酶工程第5章pHTIA對酶反應速度的影響

第五章pH、溫度、抑制劑和活化劑對酶反應速度的影響一、pH對酶反應速度的影響二、溫度對酶反應速度的影響三、酶的抑制作用和抑制作用動力學四、酶活化動力學五、酶與配體解離平衡常數(shù)的測定

一、pH對酶反應速度的影響1.酶反應的最適pH

如果在不同pH條件下測定酶反應速度，可得到后圖中的曲線A，最適pH為6.8。如果將酶在不同pH條件下預保溫，然后在pH6.8下測酶反應速度，得到曲線B，說明pH5～8（除了pH6.8附近）使酶可逆失活，當pH回到6.8時，酶活性可完全恢復；當pH

>

8或pH

<

5時，酶發(fā)生了不可逆失活。

酶活性的pH曲線A:在不同pH條件下測定酶反應速度B:在不同pH條件下預保溫，然后在

pH6.8下測酶反應速度一些酶的最適pH和等電點注意最適pH與等電點的差別。與等電點相比，最適pH偏酸的說明要在帶正電荷的情況下工作，最適pH偏堿的說明要在帶負電荷的情況下工作。2.最適pH產(chǎn)生的原理酶分子中含有多種可解離的基團，如－COOH、－NH2、－SH、－OH、咪唑基、胍基等。在最適pH時，各基團的解離狀態(tài)處于使構象正常及活性中心處于結合底物和催化反應的最佳狀態(tài)。如溶菌酶活性中心的兩個酸性氨基酸只有處于Asp52－COO－和Glu35－COOH狀態(tài)下才具有活性。最適pH產(chǎn)生的原理當pH偏離最適pH時，活性中心基團的解離狀態(tài)發(fā)生變化，使酶與底物的結合能力（親和力）下降，催化能力也下降，致使酶活性下降，即保持正確解離狀態(tài)的酶分子比例下降。若pH偏離得太多，導致構象發(fā)生不可逆變化，就會使酶變性失活。底物的解離狀態(tài)也受pH的影響，從而影響到底物與酶的結合及被催化反應。

3.酶的酸堿穩(wěn)定性

一般來說，酶反應的最適pH也是使酶最穩(wěn)定的pH，偏離的pH會使酶分子的構象發(fā)生變化，構象變化的程度與pH偏離的程度及偏離pH處理的時間有關。若pH偏離不多，或處理時間較短，回復到最穩(wěn)定pH后，酶活性可得到恢復，這種恢復也是隨著時間的推移逐漸發(fā)生的。若pH偏離較多或處理的時間較長，則酶發(fā)生不可逆失活。4.pH影響酶反應速度的動力學下面討論幾種不同的解離體系的動力學，并假定在實驗涉及到的pH范圍內(nèi)，酶的構象不發(fā)生變化。

（1）游離酶和ES復合物二者的解離體系A．解離模式假定各可逆過程均迅速達到平衡，ESH→EH＋P為限速反應。B．速度方程的推導用迅速平衡法處理：…①

…②…③…④…⑤速度方程的推導由②⑤得

由⑤得

由①⑤得

由④得

由③得

速度方程的推導

V=k2[EHS][E]0=[E－]＋[EH]＋[EH2+]＋[ES－]＋[EHS]＋[EH2+S]

將式⑥代入上式得

速度方程的推導分子分母同乘以[S]得

分子分母同除以得

速度方程的推導式中k2[E]0=Vm,[H+]既影響VmH+，又影響KmH+。

return1

return2C．作圖法求常數(shù)a．斜率及截距的再作圖法

當Ke1≥100Ke2，Kes1≥100Kes2時，可用本法求Ke1、Ke2、Kes1、Kes2、Ks’、Vm等常數(shù)。將速度方程式取雙倒數(shù)形式得

a．斜率及截距的再作圖法將雙倒數(shù)式中的斜率和截距整理得

斜率＝

截距＝

根據(jù)雙倒數(shù)式，在不同的pH下作直線，每一個pH可以得到一條直線、一個斜率和一個截距。

當[H+]較高時，上面兩式中的項可以忽略不計，剩下的部分為直線方程。以斜率對[H+]作圖得左上圖，以截距對[H+]作圖得右上圖。當[H+]很低時，上面兩式中的[H+]項可以忽略不計，以斜率對作圖得左下圖，以截距對作圖得右下圖。

斜率及截距的再作圖法斜率及截距的再作圖法斜率及截距的再作圖法注意事項從這4個圖中，可得出各個常數(shù)。但如果Ke1和Ke2相近，或Kes1和Kes2相近，或pH居中，則不能忽略任何一項。

此方法要求pKe1和pKe2及pKes1和pKes2的差距≥3.5個pH單位。以對pH作圖可求得pKes1和pKes2以對pH作圖可求得pKe1和pKe2

。

b．Dixon-Webb對數(shù)作圖法Dixon-Webb對數(shù)作圖法根據(jù)速度方程式

當處于低pH條件時，[H+]很大，可以忽略不計，因很大，1也可以省略，故上式可寫成

速度方程式Dixon-Webb對數(shù)作圖法以對pH作圖，得一直線，直線的斜率為1。

Dixon-Webb對數(shù)作圖法在高pH時，[H+]很小，和1都可以忽略不計，上式可寫成

以對pH作圖得一直線，直線的斜率為－1。

Dixon-Webb對數(shù)作圖法在最適pH下，VmH+達到最大，

VmH+＝Vm，

。

以對pH作圖得一水平直線，水平直線與斜率為1的直線的交點的橫坐標為pKes1，水平直線與斜率為－1的直線的交點的橫坐標為pKes2

。

Dixon-Webb對數(shù)作圖法根據(jù)速度方程式，

速度方程式Dixon-Webb對數(shù)作圖法當處于低pH時，[H+]很大，1和可以忽略不計，故上式可寫成

以對pH作圖得一直線，斜率為1。

Dixon-Webb對數(shù)作圖法在高pH時，[H+]很小，1和可以忽略不計，故上式可寫成

以對pH作圖得一直線，斜率為－1。

Dixon-Webb對數(shù)作圖法在最適pH下，

VmH+＝Vm，

K

mH+=Ks’（Ks’＝Km），

，

以對pH作圖，得一水平直線。此水平直線與斜率為1的直線的交點的橫坐標為pKe1，此水平直線與斜率為－1的直線的交點橫坐標為pKe2。此圖與前圖相似。

（2）游離酶的解離體系A．解離模式B．速度方程的推導速度方程的推導[E]0=[E－]+[EH]+[EH2+]+[EHS]V=K2[EHS]根據(jù)上述式子得

其中C．討論a．pH只影響Km值，而不影響Vm

。當[S]>>KmH+

時，V=Vm

。b．在低pH下，[H+]很大，式中的可以忽略不計，于是

此式與競爭性抑制作用的速度方程相似，因此在低pH范圍內(nèi)，H+是一種競爭性抑制劑。

競爭性抑制作用也是只改變Km

，不改變Vm

。

討論c．隨著[H+]的變化，KmH+可達一極小值。將KmH+表達式對[H+]微分得

討論當時，KmH+為極小值。

當KmH+為極小值時，V最大，上式的pH為最適pH。

D．作圖法求常數(shù)與前一種體系的方法相似，按KmH+的表達式作圖。

（3）酶—底物復合物解離體系A．解離模式

B．速度方程或C．討論a．[H+]既影響VmH+，又影響KmH+

。b．當[H+]很大時，式中的可以忽略不計，速度方程可寫成此式與反競爭性作用的速度方程相似，這時[H+]起著反競爭性抑制劑的作用。

D．作圖法求常數(shù)按第一種體系的方法作圖求常數(shù)。

二、溫度對酶反應速度的影響1酶反應的最適溫度

在不同溫度下測酶反應速度，可得出最適溫度。但最適溫度不是酶的特征常數(shù)，當溫度升高時，除了V提高外，酶失活的速度也加快。所以短時間測定時，最適溫度較高，長時間測定時，最適溫度較低。

2酶的熱穩(wěn)定性

大多數(shù)蛋白質(zhì)在50～70℃出現(xiàn)可逆變性（但也與處理時間有關），70～80℃出現(xiàn)不可逆變性。

酶的耐熱性質(zhì)有遺傳上的差異。RNase耐高溫（＞100℃）。

可逆變性和不可逆變性是各種次級鍵被破壞的程度決定的。酶的冷失活可能是亞基間的解聚或錯位引起的。3升溫使酶反應速度增加酶反應與非酶反應相比，能降低活化能Ea。

溫度與反應速度常數(shù)的關系

根據(jù)Arrhenius公式，化學反應速度常數(shù)與溫度的關系可表示為：式中A為頻率因子，它表示單位時間單位體積內(nèi)分子的碰撞次數(shù)；Ea為活化能；k為反應速度常數(shù)。

溫度與反應速度常數(shù)的關系對Arrhenius公式兩邊取自然對數(shù)得：

溫度與反應速度常數(shù)的關系在溫度T1時，在溫度T2時，下式減上式得

式中的R=8.314J/mol/K。

溫度與反應速度常數(shù)的關系根據(jù)，若已知一個溫度下的反應速度常數(shù)及活化能Ea，就可以求另一溫度下的反應速度常數(shù)。若T2比T1高10℃，則稱為Q10（溫度系數(shù)）。Q10大說明溫度對酶反應速度的影響大，Q10小說明溫度對酶反應速度的影響小。對于恒溫動物來說，大部分酶的Q10約為2。

4根據(jù)溫度效應求熱力學常數(shù)（1）求活化能（Arrhenius作圖法）

（1）求活化能在不同溫度下測（同一酶量的）Vm，以對作圖，得一直線，直線的斜率＝Ea＝－2.303×8.314×斜率。

反應中可能有不同的Ea若是復合的反應過程，直線可能會變折線，這說明限速步驟在轉折點發(fā)生了改變，不同的線段代表了不同的限速步驟，各自有不同的Ea。圖C中左側的正斜率線段是溫度太高酶變性所致。

（2）求解離基團的標準焓（Van’tHoff作圖法）根據(jù)Van’tHoff公式：

式中K為基團的解離常數(shù)。積分此式得

測不同溫度下某基團的解離常數(shù)K，按上式以pK對作圖，得一直線，直線的斜率＝，

（2）求解離基團的標準焓2.303×8.314×斜率三、酶的抑制作用和抑制作用動力學

由于某種物質(zhì)與酶相互作用使酶活性下降叫酶的抑制作用，這種物質(zhì)就是抑制劑。而由其他因素如加熱造成的酶活性下降或喪失叫鈍化作用。1酶活性抑制的兩大類型a．可逆抑制作用（reversibleinhibition）抑制劑與酶以非共價鍵結合，用透析、超濾或凝膠過濾等方法可以除去抑制劑，恢復酶活性。b．不可逆抑制作用（irreversibleinhibition）抑制劑與酶以共價鍵結合，用上述物理方法不能除去抑制劑和恢復酶活性。

專一性和非專一性不可逆抑制劑不可逆抑制劑分為專一性和非專一性兩類。專一性不可逆抑制劑僅和活性中心的基團反應，非專一性不可逆抑制劑可以和酶分子各部位的基團反應，甚至可以和幾種不同的基團反應。

2可逆和不可逆抑制作用的判斷

除了用物理方法除去抑制劑恢復酶活性的鑒別方法外，還可以用動力學方法鑒別。1．定量的抑制劑與一定量的酶溶液一起預保溫，隔一段時間后，從中取出不同量的酶——抑制劑混合液，測其最大反應速度Vm，用Vm對所取混合液量作圖。2．在反應系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑，然后加不同的酶量測最大反應速度Vm。以Vm對酶量作圖。

曲線1為對照。曲線2為不可逆抑制劑，因有一部分酶被抑制了，所以有活性的酶濃度下降，直線的斜率下降。曲線3為可逆抑制劑，取少量混合液時，在反應體積一定的條件下，混合液的稀釋程度較大，酶被抑制的比例減少，相對活性較高；取較多混合液時，混合液的稀釋程度較小，酶被抑制的比例較高，相對活性較低。

曲線1為對照。曲線2為不可逆抑制劑，當酶量超過不可逆抑制劑的當量時，才開始出現(xiàn)酶活性，以后增加的酶不受不可逆抑制劑的影響，保持與對照相同的斜率。曲線3為可逆抑制劑,它使酶活性按一定比例下降，此比例與抑制劑濃度有關。無抑制劑時，有抑制劑時，

由于在有抑制劑時，小于1，所以Vm對酶量（[E]0）作圖時，得一斜率較小的直線。

3不可逆抑制作用1非專一性不可逆抑制劑的作用

酰化劑、烷化劑、含有活潑雙鍵的試劑、親電子試劑、氧化劑、還原劑等能夠和酶蛋白中的一些側鏈基團反應，形成共價修飾物。

利用非專一性不可逆抑制劑測定必需基團的數(shù)目非專一性不可逆抑制劑能與活性中心內(nèi)外的基團反應。利用鄒承魯提出的嘗試作圖法，可以判斷出（某種）必需基團的數(shù)目：在測定不可逆抑制劑作用過程中酶活性的剩余分數(shù)的同時，測定被修飾基團的剩余分數(shù)，根據(jù)，按＝1，2，3……分別以對作圖，成直線關系的值即是必需的該種基團的數(shù)目。

專一性不可逆抑制劑的作用專一性不可逆抑制劑分為Ks型和Kcat型兩類。

a．Ks型不可逆抑制劑此類抑制劑與底物結構相似，能與酶的底物結合部位結合，同時此類抑制劑上帶有一個活性基團，可以和附近的相應基團反應，形成共價鍵。

Ks型不可逆抑制劑的特點

Ks型不可逆抑制劑有結合專一性，但沒有反應專一性，即也能與活性中心以外的基團反應。如果抑制劑與活性中心結合的親和力大，與活性中心外結合的親和力小，解離常數(shù)相差三個數(shù)量級以上，這時可以忽略對活性中心以外基團的修飾，有較大的應用價值。

修飾位點的判斷修飾是否發(fā)生在活性中心，可用以下三種方法判斷：a．修飾程度與酶活性的下降是化學計量的，完全修飾后酶活性完全喪失。b．底物、競爭性抑制劑有保護作用。c．采用簡便的方法使酶發(fā)生可逆失活，失活后不被修飾。

下結論時要綜合分析，有時三個條件都滿足了，仍有結論錯誤的可能。

b．Kcat型不可逆抑制劑此類抑制劑既能與活性中心結合，又能被活性中心催化反應，反應后在抑制劑分子上產(chǎn)生活性基團，此活性基團再與活性中心的必需基團反應，產(chǎn)生共價修飾。這類抑制劑的專一性很高，有人稱之為自殺性底物。

4可逆抑制作用動力學競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制競爭性抑制作用（competitiveinhibition）A．競爭性抑制機理

B.競爭性抑制模式B．動力學方程推導a．快速平衡法推導

a．快速平衡法推導b．穩(wěn)態(tài)法推導有3種酶存在形式（[E]、[ES]、[EI]），就要寫出兩個微商等于零的方程式。

由②得

…………②①…………③…………④由①得

將③代入得

又，將④⑤兩式代入得

…………⑤穩(wěn)態(tài)法推導結果快速平衡法推導結果C．討論a．競爭性抑制作用不改變最大反應速度，而是改變Km’（表觀Km），[I]越大則Km’越大。b．一個競爭性抑制劑對酶反應速度的抑制程度，當[S]固定時隨著[I]的增加而加大，當[I]固定時隨著[S]的增加而減小。c．[S]固定時，達到兩種抑制分數(shù)所需的[I]濃度比為一常數(shù)，如，。

競爭性抑制雙曲線圖D．競爭性抑制作圖法在固定[I]時，對作圖可得一直線，其縱軸截距為，橫軸截距為；隨著[I]的增大，表觀Km值（Km’）增大，直線的斜率也增大，但最大反應速度Vm不變。a．雙倒數(shù)作圖法競爭性抑制的雙倒數(shù)作圖b．Hanes-Woolf作圖法將雙倒數(shù)式兩邊同乘以[S]得

以對作圖得一直線，在不同的[I]濃度下，直線的斜率不變，縱軸截距隨[I]的增大而增大，出現(xiàn)一組平行線。

競爭性抑制的Hanes-Woolf作圖E．求競爭性抑制作用中的Ki值a．雙倒數(shù)式的斜率對[I]再作圖根據(jù)雙倒數(shù)方程，在不同[I]下作多條直線，得到多個斜率。

以雙倒數(shù)圖的斜率對[I]作圖，可得一直線，直線的橫軸截距為

。

競爭性抑制雙倒數(shù)圖的斜率對[I]的再作圖b．Km’對[I]的再作圖在不同的[I]下求得相應的Km’值

Km＇

以

Km＇對[I]作圖，可得一直線，直線的橫軸截距為

。

Km’對[I]的再作圖非競爭性抑制作用（noncompetitiveinhibition）A．非競爭性抑制模式

S和I各自獨立地與酶結合，互不影響，只有ES能分解出產(chǎn)物。并且Ks=Ks’，Ki

=Ki’。

B．動力學方程C．討論在非競爭性抑制作用中，I只影響Vm，使之下降，但不影響Km

。

ESI能分解出產(chǎn)物的鑒別法在個別酶反應中，ESI也能分解出產(chǎn)物，但速度較慢。在過量I和一定底物濃度下測酶反應速度，若ESI不能分解出產(chǎn)物，隨著[I]的增加，V趨向于零；若ESI可以分解出產(chǎn)物隨著[I]的增加，V趨向于一定值。

非競爭性抑制中Ki的特殊意義設殘留活性分數(shù)為a，則

此式說明a與[S]無關，并且當[I]＝

Ki時，a＝0.5，說明

Ki等于殘留50%酶活性時的[I]。

D．非競爭性抑制作圖法a．雙倒數(shù)法作圖

式中在固定[I]時，對作圖可得一直線。直線的縱軸截距隨[I]變化，等于，[I]越大，直線的縱軸截距越大，直線的斜率也越大；直線的橫軸截距不變，為。

Return1

return2非競爭性抑制的雙倒數(shù)作圖以對作圖得一直線，隨著[I]的增大，直線的斜率增大，橫軸截距均為

。

b．Hanes-Woolf作圖法將雙倒數(shù)式兩邊同乘以[S]得非競爭性抑制的Hanes-Woolf作圖E．求非競爭性抑制作用中的Ki值a．雙倒數(shù)式的斜率對[I]再作圖

雙倒數(shù)式直線的橫軸截距為。

b．雙倒數(shù)式的截距對[I]再作圖雙倒數(shù)式直線的橫軸截距為。

反競爭性抑制作用（uncompetitioninhibition）A．反競爭性抑制模式在反競爭性抑制作用中，I只與ES結合，只有ES能分解出產(chǎn)物。由于I的存在促進了E和S的結合，所以稱為反競爭性抑制。

反競爭性抑制模式B．動力學方程C．討論反競爭性抑制既降低Vm（成為Vm’），也降低Km（成為Km’）。

在[I]一定時，隨著[S]的增加，抑制分數(shù)也增加。[S]增加抑制分數(shù)i也增加的證明D．反競爭性抑制作圖法a．雙倒數(shù)作圖法

在不同的[I]下，可得一組平行直線。

b．Hanes-Woolf作圖法E．求反競爭性抑制作用中的Ki值a．雙倒數(shù)方程縱軸截距的再作圖

b．雙倒數(shù)方程橫軸截距的再作圖先將橫軸截距取相反數(shù)（取正值）。

反競爭性抑制非競爭性抑制競爭性抑制雙倒數(shù)作圖Hanes-Woolf作圖四、酶活化動力學1.酶的活化

酶的活化指的是由某種物質(zhì)與酶結合后能顯著提高酶活性的現(xiàn)象，這種結合是可逆的。這種活化劑以金屬離子為代表，常見的需Mg2+活化的酶是糖代謝中能作用于磷?；孜锏拿?。

2酶活化動力學A.酶活化模式

活化劑對酶的活化有兩種模式，一是活化劑與酶的某個調(diào)節(jié)部位結合，影響酶的構象，從而提高了酶活性；活化劑不存在時酶也有活性，但活性較低。二是活化劑A與底物S先形成絡合物SA，再與酶結合，SA為酶反應的真正底物。常見的第二種情況是涉及到ATP的反應，其活化劑是Mg2+，真正的底物是MgATP2－。

活化劑A與底物S形成絡合物的模式B.速度方程的推導a．用[SA]表達速度方程

b．用游離[A]和[S]表達速度方程

將[SA]表達式代入①式得

………………①

………②return速度方程的推導

………②分子分母同除以[A]得分子分母同除以[S]得V對[A]和[S]的依賴關系具有對稱性。

returnC．用S和A的總濃度表示速度方程[S]=[S]0－[SA]，[A]=[A]0－[SA]，（∴E很少，∵ESA也很少，故[ESA]忽略不計）[S][A]＝（[S]0－[SA]）（[A]0－[SA]）＝[S]0[A]0－[SA][A]0－[S]0[SA]＋[SA]2＝[SA]2－（[A]0＋[S]0）[SA]＋[S]0[A]0將代入上式得用S和A的總濃度表示速度方程以為自變量，此式為一元二次方程，解此方程得

用S和A的總濃度表示速度方程在兩個解中，有且只有一個符合題意，因為又因為

所以較大的解應舍去，式中“±”應取“－”號。

用S和A的總濃度表示速度方程將符合題意的解代入②式得

②式從上式可以看出，V對于[S]0和[A]0的依賴關系也具有對稱性。

D.討論當[A]0遠大于KA時，[SA]=[S]0，這時可用①式作圖求KSA。

以MgATP2－為真正底物的體系為例：設

[Mg2+]0=10－3mol/L，[ATP4－]0＝10－5mol/L，KA=10－5mol/L。設

，則

整理得

①式解此一元二次方程得

＝1.01×10－3mol/L，＝0.99×