不合成半乳糖代謝酶類（由galP2起始轉(zhuǎn)錄）。

gal操縱子雙轉(zhuǎn)錄起點的作用半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關(guān)的UDPGal是E.coli細胞壁合成的前體。在無外源Gal時，UDPGal是通過半乳糖差向異構(gòu)酶（galE基因的產(chǎn)物）的作用由UDP-葡萄糖合成的。因此細胞必須一直能夠合成差向異構(gòu)酶才能正常生活。

現(xiàn)在設(shè)想只有g(shù)alP1一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就不能合成異構(gòu)酶。假如唯一的啟動子是galP2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，這無疑是一種浪費。無論從必要性或經(jīng)濟性考慮，都需要一個不依賴于cAMP-CAP的啟動子（galP2）進行本底水平的永久型合成，以及一個依賴于cAMP-CRP的啟動子（galP1)對高水平合成進行調(diào)節(jié)。阿拉伯糖操縱子的結(jié)構(gòu)及特點阿拉伯糖是另一個可以為代謝提供碳源的五碳糖。在大腸桿菌中阿拉伯糖的降解需要3個基因：araB、araA和araD，分別編碼3個酶：araB基因編碼核酮糖激酶(ribulokinase)，araA編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinoseisomerase)，araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase)。另外還有兩個遠離此基因簇的基因araE和araF，負責(zé)將阿拉伯糖運入細胞。5.2阿拉伯糖操縱子(arabinoseoperon)與araBAD相鄰的是一個復(fù)合的啟動子區(qū)域、兩個操縱區(qū)和一個調(diào)節(jié)基因araC，這個AraC蛋白同時顯示正、負調(diào)節(jié)因子的功能。araBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進行的。

AraC蛋白的正、負調(diào)節(jié)作用araBADmRNA的合成需要一個有功能的AraC蛋白，這個蛋白與誘導(dǎo)物阿拉伯糖結(jié)合后才誘導(dǎo)araBAD基因表達。當(dāng)AraC蛋白以正調(diào)控因子作用時，起始轉(zhuǎn)錄還需要cAMP-CRP的共同參與。AraC蛋白作為PBAD活性正、負調(diào)節(jié)因子的雙重功能是通過該蛋白的兩種異構(gòu)體來實現(xiàn)的。Pr是起阻遏作用的形式，可以與現(xiàn)在尚未鑒定的類操縱區(qū)位點相結(jié)合，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動子結(jié)合進行調(diào)節(jié)。在沒有阿拉伯糖時，Pr形式占優(yōu)勢；一旦有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結(jié)合，使平衡趨向于Pi形式。這樣，阿拉伯糖的誘導(dǎo)作用就可以解釋為阿拉伯糖與Pr的結(jié)合，使Pr離開它的結(jié)合位點，然后，產(chǎn)生大量的Pi，并與啟動子結(jié)合。葡萄糖與阿拉伯糖對ara操縱子活性的影響培養(yǎng)基中含有葡萄糖，沒有阿拉伯糖。因為培養(yǎng)基中含有葡萄糖，所以cAMP-CAP沒有與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白處于Pr形式并與A位點結(jié)合，RNA聚合酶很少再與Pc結(jié)合，araC