EGFP在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)分析 PC

EGFP在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)分析彭超222008371042030

西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715摘要：腫瘤基因靶向治療已經(jīng)成為目前腫瘤治療研究最活躍的領(lǐng)域之一，其目的是在不損傷正常細(xì)胞的前提下，進(jìn)行選擇性殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。目前已有大量靶分子被分離和鑒定，如端粒酶、血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等，其中端粒酶是目前所發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤最廣譜的分子標(biāo)記，在絕大多數(shù)惡性腫瘤中被激活，而在正常體細(xì)胞中一般為陰性表達(dá)。近年來研究人員利用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)基因在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞中高效表達(dá)的特點(diǎn)，構(gòu)建用hTERT啟動子調(diào)控其它抗腫瘤基因的表達(dá)載體，靶向破壞腫瘤細(xì)胞已取得了較大進(jìn)展。由于慢病毒載體具有可感染細(xì)胞并整合DNA序列的、可轉(zhuǎn)移較大的基因片段等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過構(gòu)建由hTERT基因啟動子介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因表達(dá)的慢病毒載體,并轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,檢測該啟動子在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞中eGFP的表達(dá)情況。關(guān)鍵詞：eGFPhTERT腫瘤 TOPO克隆 脂質(zhì)體介導(dǎo)法第一部分文獻(xiàn)綜述靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成與凋亡功能的失調(diào)密切相關(guān)，提出腫瘤的發(fā)生可能是腫瘤細(xì)胞異常增殖和其凋亡調(diào)控功能受到抑制共同作用的結(jié)果。一些研究人員利用hTERT啟動子的腫瘤特異性，在其下游連接凋亡相關(guān)的抑癌基因或細(xì)胞因子，導(dǎo)入端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞，從而靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，已取得良好效果［7］。Caspases是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。Yang等［8］利用構(gòu)建的hTERT/re-Caspase-3系統(tǒng)，同時轉(zhuǎn)染端粒酶陽性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1、結(jié)腸癌細(xì)胞HRT-18、胃癌細(xì)胞MGC和端粒酶陰性的正常上皮細(xì)胞Hacat，孵育48h后，熒光顯微鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞呈典型的核固縮、核碎裂、核溶解的凋亡形態(tài)；流式細(xì)胞儀分析顯示，三種端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞(CNE1、HRT-18和MGC)凋亡率為15%~20%，而端粒酶陰性的Hacat僅為1.5%~3.5%；動物試驗將hTERT/re-Caspase-3直接注射在裸鼠腫瘤內(nèi)，以不含Caspase-3的hTERT/SEAP為對照，連續(xù)7d后觀察發(fā)現(xiàn)，hTERT/re-Caspase-3能顯著抑制裸鼠腫瘤的生長，證實了hTERT/re-Caspase-3的體內(nèi)外靶向抗腫瘤作用。Jacob等［9］構(gòu)建的hTERT基因啟動子驅(qū)動的促凋亡基因TRAIL的表達(dá)載體，也同樣證實了其可靶向性誘導(dǎo)端粒酶陽性的胰腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。靶向介導(dǎo)自殺基因抑瘤作用自殺基因又稱前藥敏感基因，將自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，可將無毒性藥物前體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝為毒性產(chǎn)物，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。常見的自殺基因包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)基因、細(xì)胞色素P450基因、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)基因、大腸桿菌硝基還原酶(NTR)基因等，其中TK和CD研究最多。體內(nèi)外實驗證實［10］,利用腫瘤特異性hTERT啟動子介導(dǎo)自殺基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，不僅能靶向殺死被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，還可通過旁觀者效應(yīng)殺死周圍未被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞，以及遠(yuǎn)處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞也有凋亡現(xiàn)象。TK可將無毒性的前體藥物更昔洛韋(ganciclovir，GCV)磷酸化為三磷酸更昔洛韋(GCV-TP)，抑制細(xì)胞DNA聚合酶，從而阻斷核酸代謝途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Tang等［11］構(gòu)建hTERT啟動子調(diào)控HSV-TK基因的表達(dá)質(zhì)粒(pGL3-hTp-tk),以pGL3-sv40-tk為對照，同時轉(zhuǎn)染端粒酶陽性的肺癌細(xì)胞A549和端粒酶陰性的正常成纖維細(xì)胞MRC-5，發(fā)現(xiàn)用GCV處理后，pGL3-sv40-tk同時抑制A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞的生長，而pGL3-hTp-tk僅對A549細(xì)胞有抑制作用，對MRC-5細(xì)胞無影響ONTR可將CB1954 單功能烷基化合物轉(zhuǎn)化為劇烈的雙功能烷基化合物，進(jìn)而引起DNA交聯(lián)。Bilsland等［12］構(gòu)建hTERT啟動子調(diào)控NTR基因的載體，轉(zhuǎn)染宮頸癌、卵巢癌等七種腫瘤細(xì)胞和四種正常細(xì)胞，Westernblot分析其僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，且使腫瘤細(xì)胞對CB1954的敏感性增加18倍，而正常細(xì)胞卻不受影響。近年雙自殺基因聯(lián)合治療逐漸成為研究熱點(diǎn)，Kong等［13］構(gòu)建hTERT啟動子調(diào)控下的雙自殺基因(CD-TK融合基因)表達(dá)載體，以hTERT-TK作對照，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞3A0、正常卵巢上皮細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示與單純hTERT-TK/GCV系統(tǒng)相比，聯(lián)合CD-TK/5-FC+GCV雙自殺基因系統(tǒng)對端粒酶陽性的3AO細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)，而對端粒酶陰性的正常卵巢上皮細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞則無殺傷作用。動物實驗也證實了CD-TK融合基因明顯的腫瘤抑制作用。端粒酶和hTERT啟動子端粒是真核生物線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由TTAGGG重復(fù)DNA序列和端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成。端粒酶是位于細(xì)胞核內(nèi)依賴于RNA的逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶，主要功能是合成重復(fù)核苷酸序列并將其添加至染色體末端以維持端粒長度，使細(xì)胞無限增殖，細(xì)胞因此獲得永生化，而永生化是細(xì)胞癌變的實質(zhì)。維持端粒酶活性的必需集團(tuán)有兩個：一是組成性表達(dá)的人端粒酶RNA組分(humantelomeraseRNA，hTR)，二是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)ohTR基因在所有細(xì)胞均有表達(dá)，而hTERT基因僅在大多數(shù)腫瘤和永生化細(xì)胞系中高表達(dá)，在成熟分化的正常體細(xì)胞中其表達(dá)處于關(guān)閉狀態(tài)，因此端粒酶基因特異地轉(zhuǎn)錄并表達(dá)于多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，而在正常組織細(xì)胞中檢測不到端粒酶的活性形式。hTERT作為端粒酶活性的主要調(diào)控亞單位，它的表達(dá)與端粒酶活性呈正相關(guān)。hTERT基因被克隆出后，日益引起學(xué)者重視，已證實hTERT與腫瘤的關(guān)系最為密切，其在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控端粒酶的激活與表達(dá)，是決定端粒酶活性的重要因子［4］，而hTERT高表達(dá)的直接原因是由于其啟動子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)完全開啟，因此hTERT啟動子是腫瘤特異性啟動子，是控制腫瘤細(xì)胞惡性程度的開關(guān)。它的轉(zhuǎn)錄活性在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞中明顯高于陰性細(xì)胞，研究表明利用端粒酶hTERT啟動子靶向基因治療可選擇性地殺死端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞，而對端粒酶陰性的正常細(xì)胞則無影響。目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)普遍認(rèn)為，hTERT啟動子是一新型的、具有腫瘤選擇性的啟動子，是理想的腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。端粒酶與腫瘤診斷自從1994年，Kim開始應(yīng)用一種基于PCR的靈敏的端粒酶檢測方法TRAP來探測人體組織中的端粒酶活性后［8］,Shay等［9］總結(jié)了各種惡性腫瘤組織、癌旁組織、癌前組織及良性腫瘤組織中的端粒酶活性,發(fā)現(xiàn)90%的惡性腫瘤組織的端粒酶活性呈陽性,而癌旁組織的陽性率只有6%,良性腫瘤和癌前組織的陽性率為14%,在正常組織中,除少數(shù)種類外,其陽性率均為0,可見端粒酶活性是惡性腫瘤的一種標(biāo)志，其作為腫瘤標(biāo)志廣泛性和明確性要優(yōu)于Ki267和MIB1。因此，端粒酶檢測，特別是精確定量將有助于腫瘤良惡性的判斷。實施定量PCR技術(shù)、細(xì)針抽吸等方法與傳統(tǒng)的TRAP相結(jié)合檢測端粒酶，其結(jié)果在靈敏度與特異度方面更加可靠，使得利用端粒酶對腫瘤進(jìn)行診斷或分期的可行性提高。然而，端粒酶作為腫瘤診斷的標(biāo)志物也有一定的局限性。由于人體的生殖細(xì)胞、再生細(xì)胞也有一定的端粒酶表達(dá);約20%的腫瘤不表達(dá)端粒酶，正常鼻咽黏膜中端粒酶可呈陽性，故不宜用于鼻咽原位癌診斷［10］;所以利用端粒酶作為腫瘤的診斷乃至治療靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步商榷。第二部分正文引言：為了構(gòu)建由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因啟動子調(diào)控eGFP報告基因的慢病毒載體，觀察eGFP在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。我們將用TOP0克隆的方法將eGFP序列轉(zhuǎn)至UpLenti6/V5D-Top質(zhì)粒上；再用hTERT基因啟動子取代慢病毒載體eGFP上游的CMV啟動子；將重組慢病毒質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入端粒酶陽性的人腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行功能鑒定。使端粒酶陽性的癌細(xì)胞中可以觀測至綠色熒光蛋白表達(dá)。1材料與方法：1.1.1主要材料質(zhì)粒：pEGFP-Nl質(zhì)粒、pLenti6/V5D-Top質(zhì)粒]*0d^ciMinpLenti6/V5-1D-TOPO@6964]*0d^ciMinpLenti6/V5-1D-TOPO@6964bpXNSsV5epitopei囲fpiTTCCOG細(xì)胞：E.coliDH5a菌株、Hela細(xì)胞酶：BspDI、AgeI、BamHI內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq酶其他：膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、陽離子脂質(zhì)體N-[l-2,3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n，n-TrimethylammoniumChloride（DOTMA）和Dioleoylphotidye-thanolamine（DOPE）、1.1.2技術(shù)路線基本表達(dá)EGFP質(zhì)粒更換啟動子或其它調(diào)控元件條件性表達(dá)EGFP質(zhì)粒陽離子脂質(zhì)體腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株條件性表達(dá)EGFP質(zhì)粒陽離子脂質(zhì)體腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株質(zhì)粒DNA+脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)EGFP基因細(xì)胞j-—加入調(diào)控因子熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)1.2方法EGFP基因的擴(kuò)增設(shè)計擴(kuò)增EGFP基因的引物,上游引物:5'-CACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'下游弓I物:5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA3'上游引物含有促進(jìn)目的基因在真核細(xì)胞表達(dá)的Kozak序列CACC,下游引物設(shè)計與TOPO克隆載體的V5標(biāo)簽融合，能形成融合蛋白。以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板擴(kuò)增EGFP基因,PCR反應(yīng)操作為：1）在50ul反應(yīng)體系中分別加入：MiniQH2O210XPCRbuffer37.5ul5ul25mM MgCl23ul10mM dNTPmix1ul引物1（10》M）1ul引物2（10》M）1ulTaq(2to5units/ul)0.5ul

模板(DNA)模板(DNA)終體積為2)短暫離心混勻后94°C94C62C72C30-35個循環(huán)72C4C50ul放入PCR儀中，反應(yīng)程序如下：5min（時間根據(jù)模板來確定）45S45S（退火溫度和時間根據(jù)引物來確定）lmin（時間根據(jù)擴(kuò)增片段長度來確定）（循環(huán)次數(shù)根據(jù)擴(kuò)增目的來確定）7-10min保存（一般不保存，保存對PCR儀損壞大）反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并拍照記錄實驗結(jié)果。切下含目的片段的瓊脂塊，用于DNA片段回收。pLenti6V5D-TOPO-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建1?將PCR產(chǎn)物低熔點(diǎn)瓊脂糖（1%）電泳，紫外燈下切膠，放入離心管，65C水浴,至膠融化;將離心管移至37C培養(yǎng)箱中，加4uL融化的膠入TOPO克隆反應(yīng)液20uL（內(nèi)含plenti6/V5D-TOPO線形的定向TOPO克隆慢病毒載體）；3.37C孵育TOPO克隆5min-10min,使膠融化，將2uL-4uL反應(yīng)液加入200uLE.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻；置冰上5min-30min；42C30s，勿搖；迅速置冰上；加入250uLSOC培養(yǎng)基；37C慢搖孵育1h;涂板，LB培養(yǎng)基（含50ug/mL-100ug/mLampicillin和50ug/mLblasti-cidin）過夜，篩選陽性克隆。pLenti6V5D-TOPO-EGFP質(zhì)粒的提取挑單菌落邙日性克隆）接種于LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)（37C,200rpm）8h,再將此活化的菌液取400ul于20ml含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中（1/50），250rpm， 37C培養(yǎng)2h,即可獲得經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液；柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加A500pl的平衡液BL,12,000rpm（~13,400Xg）離心分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當(dāng)天處理過的柱子）取1-2ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機(jī)，12,000rpm（~13,400Xg）離心1分鐘，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。向留有菌體沉淀的離心管中加入250pl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。向離心管中加入250pl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6—8次使菌體充分裂解。注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組NA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片斷。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。向離心管中加入350pl溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm（~13,400Xg）離心0分鐘，此時在離心管底部形成沉淀。注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm（~13,400Xg）離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱SP3放入收集管中?？蛇x步驟：向吸附柱CP3中加入500卩l(xiāng)去蛋白液PD,12,000rpm（~13,400Xg）離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。hTERT啟動子片段依據(jù)NCBI人pEGFP—N3基因編碼區(qū)全長序列，自行設(shè)計針對人EGFP基因編碼區(qū)全長序列兩端的引物（含BamHI和BspDI酶切位點(diǎn)），并委托上海Invitrogen公司合成。其引物序列為設(shè)計擴(kuò)增hTERT啟動子的引物，上游引物：5’-TAAACTAGTAATGTCGAATAACGC-3下游引物：5’-TATCTCGAGGAATGAATCACGGTAG-3Primer片段的回收純化第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在15ml漂洗液PW中加入60ml無水乙醇!所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。柱平衡步驟：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500pl平衡液BL，12,000rpm（~13,400Xg）離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干凈的離心管中，稱取重量。3?向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN；當(dāng)回收的目的片段＜150bp或瓊脂糖凝膠濃度＞2%時，建議使用6倍體積溶膠液PN（如凝膠重為0.1g,其體積可視為100pl,依此類推）。50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊完全溶解（若膠塊的體積過大，可事先將膠塊切成碎塊）。注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合DNA的能力較弱。將上一步所得溶液加入一個吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2分鐘，12,000rpm（~13,400Xg）離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。注意：吸附柱容積為800pl，若樣品體積大于800pl可分批加入。向吸附柱CA2中加入700pl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm（~13,400Xg）離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于鹽敏感的實驗，例如平末端連接實驗或直接測序，建議PW加入后靜置2-5分鐘再離心。向吸附柱CA2中加入500pl漂洗液PW，12,000rpm（~13,400Xg）離心30-60秒，倒掉廢液。將吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm（~13,400Xg）離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實驗8．將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB,(如果回收的目的片段＞10kb,則洗脫緩沖液EB應(yīng)置于65-70°C水浴預(yù)熱)，室溫放置2分鐘°12,000rpm(~13,400Xg)離心2分鐘收集DNA溶液。1.2.6hTERT取代pLenti6V5D-TOPO-EGFP質(zhì)粒上的CMV啟動子用BspDI、BamHI內(nèi)切酶內(nèi)切hTERT啟動子PCR片段和pLenti6V5D-TOPO-EGFP質(zhì)粒。提純后，將回收片段至于一1.5mlEP管中，加入T4連接酶，22C連接16h。分離純化重組后的質(zhì)粒。1.2.7Hela細(xì)胞的培養(yǎng)解凍操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。將新鮮培養(yǎng)基置于37C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10?1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1m1解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。細(xì)胞復(fù)蘇取6ml培養(yǎng)基于離心管將融化的凍存細(xì)胞懸液加入離心管離心1200rpm，6min，去上清加3ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶，加血清，塞上膠塞貼好標(biāo)簽，倒置顯微鏡上觀察并記錄，放入培養(yǎng)箱。細(xì)胞換液倒掉舊培養(yǎng)液，先加入3ml培養(yǎng)基，再加入0.3ml血清細(xì)胞凍存或傳代將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以凍存液重懸細(xì)胞至終濃度約106/ml。以每管1?2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。1.2.8脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng):取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1~2X105個細(xì)胞培養(yǎng)液，37°CC0培養(yǎng)至40%~60%匯合時(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。 2轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10MgDNA，終量100》L,B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50》gLR，終量100》L,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。3?轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。4?轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37C溫箱置6~24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.9表達(dá)產(chǎn)物檢測將培養(yǎng)瓶至于倒置熒光顯微鏡下，用紫外線照射觀察。并記錄結(jié)果。參考文獻(xiàn)【1】｛余松濤,楊應(yīng)斌,史春夢,陳陵,湯旭東,黎川,師紅磊,李長珠,李寧,王國珍,吳玉云,房殿春，楊仕明.端粒酶hTERT亞單位啟動子靶向性慢病毒對腫瘤活體實時顯像的實驗研究[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,4-12.【2】張景澤，楊智勇，丁鵬?端端粒酶抑制劑用于腫瘤治療的研究新進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志，2009，29：903-904.【3】李淑慧，余忠華?人端粒酶RNA基因與腫瘤的相