HPLC及其在中藥分析中的應(yīng)用

2023/1/311高效液相色譜法

及其在中藥分析中的應(yīng)用

2023/1/312慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液2023/1/313按溶質(zhì)在分離過(guò)程中的原理：吸附色譜分配色譜離子交換色譜體積排阻色譜親和色譜液相色譜的分類2023/1/314按色譜固定相的形式：平板色譜（平面色譜）柱色譜按分離的壓力高壓液相色譜（高效液相色譜）中壓液相色譜常壓液相色譜液相色譜的分類H－dp關(guān)系圖2023/1/316一般也把吸附色譜法稱為液固色譜法。液固色譜法的固定相一般為固體吸附劑，常用的是：碳酸鈣、硅膠、氧化鋁、氧化鎂、活性炭等。其中硅膠最為常用。吸附色譜對(duì)中等分子量的油溶性樣品可獲得最佳的分離，而對(duì)強(qiáng)極性或離子型的樣品，有時(shí)會(huì)發(fā)生不可逆吸附，不能得到滿意的結(jié)果。液固色譜法2023/1/317吸附劑一般為多孔性的物質(zhì)，在它們的表明存在著分散的吸附中心，溶質(zhì)分子和流動(dòng)相分子在吸附劑表面的活性中心上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，同時(shí)不同溶質(zhì)之間和同一溶質(zhì)的不同官能團(tuán)之間液也存在競(jìng)爭(zhēng)。競(jìng)爭(zhēng)的綜合結(jié)果就是形成不同溶質(zhì)在吸附劑表面吸附、解吸平衡?；驹恚?023/1/318吸附解吸X表示溶質(zhì)分子，下標(biāo)m為流動(dòng)相，s為固定相M表示流動(dòng)相分子，下標(biāo)m為流動(dòng)相，s為固定相n為被溶質(zhì)分子取代的流動(dòng)相分子數(shù)目用一個(gè)式子表示如下：2023/1/3110鍵合相固定相：在硅膠的表明用鍵合反應(yīng)把官能基團(tuán)鍵合到表面上，解決固定相流失的問(wèn)題。正相色譜：流動(dòng)相極性比固定相極性小反相色譜：流動(dòng)相極性比固定相極性大鍵合相液相色譜2023/1/3112高效液相色譜——固定相

化學(xué)鍵合相硅膠

octadecylSi-[CH2]17-CH3C18octylSi-[CH2]7-CH3C8cyanopropylSi-[CH2]3-CNCNaminopropylSi-[CH2]3-NH2NH2

2023/1/3113固定相的其他性能

載體的形狀球形無(wú)定形粒徑3~10μm,1.7~2.5μm

孔徑<150?

分析分子量<2000的化合物;>300?

分析分子量>2000的化合物表面積鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度含碳量2023/1/3114一般認(rèn)為鍵合相色譜的機(jī)理分配色譜機(jī)理，也有人認(rèn)為它是吸附色譜機(jī)理，其實(shí)應(yīng)該是有兩種成分在里面，現(xiàn)在又有疏溶劑理論等機(jī)理的提出。高效液相色譜儀器儲(chǔ)存和輸送液體設(shè)備進(jìn)樣系統(tǒng)柱系統(tǒng)檢測(cè)器控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)選擇流動(dòng)相的原則：保持色譜柱的穩(wěn)定性化學(xué)惰性適合所用的檢測(cè)器對(duì)樣品有一定的溶解能力清洗、更換方便、毒性小沸點(diǎn)、粘度等物理性質(zhì)合適反相色譜最常用的流動(dòng)相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等。水－甲醇體系：大約50％水的時(shí)候粘度最大水－乙腈體系：35％水的時(shí)候粘度最大。存放流動(dòng)相的容器一定要惰性的，并且有機(jī)溶劑要避光。輸液泵要求流量平穩(wěn),可以調(diào)節(jié)的流量范圍寬，耐高壓。一般是柱塞往復(fù)泵。2023/1/31212023/1/3122流動(dòng)相的混合輸入和洗脫方式離線混合配制濾過(guò)脫氣

在線混合低壓在線混合高壓在線混合洗脫等度洗脫梯度洗脫2023/1/3123高效液相色譜儀器——泵系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括手動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)進(jìn)樣無(wú)論手動(dòng)進(jìn)樣還是自動(dòng)進(jìn)樣，都要通過(guò)六通閥。六通閥進(jìn)樣是高壓系統(tǒng)的需要，既不影響系統(tǒng)的正常運(yùn)行又能夠讓樣品進(jìn)到系統(tǒng)中去。2023/1/31252023/1/3126高效液相色譜儀器——進(jìn)樣器2023/1/3127反相鍵合相色譜柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。柱溫箱的溫度控制要求比較精確，因?yàn)榱黧w的粘度受溫度的影響較大。柱系統(tǒng)包括色譜柱和柱溫箱2023/1/3128測(cè)量原理不同分類：光學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器電學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器熱學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)器2023/1/3129紫外－可見(jiàn)光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器光學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器：2023/1/3130高效液相色譜儀器——檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器有三種類型：固定波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器：低壓汞燈提供固定254nm或280nm紫外光?？勺兌嗖ㄩL(zhǎng)檢測(cè)器：氘燈做光源，光柵分光光二極管陣列檢測(cè)器photo－diode－arraydetector（PDAD，PDA,DAD）：鎢燈和氘燈組合光源，進(jìn)入檢測(cè)池的不是單色光，而是一段紫外波長(zhǎng)上的光。PDA可以輔助定性。DAD檢測(cè)器3D圖示差折光檢測(cè)器（refractiveindexdetectorRID）：溶液的折射率等于溶劑及其中所含各組分溶質(zhì)的折射率與其各自的摩爾分?jǐn)?shù)的乘積之和。RID是通用型的檢測(cè)器，但是靈敏度不高。RID不能用于梯度洗脫。2023/1/3134蒸發(fā)光散射檢測(cè)器2023/1/3135安培檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器庫(kù)侖檢測(cè)器介電常數(shù)檢測(cè)器極譜檢測(cè)器電學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)器：2023/1/3136完成數(shù)據(jù)采集和對(duì)儀器的控制。工作站：2023/1/3137超高效液相色譜儀（UPLC）超高效液相色譜是分離科學(xué)中的一個(gè)全新類別，它給實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)了新奇而強(qiáng)大的能力。UPLC?借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。2023/1/3138高效液相色譜法在藥典中的應(yīng)用項(xiàng)目2000版2005版含量測(cè)定1095272023/1/3139HPLC與TLC比較(2005版)含量測(cè)定TLC-SCHPLC藥材和提取物15175中成藥353522023/1/3140HPLC在中藥質(zhì)量分析和檢測(cè)中的應(yīng)用有效成分、指標(biāo)成分的檢測(cè)；雜質(zhì)或有關(guān)物質(zhì)檢查；添加物或有害殘留物質(zhì)的檢測(cè)；中藥指紋譜分析2023/1/3141有效成分、指標(biāo)成分的檢測(cè)

人參皂苷的檢測(cè)2023/1/3142Flavones,Flavanones,andFlavanoneGlycosides

PeakIdentification

1.

Naringin

2.

Neohesperidin

3.

Myricetin

4.

Quercetin

5.

Naringenin

6.

KaempferolColumn:AlltimaC18,3μm,100x4.6mm

MobilePhase:A:50mMPotassiumPhosphate,pH2.5B:ACN

Gradient:(Time,%B)(0,20)(15,40)

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat280nm

Ginkgolides

PeakIdentification

1.

GinkgolideJ

2.

GinkgolideC

3.

GinkgolideA

4.

GinkgolideB

Column:NucleosilC18,5μm,250x2.1mm

PartNo.C-6000B

MobilePhase:Water:Methanol:Tetrahydrofuran(70:20:10)

FlowRate:0.2mL/min

Detector:500ELSD

雜質(zhì)或有關(guān)

物質(zhì)檢查添加物或有害殘留物質(zhì)的檢測(cè)

OrganophosphatePesticides

PeakIdentification

1.

MethylParathion

2.

Dichlorvos

3.

Ethoprophos

4.

Azinphos

Column:AlltimaHPEPSC18,5μ,150x4.6mm

MobilePhase:(40:60)methanol:water

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat214nm

添加物或有害殘留物質(zhì)的檢測(cè)

AflatoxinStandards

PeakIdentification

1.

AflatoxinG2

(0.06μg/mL)

2.

AflatoxinG1

(0.20μg/mL)

3.

AflatoxinB2

(0.06μg/mL)

4.

AflatoxinB1

(0.20μg/mL)

Column:InertsilODS-3V,5μ,150x4.6mm

MobilePhase:(50:50)Methanol:WaterFlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat3652023/1/3147中藥指紋譜分析2023/1/31492005版HPLC方法應(yīng)用有效成分\特征成分含量測(cè)定多成分指標(biāo)含量測(cè)定多種檢測(cè)器應(yīng)用2023/1/3150有效成分\特征成分含量測(cè)定2023/1/3151有效成分\特征成分含量測(cè)定多成分指標(biāo)含量測(cè)定2023/1/3153ELSD檢測(cè)方法應(yīng)用銀杏葉提取物中銀杏酸的限量檢查含量樣品以總酸計(jì)ppm以銀杏酸13：0計(jì)ppm樣品10.40.4樣品20.20.2樣品30.40.4樣品43.83.8樣品52728樣品616671662樣品7524522樣品823392333樣品9392390樣品103163152023/1/3156

高效液相色譜法附錄修訂內(nèi)容(2005版)

修訂內(nèi)容和特點(diǎn)：明確了HPLC方法的幾種分離機(jī)制，為分類應(yīng)用提供了基礎(chǔ)；明確了數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（色譜工作站）作為色譜信號(hào)記錄;以較大篇幅增加了色譜柱、檢測(cè)器、流動(dòng)相的內(nèi)容，適應(yīng)快速發(fā)展的、日趨成熟的HPLC技術(shù)的要求。高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測(cè)器，色譜信號(hào)由記錄儀或積分儀記錄。

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。高效液相色譜法的主要分離機(jī)制有吸附、分配、離子交換和排阻作用。 2000版2005版2023/1/3158對(duì)儀器的一般要求(2000版)所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑，用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑，用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。在用紫外吸收檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外分光光度法(附錄ⅤA)項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求。2023/1/3159對(duì)儀器的一般要求(2005版)

1

所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。（1）色譜柱最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對(duì)映異構(gòu)體的拆分分析。2023/1/3160對(duì)儀器的一般要求(2005版)

2

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測(cè)物的保留行為和分離效果?？讖皆?50?以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在300?以上的填料。2023/1/3161對(duì)儀器的一般要求(2005版)3

以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用pH2～8的流動(dòng)相。當(dāng)pH大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH大于8的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當(dāng)需使用pH小于2的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化填充劑等。2023/1/3162對(duì)儀器的一般要求(2005版)4(2)檢測(cè)器最常用的檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器，其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。紫外、二極管陣列、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器屬質(zhì)量型檢測(cè)器，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測(cè)物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄待測(cè)物在規(guī)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測(cè)物的光譜測(cè)定和色譜峰純度的檢查。

2023/1/3163對(duì)儀器的一般要求(2005版)5紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)物的質(zhì)量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器響應(yīng)值與待測(cè)物的質(zhì)量通常并不呈線性關(guān)系，必要時(shí)需對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。如采用紫外檢測(cè)器，所用流動(dòng)相應(yīng)至少符合紫外-可見(jiàn)分光光度法（附錄ⅣA）項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動(dòng)相。2023/1/3164對(duì)儀器的一般要求(2005版)5

（3）流動(dòng)相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常不應(yīng)低于5％，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。

2023/1/3165梯度洗脫

按設(shè)定的時(shí)間程序改變流動(dòng)相系統(tǒng)溶劑組成的比例的洗脫方法.

例:“以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫”(人參)2023/1/3167梯度洗脫以有機(jī)溶劑相作為流動(dòng)相A，以水相（含酸、鹽等）為流動(dòng)相B；使用混合流動(dòng)相的，以含有機(jī)相比例較高的為流動(dòng)相A，含水比例高的為流動(dòng)相B。正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。

正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組成的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。但對(duì)某些品種，必須用特定適用牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求者，可在該品種項(xiàng)下注明。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。

色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括分離度、理論板數(shù)、重復(fù)性和拖尾因子等四個(gè)指標(biāo)。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中更具實(shí)用意義的參數(shù)。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)符合要求。如達(dá)不到要求，可對(duì)色譜分離條件作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱的理論板數(shù)(n)分離度（R）無(wú)論是定性鑒別還是定量分析均要求待測(cè)峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。重復(fù)性拖尾因子

2023/1/3171測(cè)定法（1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某