酶工程第四章

第四章固定化酶與固定化細(xì)胞第一節(jié)概述第二節(jié)固定化方法第三節(jié)固定化酶性質(zhì)第四節(jié)固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第五節(jié)固定化酶的應(yīng)用一游離酶在應(yīng)用中所存在的問(wèn)題1酶在水溶液中參與反應(yīng)，難以回收酶，導(dǎo)致應(yīng)用生產(chǎn)成本高，而且應(yīng)用過(guò)程難于連續(xù)化；此外酶蛋白殘留給產(chǎn)物的分離純化帶來(lái)困難。2酶的穩(wěn)定性一般較差，易受環(huán)境影響（物理因素、化學(xué)因素、生物因素），活力下降甚至失活。

第一節(jié)概述二．固定化酶概況

定義:凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復(fù)地使用的酶。

發(fā)現(xiàn)：1916年Nelson和Griffin，骨粉吸附轉(zhuǎn)化酶研究：1953年，Grubhofer和Schloith，重氮化樹(shù)酯，羧肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶

工業(yè)化：1969年千鈿一郎，固定氨基?；?，D,L-氨基酸不溶于水——水不溶性酶，固相酶和固著酶1971年，第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議，“固定化酶”名稱三固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)重復(fù)使用載體昂貴產(chǎn)物易于分離特性會(huì)發(fā)生改變穩(wěn)定性提高部分酶活力喪失連續(xù)加工輔因子再生及多酶反應(yīng)存在問(wèn)題四固定化菌體

用一定的方法對(duì)菌體或菌體碎片進(jìn)行固定，直接應(yīng)用菌體或菌體碎片中的酶或酶系進(jìn)行催化反應(yīng)。

五固定化細(xì)胞定義：凡限制在一定的空間范圍內(nèi)，并能連續(xù)反復(fù)地使用的能進(jìn)行生命活動(dòng)細(xì)胞。五固定化菌體或細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)省去酶分離過(guò)程細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)輔因子再生及多酶反應(yīng)所需酶的分解穩(wěn)定性提高副產(chǎn)物細(xì)胞壁和膜阻礙底物111111111111111和產(chǎn)物的滲透、擴(kuò)散1973年，日本在工業(yè)上成功固定化大腸桿菌菌體，利用菌體中的天門(mén)冬氨酸酶，連續(xù)催化反丁烯二酸為L(zhǎng)-天門(mén)冬氨酸。第二節(jié)固定化方法一固定化方法：吸附法，共價(jià)結(jié)合法，交聯(lián)法，包埋法二載體類型1來(lái)自于自然的有機(jī)載體優(yōu)勢(shì):與酶有很好的相容性多糖類物質(zhì)及其衍生物(多孔,親水)纖維素及其衍生物(DEAE,CM)葡聚糖(Dextran)瓊脂糖(agarose)淀粉(starch)殼聚糖(chitosan)蛋白質(zhì)(明膠gelatin)

2無(wú)機(jī)載體優(yōu)勢(shì):高壓穩(wěn)定性硅載體:多孔玻璃;硅土礦物原料:粘土,斑脫土(火山灰分解成的一種粘土)3無(wú)機(jī)合成載體優(yōu)勢(shì):化學(xué)及機(jī)械穩(wěn)定性高離子交換樹(shù)脂功能基團(tuán)的共聚物三固定化方法1吸附法:通過(guò)弱的相互作用吸附到硅土,粘土,離子交換樹(shù)脂表面,如離子鍵,氫鍵,疏水作用力及靜電等.1）物理吸附定義：使用對(duì)蛋白質(zhì)具有高度吸附能力的硅膠、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纖維素等吸附劑，將酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。優(yōu)點(diǎn)：價(jià)廉，易操作易再生缺點(diǎn)：易泄漏，易受污染靜止法反應(yīng)器上直接吸附法混合浴或振蕩浴吸附法例：高嶺士吸附胰凝乳蛋白酶;皂土吸附過(guò)氧化氫酶,－淀粉酶;纖維素粉吸附糖苷水解酶;火棉膠吸附木瓜蛋白酶，堿性磷酸酶，酯酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。2）離子吸附定義：酶蛋白在解離狀態(tài)下因靜電引力而固著于帶有與酶蛋白電荷相反的離子交換劑上的固定化方法。

主要缺點(diǎn)：離子強(qiáng)度增加或者介質(zhì)pH，溫度改變時(shí)，離子吸附不穩(wěn)定，酶與載體解離。3）疏水吸附N－烷基（疏水）瓊脂糖黃嘌呤氧化酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酯酶、脲酶（疏水性強(qiáng)）。4）親和吸附伴刀豆球蛋白A（利用此蛋白與糖蛋白的專一性結(jié)合）－瓊脂糖吸附糖蛋白。

5）螯合吸附利用酶蛋白上的金屬離子與載體基團(tuán)的螯合吸附。2包埋法1）定義：將酶包裹于凝膠格子或聚合物半透膜微膠囊中的方法。該方法不需要化學(xué)修飾，反應(yīng)條件溫和，適合大多數(shù)酶，粗酶制劑，甚至完整的微生物細(xì)胞。2）根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為格子型包埋法和微膠囊法。

格子型包埋法常用凝膠：聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠，明膠等。為防止包埋固定化后酶從凝膠中泄漏出來(lái)，凝膠孔徑應(yīng)控制在小于酶分子直徑的范圍內(nèi)。因而對(duì)于大分子底物的進(jìn)入和大分子產(chǎn)物的擴(kuò)散出去不利。微膠囊法（半透膜包埋法）定義：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的半透性小球內(nèi)，制成固定化酶。小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，稱為微膠囊。3共價(jià)法

定義：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。優(yōu)點(diǎn)；穩(wěn)定性好缺點(diǎn)：反應(yīng)條件激烈，操作復(fù)雜，控制條件苛刻，相對(duì)酶活力較低。4．交聯(lián)法定義：借助雙功能或多功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶雙官能團(tuán)能試劑：戊二醛，已二胺，順丁烯二酸酐，雙偶氮氮苯優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，可長(zhǎng)時(shí)間使用缺點(diǎn)：交聯(lián)法單用時(shí)，所得到的固定化酶，顆粒小，機(jī)械性能差，酶活性低。常與吸附法或包埋法聯(lián)合作用，制備出酶活性高，機(jī)械強(qiáng)度又好的固定化酶或固定化菌體。第三節(jié)固定化酶性質(zhì)一．穩(wěn)定性儲(chǔ)存和操作過(guò)程中穩(wěn)定性增強(qiáng)，主要表現(xiàn)在：1熱穩(wěn)定性，2蛋白質(zhì)水解酶的抗性，3變性劑的耐受性，4保存期延長(zhǎng)。二．反應(yīng)的最適溫度最適溫度比天然酶高。用CM-纖維素迭氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比游離酶高5～15℃。采用不同固定化材料，最適溫度不同，如氨基?；?，天然酶最適溫度60℃，分別用DEAE-葡聚糖凝膠、DEAE-纖維素固定化的酶的最適溫度分別為72℃和67℃。三．反應(yīng)的最適pH1載體性質(zhì)2產(chǎn)物性質(zhì)微環(huán)境最適pH載體（-）吸引H＋，pH↓偏高載體（＋）吸引OH-，pH↑偏低微環(huán)境最適pH產(chǎn)物（酸性）pH↓偏高產(chǎn)物（堿性）pH↑偏低四.底物特異性底物專一性：由于空間位阻效應(yīng)，固定化酶對(duì)高分子量底物的活性降低，對(duì)低分子量底物的反應(yīng)速率變化不大。五．酶活力活力回收：固定化酶活力/溶液酶活力;相對(duì)活力：固定化酶活力/溶液酶活力-殘留酶活力酶經(jīng)固定化后大部分活力下降！六米氏常數(shù)Km固定化酶的表觀米氏常數(shù)Ｋｍ隨載體的帶電性能而變化。固定化酶催化系統(tǒng)是一種非均相的反應(yīng)系統(tǒng)。以微膠囊包埋法為例，反應(yīng)過(guò)程包括:①底物從反應(yīng)液主體移向載體表面(底物外部擴(kuò)散);②從載體表面移向酶、作用位點(diǎn)(底物內(nèi)部擴(kuò)散);③底物被催化生成產(chǎn)物;④產(chǎn)物從反應(yīng)位點(diǎn)移向載體表面;⑤產(chǎn)物再移至反應(yīng)主體液。第四節(jié)固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一固定化對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響1．空間效應(yīng)

1)構(gòu)象效應(yīng)：酶在固定化過(guò)程中，由于存在酶和載體的相互作用，從而引起酶空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致酶催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變。

2)位阻效應(yīng)（空間障礙）：因載體的存在，給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成了空間障礙，使酶的活性下降。2．分配效應(yīng)1）固定化酶和主體溶液組成固液非均相體系微環(huán)境：固定化酶顆粒附近的環(huán)境宏觀體系：主體溶液體系2）分配效應(yīng)：由于固定化酶載體的親水性、疏水性及靜電作用等引起固定化酶內(nèi)部底物、其他各種效應(yīng)物（H+,OH-離子，溶劑）以及產(chǎn)物在微環(huán)境和宏觀體系之間的不等分配，從而影響酶反應(yīng)速度的現(xiàn)象。3）分配效應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)化：①假定酶被均勻地固定在載體表面，且整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)充分?jǐn)嚢?，混合均勻，排除擴(kuò)散效應(yīng)。荷電載體與荷電溶質(zhì)靜電作用產(chǎn)生的分配效應(yīng)常用分配系數(shù)表示分配系數(shù)ρ=[Si]/[S]Si：代表底物和其他各種效應(yīng)物在微環(huán)境中的局部濃度S：代表底物和其他各種效應(yīng)物在宏觀體系中的總體濃度根據(jù)Boltzmann分配定律，荷電溶質(zhì)在荷電載體微環(huán)境與外部溶液的分配服從分配系數(shù)可表示為：[Si]=ρ[S]

ρ=exp[-ZeΦ/(KBT)]其中，Ze荷電溶質(zhì)的電荷，Φ荷電載體產(chǎn)生的靜電位，KB為Boltzmann常數(shù)，T絕對(duì)溫度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)，分配效應(yīng)僅影響底物濃度分布，酶的動(dòng)力學(xué)方程仍可用米氏方程表示。

V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Vm[S]ρ/(Km+[S]ρ)=Vm[S]/(Kappm+[S])

其中Kappm=Km/ρ上式表明，分配效應(yīng)造成的影響是改變Km。ρ=[Si]/[S]Kappm=Km/ρ（1）當(dāng)載體與底物電荷相同時(shí)，[Si]＜[S]，ρ＜1，Kappm＞Km（2）當(dāng)載體與底物電荷相反時(shí)，

[Si]＞[S]，ρ＞1，Kappm＜Km（3）上述效應(yīng)，通過(guò)提高反應(yīng)系統(tǒng)的離子強(qiáng)度，可減弱或消除（4）采用疏水性載體，如果底物為極性物質(zhì)或電荷性物質(zhì)，則[Si]＜[S]，ρ＜1，Kappm＞Km

如果底物為疏水性物質(zhì)，則[Si]＞[S]，ρ＞1，Kappm＜Km

ρ=exp[-ZeΦ/(KBT)]其中，Ze荷電溶質(zhì)的電荷，Φ荷電載體產(chǎn)生的靜電位，KB為Boltzmann常數(shù)，T絕對(duì)溫度分配效應(yīng)對(duì)H+和OH-的影響：H+和OH-在載體內(nèi)外也呈不等分布。[Hi+]=

[H+]exp[-eΦ/(KBT)]-log[Hi+]=-log{

[H+]exp[-eΦ/(KBT)]}pHi=pH+0.43eΦ/(KBT)ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)lnexpx=xlogexpx=-0.429xpHi微環(huán)境pH宏觀環(huán)境陰離子載體：ΔpH<0ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)陽(yáng)離子載體：ΔpH>0ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)3．?dāng)U散效應(yīng)底物／產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在固定化酶載體內(nèi)外之間的遷移擴(kuò)散速度受到某種限制，造成了不等分布，從而影響反應(yīng)速度。擴(kuò)散效應(yīng)與這些物質(zhì)的分子量大小，載體的結(jié)構(gòu)及酶反應(yīng)性質(zhì)有關(guān)。外擴(kuò)散：底物／產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在宏觀體系與酶顆粒表面間的擴(kuò)散。內(nèi)擴(kuò)散：在多孔性固定化載體內(nèi)，底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在載體顆粒表面與載體內(nèi)的酶活性部位間的擴(kuò)散。外擴(kuò)散效應(yīng)動(dòng)力學(xué)假定1、惰性載體，不考慮分配效應(yīng)的影響2、酶固定于液體不能滲透的固體膜表面上，排除內(nèi)擴(kuò)散效應(yīng)的干擾反應(yīng)過(guò)程：底物從溶液中移向膜表面，底物被酶催化為產(chǎn)物，產(chǎn)物從膜表面移向溶液中。酶促反應(yīng)速度=Vm[Si]/(Km+[Si])底物轉(zhuǎn)移速度=Js([S]-[Si])Js:底物轉(zhuǎn)移系數(shù)當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很快，固定化酶外表面反應(yīng)速率相對(duì)較慢，并成為該反應(yīng)過(guò)程速率的控制步驟時(shí)，則Si=S,此時(shí)反應(yīng)速率:V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Vm[S]/（Km+[S]）(2)當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很慢，固定化酶外表面反應(yīng)速率相對(duì)較快，此時(shí)外擴(kuò)散速率成為反應(yīng)的控制步驟，則Si=0，此時(shí)反應(yīng)速率為:V=Js([S]-[Si])=Js[S]當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)處于恒態(tài)時(shí)，酶促反應(yīng)速度和底物傳遞速度相等。V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Js([S]-[Si])當(dāng)Km》[Si]時(shí)，則：Js([S]-[Si])=Vm[Si]/Km[Si]=Js[S]/（Vm/Km+Js）V=Vm[Si]/Km=[S]/（1/Js+Km/Vm）當(dāng)Js》Vm/Km時(shí)，則：1/Js<<Km/VmV=[S]/（1/Vm/Km）=Vm[S]/Km（酶促反應(yīng)限速）當(dāng)Js《Vm/Km時(shí)，則：1/Js>>Km/VmV=Js[S]（外擴(kuò)散限速）Thiele準(zhǔn)數(shù)（西勒準(zhǔn)數(shù)μ）μ=Vm[S]/Km（酶促反應(yīng)限速）

Js[S]（外擴(kuò)散限速）

=Vm/KmJs西勒準(zhǔn)數(shù)μ反映了外擴(kuò)散效應(yīng)對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，代表外擴(kuò)散效應(yīng)的大小。

μ越小，擴(kuò)散效應(yīng)越??；μ越小，擴(kuò)散效應(yīng)越大；固定化酶受外擴(kuò)散因素的影響，當(dāng)西勒準(zhǔn)數(shù)μ值為下列何種情況時(shí)，是酶促反應(yīng)限速，發(fā)酵效果較好。

A、μ=0.1 B、μ=2 C、μ=10 D、μ=1004．微擾效應(yīng)：由于載體的親水，疏水作用和介電常數(shù)等性質(zhì)，直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力。第五節(jié)固定化酶及細(xì)胞的應(yīng)用一酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用尿激酶激活溶纖維蛋白酶原活性溶纖維蛋白酶溶解纖維蛋白凝塊利用正常細(xì)胞含Ｌ－天冬酰胺合成酶而癌細(xì)胞缺乏Ｌ－天冬酰胺合成酶Ｌ－天冬酰胺Ｌ－天冬氨酸＋ＮＨ３Ｌ－天冬酰胺酶Ｌ－天冬酰胺合成酶二藥用酶的范圍１、由于體內(nèi)有害物質(zhì)的積累所引起的疾病。２、由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所引起的疾病。苯丙氨酸+σ-