功能基因組學

20世紀人類科技史上的三大創(chuàng)舉40年代第一顆原子彈爆炸60年代人類首次登上月球90年代人類基因組計劃基因組(genome)泛指一個有生命體、病毒或細胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。

一、基因組學概念及范疇基因組學(genomics)是指發(fā)展和應用DNA制圖、測序新技術(shù)以及計算機程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能。基因組學包括3個不同的亞領域結(jié)構(gòu)基因組學(structuralgenomics)功能基因組學(functionalgenomics)比較基因組學(comparativegenomics)基因組學概念結(jié)構(gòu)基因組學結(jié)構(gòu)基因組學(structuralgenomics)是通過人類基因組計劃HGP的實施來完成的。HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測定，因此HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學范疇。人類基因組計劃（HGP）的研究內(nèi)容遺傳圖的分析（Geneticmap）

確定基因或DNA標記在染色體上的相對位置與遺傳距離

物理圖的分析（Physicalmap）

以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標簽位點）為路標，以堿基對作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。將各種標記直接定位在基因庫中的某個位點上。轉(zhuǎn)錄圖的分析（Transcriptionalmap）

分離純化mRNA或cDNA比較分析蛋白質(zhì)的編碼能力，使人們有可能系統(tǒng)、全面地從mRNA水平了解特定細胞、組織或器官的基因表達模式，并解釋其生理屬性，深入認識細胞生長、發(fā)育、分化、衰老和疾病發(fā)生的機制。序列圖分析（sequencemap）測定由30億個核苷酸組成的全部序列。人類基因組的核苷酸序列圖其實是分子水平上最高層次，最詳盡的物理圖。二、后基因組學的研究（Postgenomeera）人類基因組計劃完成之后，生物學被重新劃分為前基因組和后基因組兩部分。科學研究已開始進入“后基因組時代”。主要是開展功能基因組學和蛋白質(zhì)組學的研究。有科學家形象地說道：即使基因測序全部完成，也只好像是一本沒有姓名，只有號碼的電話簿?！昂蠡蚪M時代”的最終目標，是要把深奧的DNA語言變成一本大基因百科全書。功能基因組學功能基因組學，后基因組學(Postgenomics)：利用結(jié)構(gòu)基因組學提供的信息和產(chǎn)物通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能生物學研究從對單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向?qū)Χ鄠€基因或蛋白質(zhì)同時進行系統(tǒng)的研究。功能基因組學的目的基因功能發(fā)現(xiàn)基因表達分析及突變檢測從基因組整體水平上對基因的活動規(guī)律進行闡述。1、功能基因組學的研究內(nèi)容基因功能的研究基因組的表達及時空調(diào)控的研究蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學的研究基因組多樣性的研究模式生物體的基因組研究2、功能基因組學的研究方法單核苷酸多態(tài)性（SNPs）分析表達序列標簽（ESTs）分析基因表達的序列分析（SAGE）DNA芯片RNA干擾蛋白質(zhì)組學（雙向電泳—質(zhì)譜）單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotidepolymorphism,SNP)定義單核苷酸多態(tài)性是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置發(fā)生了轉(zhuǎn)換，顛換，缺失和插入等變化而引起的序列多態(tài)性，而且任何一等位基因在群體中的頻率不小于1%。SNPs在GC序列上出現(xiàn)最為頻繁，以C-T最多見。據(jù)估計SNPs在人類基因組的平均密度為1/1000，數(shù)量巨大，因此多態(tài)性信息含量高。DNA（分子）標記限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）簡單序列長度多態(tài)性（simplesequenecelengthpolymorphisrns,SSLPs)小衛(wèi)星序列：（MinisatelliteDNA）微衛(wèi)星序列：（MicrosatelliteDNA,MS）單核苷酸多態(tài)性標記（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）SNPs與表型編碼區(qū)內(nèi)的SNPs可能改變氨基酸殘基的種類，這可以直接影響蛋白質(zhì)的功能；外顯子和內(nèi)含子相連部位的SNPs可能改變外顯子一內(nèi)含子的剪接，影響蛋白質(zhì)的修飾；在調(diào)控區(qū)域內(nèi)的SNPs可以改變mRNA的表達水平和穩(wěn)定性。以SNPs為基礎研究人類疾病遺傳學家尋找致病基因的基本策略是：連鎖分析和關聯(lián)分析。連鎖分析是確定兩個遺傳標記或者更多遺傳標記之間的物理關系，以確定致病基因的位置。關聯(lián)分析是研究某種遺傳標記與某一特定表型的之間的關系表達序列標簽（Expressedsequencetags,EST）ESTs是從已建好的cDNA文庫中隨機取出一個克隆，從5’末端或3’末端對插入的cDNA片段進行一輪單向自動測序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。EST的應用構(gòu)建遺傳學圖譜遺傳圖譜、物理圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜,是基因組計劃要獲得的3張遺傳學圖譜。構(gòu)建染色體物理圖譜需要大量的單拷貝短序列作為界標,由于大多數(shù)基因是單拷貝的,所以可以用EST序列充當序列標簽位點(STS)。而且,由于EST序列是轉(zhuǎn)錄基因的產(chǎn)物,可用來直接構(gòu)建遺傳連鎖圖,通過與基因組文庫序列比較,可以提供內(nèi)含子結(jié)構(gòu),可選擇剪切方式,轉(zhuǎn)錄起始和終止位點等信息。EST的應用分離和鑒定新基因

將所獲得EST用生物信息學方法與公共數(shù)據(jù)庫中的已知序列比對,可以迅速準確的確定基因的功能。由于在構(gòu)建cDNA文庫時要盡可能的選用全長cDNA,所以一旦發(fā)現(xiàn)有價值的EST,可以找到對應的克隆,獲得的全長cDNA可以直接用于轉(zhuǎn)基因等研究。利用EST方法進行發(fā)現(xiàn)、分離基因的研究,不僅是人類基因組研究的熱點,而且也是模式生物基因研究的重要內(nèi)容。EST的應用基因差異表達的研究通過比較不同發(fā)育時期和每個發(fā)育時期不同組織器官cDNA文庫中的EST信息,可以繪出該物種在特定時間和空間的基因表達的發(fā)育順序譜。因為一個基因表達的峰度越高,它被隨機調(diào)出而被測序的次數(shù)越多,而比較眾多cDNA文庫的EST數(shù)據(jù)可以推測1個基因在不同組織或器官中表達的差異。EST的應用基因的定位克隆

以EST為重要來源的染色體物理圖譜進一步方便了對抗病基因的連續(xù)分析,可將抗病基因定位在染色體中的狹小區(qū)段,縮小抗病基因的篩選范圍。同時,EST標記是功能序列區(qū)的標記,處于目標基因的范圍內(nèi),是目標基因的編碼區(qū),因此EST標記是分離功能基因的有效標簽,大大提高了克隆基因的效率。EST的應用比較基因組學的研究

利用EST序列中古老保守序列來研究生物中間的進化關系,可以避免選擇家系、構(gòu)建群體、大量的統(tǒng)計分析等周期,長而繁瑣的遺傳圖譜的制作過程。此外,利用基因組較小的模式生物所獲得的已知功能基因,用復雜基因組生物,如人和動植物的EST比較,從而推測,待測EST的功能,已經(jīng)成為比較基因組學研究的重要內(nèi)容。EST的應用用于制備cDNA芯片

芯片技術(shù),是目前高通量篩選EST的有效方法。隨著更多基因組計劃的開展和更多已知功能基因的積累,將來無需進行測序,只通過DNA芯片技術(shù)就可以研究基因的功能。EST計劃的實施不僅獲得了關于表達基因的信息資源同時也獲得了大量已經(jīng)經(jīng)過功能鑒定了的cDNA克隆資源而這些資源都是功能基因組研究所不可缺少的。SAGE（serialsanalysisofgeneexpression）基因表達系列分析

1995年，JohsHopkins大學的分子腫瘤學家Kinzler和Vogelstein及其同事建立了SAGE方法.SAGE技術(shù)的主要理論依據(jù)：來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標簽（tag）；通過簡單的方法將這些標簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯(lián)體進行測序，并應用SAGE軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據(jù)標簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達豐度（abundance）。1.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合。2.合成雙鏈cDNA。

3.用NlaⅢ酶消化形成一條鏈末端有標簽的產(chǎn)物。

4.將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5.用MmeI切割每一個樣品形成約60bp的標簽。SAGE步驟6.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標簽。

7.PCR擴增。8.用NlaⅢ酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標簽。9.連接片斷形成串聯(lián)體。

10.克隆到pZErO-1+里，并測序。

SAGE實例DNA芯片DNA芯片（DNAchip）也叫基因芯片（Genechip）是指在固相載體（玻璃，硅等）上有序地，高密度地（點間距小于500μm）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探針）。這些被固定的分子探針在基質(zhì)上形成高密度的DNA微陣列，因此DNA芯片又叫DNA微矩陣（DNAMicroarray）DNA芯片的基本原理基因芯片技術(shù)是建立在Southernblot基礎之上的，可以說它是Southernblot的改進和發(fā)展，它的原理是：變性DNA加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過堿基互補形成雙鏈雜交分子。基因芯片基本操作流程制備總RNAmRNA經(jīng)RT-PCR用Cy3（正常對照組）和Cy5（實驗組）熒光標記目的基因，得到cDNA探針

混合標記探針與表達譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交掃描分析雜交結(jié)果

結(jié)論基因芯片基因芯片的應用生物信息學的工具基因相關性研究基因功能藥物設計和開發(fā)潛在反義試劑開發(fā)個體化醫(yī)療身份識別基因診斷其他與生物有關的領域特定基因檢測突變檢測多態(tài)性分析基因表達譜例：腫瘤診斷國外有一臨床病人表現(xiàn)出典型的白血病癥狀，但形態(tài)學檢測不典型，根據(jù)相關檢查，診斷為AML（acutemyeloidleukaemia,急性骨髓白血?。委煄讉€月后未見好轉(zhuǎn)。后來用DNA芯片與病人骨髓的mRNA雜交，結(jié)果顯示AML和ALL(acutelymphoblasticleukaemia急性成淋巴細胞白血病)基因都表達較低，而在數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，編碼原肌球蛋白的基因表達極高，從而確診為肺泡彈狀肌肉瘤，改變治療方案，病情出現(xiàn)緩解。RNAi（RNAinterference，RNA干擾）通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達的現(xiàn)象，存在于從低等的線蟲到人類培養(yǎng)細胞等多種有機體。

RNAi相關技術(shù)是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的有效工具，可用于功能基因組學研究以及基因治療等臨床用途。RNAi研究史十幾年前，RichJorgensen在矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默七年前，researchersGuo和Kemphues注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-1

基因的表達；三年后，F(xiàn)ire等注入雙鏈RNA到線蟲中發(fā)現(xiàn)比注入單鏈更有效，隨后發(fā)展了通過RNAi進行線蟲基因敲除的策略。近年來，顯微注射，基因槍，基因工程手段誘導RNAi也成為果蠅研究中的反向遺傳學工具。2001年Elbashir等《Nature》上首次報道通過21個核苷酸的siRNA成功地在哺乳動物培養(yǎng)細胞中誘導特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細胞中也取得了成功。RNAi機制模式圖核心技術(shù)：

siRNA（SmallinterferingRNA）的設計與合成siRNA的標記siRNA的轉(zhuǎn)染RNAi的檢測（核酸及蛋白水平）RNA干擾技術(shù)1.siRNA的一般結(jié)構(gòu)：哺乳動物：21-23bpdsRNA

其它生物：更長的片段dTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的設計2.設計流程（選擇siRNA靶位點）從轉(zhuǎn)錄本