第13章 流式細(xì)胞分析技術(shù)

臨床免疫學(xué)檢驗技術(shù)第十三章流式細(xì)胞分析技術(shù)

邵啟祥目錄第一節(jié)流式細(xì)胞儀的分析及分選原理一、經(jīng)典流式細(xì)胞儀二、量化成像分析流式細(xì)胞儀三、質(zhì)譜流式細(xì)胞儀第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析一、參數(shù)二、散射光的測定三、熒光測量四、數(shù)據(jù)顯示方式目錄第三節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求一、單細(xì)胞免疫標(biāo)本的制備二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色三、基于免疫微球技術(shù)的應(yīng)用第四節(jié)流式細(xì)胞分析的臨床應(yīng)用一、機體免疫狀態(tài)的檢測二、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型三、腫瘤耐藥相關(guān)蛋白分析四、艾滋病檢測中的應(yīng)用五、自身免疫病中的應(yīng)用六、移植免疫中的應(yīng)用目錄第五節(jié)影響流式細(xì)胞分析的主要因素一、標(biāo)本采集和單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)量控制二、熒光染色過程中的質(zhì)量控制三、儀器的質(zhì)量控制四、數(shù)據(jù)采集和分析過程中的質(zhì)量控制重點提示本章小結(jié)概述流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）：是基于流式細(xì)胞儀的一項快速、精確、高通量針對微粒（細(xì)胞）的特征或功能進行多參數(shù)定性、定量分析和分選的新型技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)的特點：快速、高通量、準(zhǔn)確、靈敏、定性或定量地對完整細(xì)胞群體分析反映出細(xì)胞群體的生物學(xué)特征或功能，或根據(jù)微粒（細(xì)胞）的特征進行分選，進而研究其生物學(xué)特征和功能。第一節(jié)流式細(xì)胞儀的分析及分選原理一、概述流式細(xì)胞儀（flowcytometer）：是多學(xué)科交叉融合的產(chǎn)物，是集光學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)、流體力學(xué)、自動化控制、光電測量、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)和計算機圖像分析等技術(shù)于一體的現(xiàn)代化新型分析儀器。作為一種先進的微粒（細(xì)胞）定性和定量分析儀器。流式細(xì)胞儀特點：①速度快，每秒可測量數(shù)萬個微粒；②精度高；③準(zhǔn)確性好；④多參數(shù)測量，可以同時對同一個微粒作物理、化學(xué)和生物特性的多參數(shù)測量。二、經(jīng)典流式細(xì)胞儀（一）基本結(jié)構(gòu)經(jīng)典分析型的流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)：液流驅(qū)動系統(tǒng)、流動室、鞘液流和標(biāo)本流信號檢測：光源、光束形成器（流動室前光學(xué)系統(tǒng)）、流動室后光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換及放大系統(tǒng)：光電轉(zhuǎn)換器、放大器和信號處理電路計算機分析系統(tǒng)分選型流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)：熒光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)（FACS）

經(jīng)典流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)（二）分析工作原理熒光染色待測單細(xì)胞懸液進樣器系統(tǒng)液流細(xì)胞流驅(qū)動系統(tǒng)流動室鞘液單細(xì)胞流檢測區(qū)域激光激發(fā)細(xì)胞熒光素

PMT/PD檢測器信號放大

FSC/SSC計算機信號轉(zhuǎn)換、儲存和分析。液流系統(tǒng)和液流聚焦示意圖噴嘴熒光信號激光束聚焦鞘液液流系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)樣品流光學(xué)系統(tǒng)、樣品激發(fā)和FSC檢測OriginalfromPurdueUniversityCytometryLaboratories光學(xué)系統(tǒng)、樣品激發(fā)和SSC檢測光學(xué)系統(tǒng)、樣品激發(fā)和熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)和熒光檢測（三）分選工作原理單細(xì)胞流流動室超聲壓電晶體高頻振動散射光單細(xì)胞液滴選定細(xì)胞群體熒光信號加載電荷偏轉(zhuǎn)高壓靜電場液滴偏轉(zhuǎn)進入分選收集管，完成細(xì)胞分選數(shù)據(jù)儲存，分析。細(xì)胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電

分選的技術(shù)要求：分選速度：單位時間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測量點的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實際得率。與分選速度成反比。二、量化成像分析流式細(xì)胞儀

（一）基本結(jié)構(gòu)量化成像分析流式細(xì)胞儀（imagingflowcytometer）的組成：熒光顯微成像的形態(tài)學(xué)量化分析系統(tǒng)與經(jīng)典流式細(xì)胞儀的結(jié)合體。

液流系統(tǒng)：注射泵、流動室、鞘液流和細(xì)胞流

LED燈明場細(xì)胞顯微圖像光學(xué)系統(tǒng)：熒光顯微系統(tǒng)全固態(tài)激光器流式細(xì)胞儀檢測檢測系統(tǒng)：TDICCD

（二）分析工作原理細(xì)胞懸液注射泵流動室液流聚焦系統(tǒng)鞘液LED照射極限層流抑制細(xì)胞搏動、翻轉(zhuǎn)明視野細(xì)胞形態(tài)固態(tài)激光TDICCD捕獲信號散射光和熒光信號計算機分析系統(tǒng)細(xì)胞明視野、熒光圖像和流式分析圖量化成像分析流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)、原理

A.量化成像分析流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)圖B.量化成像分析流式細(xì)胞儀結(jié)果分析圖細(xì)胞核轉(zhuǎn)位檢測三、質(zhì)譜流式細(xì)胞儀（一）基本結(jié)構(gòu)質(zhì)譜流式細(xì)胞儀（masscytometer）的組成質(zhì)譜流式細(xì)胞儀是經(jīng)典的流式技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合體。進樣霧化系統(tǒng)離子源：熱氣化室和電感耦合等離子體焰炬離子傳遞和過濾系統(tǒng)ICP-TOF檢測系統(tǒng)計算機及其分析系統(tǒng)質(zhì)譜流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)簡圖（二）分析工作原理金屬元素偶聯(lián)抗體標(biāo)記細(xì)胞進樣器霧化系統(tǒng)單細(xì)胞霧化液滴離子源原子電離帶電粒子高頻交變電磁場雪崩式放電渦流電流離子云形成

ICP-TOF檢測計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理和分析經(jīng)典流式細(xì)胞儀圖質(zhì)譜流式細(xì)胞儀工作原理

質(zhì)譜流式常用標(biāo)記元素常用外周血抗CD分子抗體標(biāo)記元素質(zhì)譜流式細(xì)胞儀結(jié)果分析第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析一、參數(shù)流式細(xì)胞儀的主要參數(shù)有兩大類：散射光信號：前向散射光和垂直散射光熒光信號：各種不同的流式細(xì)胞儀可檢測的熒光信號數(shù)量不同，隨著配置的激光器越多，可檢測的熒光信號越多。分析型流式細(xì)胞儀最高標(biāo)配4個激光器（488、633、405和375nm），可檢測20個參數(shù)（18種熒光），而定制型可配置11個激光器，30個檢測器，可測定32個參數(shù)。大型分選型流式細(xì)胞儀最高可配置7個激光器，檢測24個參數(shù)（22種熒光），可6路分選。二、散射光的測定（一）前向散射光（forwardscatteredlight，F(xiàn)SC）是與細(xì)胞切線方向小角度散射光，其能反映細(xì)胞形狀和體積大小。二、散射光的測定（二）側(cè)向散射光或垂直散射光（sidescatteredlight，SSC）激光照射到細(xì)胞內(nèi)容物時，可以產(chǎn)生方向不同和強弱不等的散射光，垂直方向散射光對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可反映被檢測細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒信息。三、熒光測量（一）熒光信號測量與放大器熒光信號由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的熒光抗體上的熒光素受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。散射光和熒光的強度決定了峰值脈沖信號的高度，熒光的分布則決定了脈沖信號的寬度。這些光譜通過濾光片，不同波長的散射光和熒光信號被分開，經(jīng)PMT和PD檢測后，信號經(jīng)放大、轉(zhuǎn)換，最后通過計算機分析獲取流式結(jié)果。流式檢測示意圖（二）熒光補償熒光補償是指不同的熒光素由于發(fā)射光譜重疊，因此在檢測的時候有串色現(xiàn)象，通過減去重疊部分的光，使檢測器檢測到的光能量是真正的某一熒光素產(chǎn)生的光能量。四、數(shù)據(jù)顯示方式（一）單參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示單維參數(shù)（熒光或散射光）與細(xì)胞數(shù)量（count）構(gòu)成，用于FSC、SSC和熒光（FL1～FLn）等單參數(shù)的數(shù)據(jù)顯示。（二）雙參數(shù)圖二維散點圖、密度圖和等高圖（三）多維參數(shù)的顯示假三維圖和三參數(shù)點圖三參數(shù)以上的顯示主要要依據(jù)設(shè)門技術(shù)進行分析（四）設(shè)門分析技術(shù)Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。Region設(shè)置:區(qū)閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對應(yīng)，但是也可以包含于門。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。R3=Q1+Q2+Q3+Q4

Q1=CD4+/CD3-

Q2=CD4+/CD3+

Q3=CD4-/CD3-

Q4=CD4-/CD3+R1=為粒細(xì)胞

R2=單核細(xì)胞

R3=淋巴細(xì)胞M1為線性門，為是R3中的T淋巴細(xì)胞

第三節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

一、實驗基本原則FCM試驗中實驗設(shè)計、對照設(shè)置、熒光抗體的選擇、標(biāo)本處理、染色過程和質(zhì)量控制都對實驗結(jié)果又重要影響。標(biāo)本處理實驗室環(huán)境臨床標(biāo)本處理的實驗室環(huán)境以及廢棄物的處理要嚴(yán)格按照實驗室安全要求進行，對于傳染病標(biāo)本應(yīng)該按照傳染病的等級，按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》規(guī)定在不同等級的實驗室中進行。工作人員按要求穿戴相關(guān)的防護服，儀器消毒、排放的氣體、廢水和實驗廢棄物也應(yīng)按照要求進行處理?；罴?xì)胞分選應(yīng)該在萬級層流室中進行。二、單細(xì)胞免疫標(biāo)本的制備（一）標(biāo)本采集、運輸、保存和操作1．標(biāo)本來源主要來源于外周血、骨髓和淋巴器官或組織等。2．抗凝劑的選擇采用肝素鈉和EDTA-Na2抗凝。EDTA的優(yōu)點是防止成熟的髓系細(xì)胞貼壁造成的細(xì)胞損失，具有較強的抗血小板聚集能力。缺點是由于EDTA具有一定的消化能力，導(dǎo)致細(xì)胞表面的一些分子丟失。枸櫞酸鈉和肝素鋰不宜使用。3．標(biāo)本的保存新采集標(biāo)本保存于室溫，分離的單個核細(xì)胞標(biāo)本保存于2℃～8℃。肝素抗凝外周血標(biāo)本于室溫保存48小時，EDTA抗凝的血標(biāo)本保存24小時，骨髓標(biāo)本室溫保存＜18小時。最理想的保存方法，既要保持細(xì)胞原有的特性，又要不影響檢測結(jié)果。常用保存方法：深低溫保存法，乙醇或甲醇保存法，甲醛或多聚甲醛保存法。（二）標(biāo)本制備1．外周血和骨髓1)裂解紅細(xì)胞是首選方法。2)密度梯度離心在科學(xué)研究中首選。2．體液包括胸水、腹水、心包液、腦脊液和臟器的灌洗液。3．培養(yǎng)細(xì)胞蛋白酶消化機械吹打貼壁細(xì)胞脫落洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液。4．組織機械法、酶處理法、化學(xué)試劑處理法和表面活性劑處理法多方法組合制備單細(xì)胞懸液。二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色（一）常用的熒光染料和熒光蛋白能量傳遞復(fù)合染料用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。FITCPEPE-cy5Pre-CpAPCFL-1FL-2FL-3FL-4激光細(xì)胞懸液名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PE-cy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高能量傳遞復(fù)合染料機制PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PE-cy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高（二）免疫熒光標(biāo)記熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法直接標(biāo)記：干擾少，但需購買多種單抗，在流式分析中大量使用。間接標(biāo)記：步驟多，干擾多，不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記。在流式標(biāo)記中很少使用?？贵w和標(biāo)記方式的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子：PE最強，適用于弱表達抗原FITC最便宜，熒光較弱，適用于強表達抗原間接標(biāo)記：不提倡用實驗對照的設(shè)計原則空白對照：所有試驗必須設(shè)置陰性對照：常用同型抗體對照單色分析：設(shè)同型抗體對照多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時CBA技術(shù)++抗原（細(xì)胞因子）熒光標(biāo)記抗體捕獲熒光微球捕獲抗體熒光微球三、基于免疫微球技術(shù)的應(yīng)用不同熒光強度微球CBA流式檢測結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線第四節(jié)流式細(xì)胞分析的臨床應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和研究應(yīng)用各方面，特別是在免疫細(xì)胞的表型、功能分析和免疫相關(guān)性疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷中具有重要的意義。一、機體免疫狀態(tài)的檢測（一）淋巴細(xì)胞及其亞群的分析1．T淋巴細(xì)胞及其亞群Th(CD3+CD4+CD8-T)：Th1、Th2、Th17、Th22Tc(CD3+CD4-CD8+T)Treg（CD3+CD4+CD8+T）2．B細(xì)胞及其亞群B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體,參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)。B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體；活化的B細(xì)胞可表達CD83。3．NK細(xì)胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)4．樹突狀細(xì)胞

漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（lymphoiddendriticcell，LDC）

：CD11c-CD33dimHLA-DR+Lineage-CD123+髓樣樹突狀細(xì)胞（myeloiddendriticcell，mDC）：CD11c+HLA-DR+Lineagedim/-（二）淋巴細(xì)胞功能分析1．淋巴細(xì)胞增殖試驗：CFSE標(biāo)記法2．CD8+T和NK細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗：FDA或CFSE標(biāo)記法3．特異性CD8+T細(xì)胞功能的檢測：MHC-抗原肽四聚技術(shù)（MHC-peptidetetramerassay）4．淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測：5．細(xì)胞外細(xì)胞因子的檢測：CBA技術(shù)二、造血系統(tǒng)CD及白血病免疫分型T淋巴細(xì)胞系：CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8和TCR；B淋巴細(xì)胞系：CD10、CD19、CD20、CD22、CD79a和SmIg；NK淋巴細(xì)胞系：CD16、CD56和CD57；髓系：CD13、CD14、CD15、CD16、CD64、CD33、CD117、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）；紅系：CD71和血型糖蛋白（glycophorinA，GlyA）；巨核系：CD41、CD42和CD61；干祖系及非系列相關(guān)抗原：CD34、CD38和HLA-DR。微小殘留病變?nèi)?、腫瘤耐藥相關(guān)蛋白分析多藥耐藥基因（multiple-drugresistancegene，MDRG）及其相關(guān)蛋白的檢測：ATP結(jié)合盒（ATP-bindingcassette，ABC）蛋白轉(zhuǎn)運蛋白P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）多藥耐藥蛋白1（MRP1，也是ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員）肺耐藥相關(guān)蛋白（lungresistprotein，LRP）胎盤型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase-pi，GST-π）乳腺癌耐藥蛋白（breastcancerresistanceprotein，BCRP）多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）四、艾滋病檢測中的應(yīng)用除了病原體以外，需要對機體進行免疫狀態(tài)評估：1.早期Th細(xì)胞絕對數(shù)顯著下降，而Tc細(xì)胞數(shù)量可正?；蛳鄬υ黾印?.晚期CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞都明顯下降。NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則處于正常范圍。五、自身免疫病中的應(yīng)用淋巴細(xì)胞群體和亞群的檢測：T細(xì)胞群體：CD3+T細(xì)胞，活化T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，并伴有CD4/CD8比值異常。循環(huán)Th17、Tfh和CD8+

CD28+Tc及靶器官中的Th17，而Treg和CD8+/CD28-T細(xì)胞總數(shù)和功能；B細(xì)胞群體：CD19+B細(xì)胞和CD83+B細(xì)胞。此外在自身免疫病中CD95+細(xì)胞比例。自身免疫病的檢測標(biāo)志檢測：HLA-B27等檢測。六、移植免疫中的應(yīng)用（一）移植前的配型和其它檢測1．FCXM2．群體反應(yīng)性抗體的檢測3．造血干/祖細(xì)胞計數(shù)4．淋巴細(xì)胞計數(shù)和移植物抗宿主排斥病的預(yù)防（二）移植后的實驗室監(jiān)測各種與固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答相關(guān)的分子、移植后并發(fā)的傳染病相關(guān)分子的檢測。第五節(jié)影響流式細(xì)胞分析的主要因素（一）體液或血液來源標(biāo)本:盡可能即刻處理標(biāo)本。要注意臨床疾病對標(biāo)本的影響。（二）培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本:酶和EDTA等消化對膜分子有一定影響。注意細(xì)胞處理過程對檢測項目的影響。（三）實體組織來源標(biāo)本:應(yīng)按照組織器官的性質(zhì)不同，選擇合適的制備單細(xì)胞懸液的方法，防止死細(xì)胞過多，胞膜分子丟失。（四）pH值:以7.0～7.2為宜。一、標(biāo)本采集和制備的質(zhì)量控制（一）細(xì)胞濃度:細(xì)胞濃度以1×106/ml為宜。（