鐵過(guò)載對(duì)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老的改變,人體生理學(xué)論文

鐵過(guò)載對(duì)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老的改變,人體生理學(xué)論文摘要：目的研究鐵過(guò)載對(duì)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老的影響。方式方法取大鼠原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予100μmol/L枸櫞酸鐵銨(FAC)處理24h,對(duì)照組用不含F(xiàn)AC的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性評(píng)估細(xì)胞衰老狀況。結(jié)果與對(duì)照組相比，在100μmol/LFAC作用24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組原代神經(jīng)元衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加(t=18,P0.05)。結(jié)論鐵過(guò)載可誘導(dǎo)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老。本文關(guān)鍵詞語(yǔ):神經(jīng)元;鐵;細(xì)胞衰老;Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofironoverloadonthesenescenceofprimaryneurons.MethodsPrimaryventralmidbrainneuronsofratswereculturedinvitroandwererandomlydividedintocontrolgroupandexperimentalgroup.Theexperimentalgroupwastreatedwithferricammoniumcitrate(FAC)(100μmol/L)for24h,andthecontrolgroupweretreatedwiththemediumwithoutFAC.Cellsenescencewasevaluatedbasedontheactivityofβ-galactosidaseassociatedwithcellsenescence.ResultsComparedwiththecontrolgroup,theexperimentalgrouphadasignificantincreaseintheactivityofβ-galactosidaseassociatedwithcellsenescenceafterbeingtreatedby100μmol/LFACfor24h(t=18,P0.05).ConclusionIronoverloadcaninducethesenescenceofprimaryneurons.Keyword：neurons;iron;cellsenescence;帕金森病是世界第二大神經(jīng)退行性疾病，典型病理特征是黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，α-突觸核蛋白的聚集和鐵沉積[1,2,3]。越來(lái)越多的證據(jù)表示清楚鐵沉積會(huì)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡，鐵過(guò)載是神經(jīng)元死亡的誘因此非結(jié)果[4,5]。除了能夠通過(guò)氧化損傷途徑促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元死亡，大量的鐵能夠促進(jìn)α-突觸核蛋白的表示出[6],可以從蛋白翻譯后水平影響其磷酸化[7,8],促進(jìn)蛋白聚積，進(jìn)而損傷神經(jīng)元[9,10]。隨著年齡增加，多種器官發(fā)生鐵聚積，腦內(nèi)鐵沉積隨之不斷加劇[11],過(guò)量鐵導(dǎo)致的氧化水平升高又會(huì)進(jìn)一步引發(fā)鐵蛋白釋放[12]。細(xì)胞衰老是細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞周期而處于停滯狀態(tài)，是防止細(xì)胞不受調(diào)控持續(xù)增殖的機(jī)制，主要表現(xiàn)為炎性因子的分泌、β-半乳糖苷酶活性增加以及衰老相關(guān)分泌表型[13]。隨著年齡的增加，衰老細(xì)胞在體內(nèi)逐步累積，衰老的細(xì)胞部分喪失生理活性，影響機(jī)體正常生理功能。在主要的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病以及亨廷頓癥病人腦內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了衰老的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[14,15]。在疾病狀態(tài)下的神經(jīng)元也會(huì)出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在γ射線(xiàn)誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老模型中，衰老細(xì)胞的鐵水平是正常細(xì)胞的30倍之多[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)毒素百草枯可誘發(fā)與帕金森病相關(guān)的細(xì)胞衰老和神經(jīng)病理特征[17]。近期有研究表示清楚，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化的多巴胺能神經(jīng)元也觀察到衰老表型[18]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，衰老細(xì)胞內(nèi)鐵含量明顯升高，衰老導(dǎo)致的鐵攝取和儲(chǔ)存異常會(huì)影響鐵介導(dǎo)的細(xì)胞死亡經(jīng)過(guò)[11,16],衰老的細(xì)胞若不及時(shí)去除，會(huì)進(jìn)一步損傷周?chē)?xì)胞[19]。為了討論鐵過(guò)載能否引發(fā)神經(jīng)元衰老進(jìn)而引發(fā)死亡丟失，本研究用枸櫞酸鐵銨(FAC)對(duì)原代神經(jīng)元進(jìn)行處理，檢測(cè)其衰老發(fā)生情況。1、材料和方式方法1.1、實(shí)驗(yàn)材料FAC(Sigma),胎牛血清(依科賽(澳洲源)),SA-β-Gal染色試劑盒(CST,9860S),DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco,1210038)以及DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone,SH30023.01),D-多聚賴(lài)氨酸、B27(Gibco),β-阿糖胞苷、青鏈霉素混合液、0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(索萊寶)和倒置顯微鏡(OLYMPUS,IX73)。1.2、實(shí)驗(yàn)方式方法1.2.1、中腦腹側(cè)原代神經(jīng)元培養(yǎng)將深度麻醉的孕12～14d的Wistar大鼠用醫(yī)用乙醇噴灑消毒后，用手術(shù)剪沿大鼠的腹中線(xiàn)剪開(kāi)至腹腔完全暴露，用鑷子取出串珠樣胚胎，放在預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)液中，迅速轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上。用尖鑷將胎鼠剝離出來(lái)，先在解剖顯微鏡下將中腦組織塊取出轉(zhuǎn)移至新鮮的DMEM培養(yǎng)液中，再在鏡下修剪掉多余組織塊和血管膜，保存蝴蝶狀腹側(cè)，參加適量胰蛋白酶，置37℃培養(yǎng)箱中孵育消化，5min后參加終止液終止消化。用1mL移液槍輕柔地吹打盡量使組織塊分散，靜置片刻后汲取上清至50mL離心管中，重新參加新鮮的DMEM培養(yǎng)液5mL,重復(fù)上述步驟3次。將上清以1000r/min離心5min后棄上清，參加含有B27的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，輕輕吹打成均勻的單細(xì)胞懸液，接種到12孔板上，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1d后更換一半培養(yǎng)液，此后每隔2d更換新鮮培養(yǎng)液，7d后成熟的神經(jīng)元可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)β-阿糖胞苷處理，神經(jīng)元純度達(dá)90%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。1.2.2、實(shí)驗(yàn)分組及處理將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞參加100μmol/L的FAC作用24h,對(duì)照組細(xì)胞用不含F(xiàn)AC的低血清培養(yǎng)液進(jìn)行處理。1.2.3、細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)應(yīng)用SA-β-Gal染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性。FAC處理24h后，用0.01mol/LPBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，每次30s,每孔細(xì)胞參加1mL固定液，室溫固定15min,用0.01mol/LPBS沖洗細(xì)胞2次，每次30s,棄掉洗液，每孔參加1.5mL染色液，用封口膜密封細(xì)胞培養(yǎng)板防止染液蒸發(fā)，置37℃恒溫箱中孵育過(guò)夜。用0.01mol/LPBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，每次30s,在奧林巴斯倒置顯微鏡明場(chǎng)下觀察并獲取圖像，陽(yáng)性細(xì)胞顯示為亮藍(lán)色。1.3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以x?±s表示，兩獨(dú)立樣本比擬采用t檢驗(yàn)。以P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果與對(duì)照組相比擬，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶陽(yáng)性染色明顯加強(qiáng)(圖1),對(duì)照組著色細(xì)胞比例為(2.077±0.440)%,實(shí)驗(yàn)組著色細(xì)胞比例為(25.200±1.164)%,兩組比擬差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3,t=18,P0.05)。提示100μmol/LFAC作用于原代神經(jīng)元24h,細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加，表示清楚100μmol/LFAC能夠誘導(dǎo)原代神經(jīng)元發(fā)生衰老。3、討論鐵是維持生命活動(dòng)的關(guān)鍵微量金屬元素之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，介入腦內(nèi)線(xiàn)粒體呼吸、軸突髓鞘化以及神經(jīng)遞質(zhì)的構(gòu)成[12]。鐵作為活潑金屬，可以以催化多種生化反響，增加氧化應(yīng)激，過(guò)量的活性氧損傷細(xì)胞膜、核酸及蛋白構(gòu)造，引發(fā)細(xì)胞毒性[20]。枸櫞酸是鐵的天然螯合劑，枸櫞酸鐵為枸櫞酸與鐵離子構(gòu)成的鐵鹽，是美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的補(bǔ)鐵藥劑[21]。本實(shí)驗(yàn)所用的FAC是枸櫞酸鐵更具溶解性的形式，添加FAC可模擬高鐵環(huán)境，以討論鐵過(guò)載對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞衰老的影響。對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞的衰老研究，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的活化是常用的生物學(xué)特征[22,23]。β-半乳糖苷酶是溶酶體水解酶，通常在pH值為4時(shí)表現(xiàn)出活性；而在衰老的細(xì)胞中，pH值為6時(shí)有活性，利用β-半乳糖苷酶底物進(jìn)行染色，就能從正常細(xì)胞中區(qū)分出衰老細(xì)胞[24]。本實(shí)驗(yàn)采用100μmol/LFAC處理原代神經(jīng)元24h,觀察到β-半乳糖苷酶的陽(yáng)性染色明顯加強(qiáng)，提示細(xì)胞衰老的發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)表示清楚，鐵穩(wěn)態(tài)失衡促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展[25,26,27,28],鐵沉積是帕金森病一個(gè)主要的病理特征，也是人們普遍以為的發(fā)病誘因。有研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)載會(huì)增加氧化復(fù)原水平[29,30],促進(jìn)α-突觸核蛋白的聚積，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，如二價(jià)鐵能夠通過(guò)與α-突觸核蛋白mRNA的C端ASP-121、Asn-122、Glu-123位結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)α-突觸核蛋白表示出，可以以在轉(zhuǎn)錄后水平介入蛋白磷酸化等修飾經(jīng)過(guò)，促進(jìn)蛋白聚集發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[31,32],并且α-突觸核蛋白寡聚經(jīng)過(guò)產(chǎn)生活性氧是鐵依靠性的[33]。鐵過(guò)載增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平可能是誘導(dǎo)衰老的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，鐵過(guò)載會(huì)誘發(fā)神經(jīng)元衰老，這為后續(xù)進(jìn)行神經(jīng)元變性死亡研究提供了新的思路。但處于衰老狀態(tài)的神經(jīng)元細(xì)胞是通過(guò)何種通路逐步死亡丟失，神經(jīng)元衰老與當(dāng)前已經(jīng)知道凋亡、壞死和鐵死亡之間能否存在因果或先后關(guān)系，衰老在神經(jīng)元變性死亡經(jīng)過(guò)中的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究討論。圖1光學(xué)顯微鏡下衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色檢查A:對(duì)照組(20倍);B:實(shí)驗(yàn)組(20倍);C:對(duì)照組(40倍);D:實(shí)驗(yàn)組(40倍)。以下為參考文獻(xiàn)[1]HENY,LANGLEYJ,HUDDLESTONDE,etal.Increasediron-depositioninlateral-ventralsubstantianigraparscompacta:apromisingneuroimagingmarkerforParkinsonsdisease[J].NeurolmageClinical,2020,28:102391.[2]ANHD,ZENGXY.NIUTF,etal.QuantifyingirondepositionwithinthesubstantianigraofParkinsonsdiseasebyquantitativesuscepibilitymapping[J].JournaloftheNeurologicalSciences.2021,386:46-52.[3]PRZEDBORSKIS.Thetwo-centuryourneyofParkinsondiseaseresearch[J]NatureReviewsNeuroscience,2021,18(4).251-259.[4]NDAYISABAA,KAINDLSTORFERC,WENNINGGK.Ironinneurodegeneration-causeorconsequence[J]?FrontiersinNeuroscience,2022,13:180.[5]PIETRACUPAS,MARTIN-BASTIDAA,PICCINIP.IronmetabolismanditsdetectionthroughMRIinparkinsoniandisorders:asystematicreview[J]NeurologicalSciences2021,38(12):2095-2101.[6]ZHOUZD,TANEKlronregulatoryprotein(IRP)-ironresponsiveelement(IRE)signalingpathwayinhumanneurodegenerativediseases[J]MolecularNeurodegeneration,2021,12(1):75.[7]TAKAHASHIM,KOLW,KULATHINGALJ,etal.Oxidativestress-inducedphosphorylation,degradationandaggregationofa-synucleinarelinkedtoupregulatedCK2andcathepsinD[J]EuropeanJournalofNeuroscience,2007,26(4):863-874.[8]LINGORP,CARBONIE,KOCHJCAlpha-synucleinandiron:twokeysunlockingParkinsonsdisease[J].JournalofNeuralTransmission(ViennaAustria:1996),2021,124(8):973-981.[9]JIANGH,SONGN,JIAOQ,etal.ronpathophysiologyinParkinsondiseases[J].AdvancesinExperimentalMedicineandBiology,2022,1173:45-66.[10]LIWJ,JIANGH,SONGN,etal.Dose-andtime-dependentalpha-synucleinaggregationinducedbyferricironinSK-N-SHells[J].NeuroscienceBulletin,.2018,26(3):205-210.[11]WARDRJ.,ZUCCAFA,DUYNJH,etal.Theroleofironinbrainageingandneurodegenerativedisorders[J].TheLancetNeurology,2020,13(10):1045-1060.[12]ZUCCAFA.SEGURA-AGUILARJ,FERRARIE,etal.Interactionsofiron,dopamineandneuromelaninpathwaysinbrainagingandParkinsonsdisease[J].ProgressinNeurobiology.2021,155:96-119.[13]BAKERDJ,CHILDSBG,DURIKM,etal.Naturallyoccurringp16(Ink4a)-positivecellsshortenhealthylifespan[J].Nature,2021,530(7589):184-189.[14]BAKERDJ,PETERSENRC.Cellularsenescenceinbrainagingandneurodegenerativediseases.evidenceandperspectives[J]TheJournalofClinicalInvestiation,2021,128(4):1208-1216.[15]KANGC,XUQK,MARTINTD,etal.TheDNAdamageresponseinducesinflammationandsenescencebyinhibitingautophagyofGATA4[J]Science(NewYork,NY),2021,349(6255);aaa5612.[16]MASALDANS,CLATWORTHYSAS,GAMELLC,etal.lronaccumulationinsenescentcellsiscoupledwithimpairedfrritinophagyandinhibitionofferroptosis[J]Redoxbiology,2021,14:100-115.[17]CHINTASJ,WOODSG,DEMARIAM,etal.CellularsenescenceisinducedbytheenvironmentalneurotoxinparaquatandcontributestoneuropathologylinkedtoParkinsonsdisease[J].Cellreports,2021,22(4):930-940.[18]RIESSLANDM,KOLISNYKB,KIMTW,etal.LossofSATB1inducesp21-dependentcellularsenescenceinpostmitoticdopaminergicneurons[J]CellStemCell,2022,25(4):514-530.e8.[19]NELSONG,WORDSWORTHJ,WANGCF,etal.Asenescentcellbystandereffect:senescence-inducedsenescencel[J.AgingCell,2020.11(2)-.345-349.[20]YOULH,LIF,WANGL,etal.BrainironaccumulationexacerbatesthepathogenesisofMPTP-inducedParkinsonsdisease[J]Neuroscience,2021,284:234-246[21]WANGHB,LIZ,NIUJL.etal.Antiviraleffectsoffrricammoniumcitrate[J]CellDiscovery,2021,4:14.[22]MARTINEZ-CUEC,RUEDAN.Cellularsenescenceinneurodegenerativediseases[J].FrontiersinCellularNeuroscience,2020,14:16.[23]MATTSONMP,ARUMUGAMTV.Hallmarksofbrainaging:adaptiveandpathologicalmodificationbymetabolicstates[J].CellMetabolism,.2021.27(6)-1176-1199.[24]NORENHOOTENN,EVANSMK.Techniquestoinduceandquantifycellularsenescence[J].JournalofVisualizedExperiments,2021(123);55533[25]XUJZ,JIAZH,KNUTSONMD,etal.lmpairedironstatusinagingresearch[J]InternationalJournalofMolecularSciences,2020,13(2).2368-2386.[26]SHILQ,HUANGC,LUOQH,etal.TheassociationofironandthepathologiesofParkinsonsdiseasesinMPTP/MPP+-inducedneuronaldegenerationinnon-humanprimatesandincellculture[J]FrontiersinAgingNeuroscience,2022.11:215[27]WANGT,XUSF,FANYG,etal.lronpathophysiologyinAlzheimersdiseases[J]AdvancesinExperimentalMedicineandBiology,2022.1173:67-104.[28]BAGWE-PARABS,KAURG.Moleculartargetsandtherapeuticinte