遺傳標記-PCR原理與應(yīng)用

PCR技術(shù)

的原理與應(yīng)用PCR技術(shù)的產(chǎn)生PCR技術(shù)的原理PCR原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。PCR的原理PCR循環(huán)–第一步–加熱變性PCR循環(huán)—第二步—引物與靶序列退火PCR循環(huán)-

第三步-

引物延伸第1個PCR循環(huán)完成后–

得到兩個拷貝的靶序列No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火特異性強：引物與模板DNA按照堿基互補配對原則結(jié)合，耐熱DNA聚合酶使整個反應(yīng)可在較高溫度下進行，結(jié)合的特異性大大提高。靈敏度高：理論上可從100萬個細胞中檢測出1個靶細胞簡便迅速：一個PCR反應(yīng)約需要2～4小時，擴增產(chǎn)物可直接電泳分析，直觀、便捷。對模板要求低：不需特殊方法分離病毒、細菌或培養(yǎng)細胞，DNA粗制品即可作為擴增的模板PCR技術(shù)的特點PCR擴增過程圖示平臺效應(yīng)“平臺效應(yīng)”：PCR反應(yīng)中，當引物－模板與DNA聚合酶達到一定比值時，DNA聚合酶催化反應(yīng)趨于飽和，即PCR反應(yīng)不再增加。PCR反應(yīng)成分DNA聚合酶dNTPs模板引物PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成

10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul

一、PCR反應(yīng)的標準體系二、關(guān)于緩沖系統(tǒng)10×擴增緩沖液的成分通常含有適量的KCl,MgCl2,Tris-HCl。Tris緩沖液是一種雙極化離子緩沖液，它能有效地調(diào)節(jié)pH，使其維持在DNA聚合酶活性所要求的偏堿性環(huán)境；鎂離子是DNA聚合酶的活性所必須的，它既影響到反應(yīng)的擴增效率，也影響反應(yīng)的特異性，過量的鎂離子常常引起非特異性擴增反應(yīng)；KCl的作用是促進引物退火。PCR反應(yīng)中的模板可以是來源于任何生物的單鏈及雙鏈DNA。PCR對模板純度要求不高。樣品中存在一定量的蛋白質(zhì)或有機物對實驗結(jié)果影響不大，甚至可以將細胞裂解物直接用于擴增，有DNA部分降解的樣品，也可以作為模板使用。但是樣品中不能含有某種可抑制DNA聚合酶活性的雜質(zhì)。PCR反應(yīng)中，起始模板的用量，理論上講可以少到僅有一個有效的單一分子。為了獲得高質(zhì)量和高效率的擴增，模板用量可為納克或微克水平。三、關(guān)于模板引物引物3’5’5’5’基因組引物的序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴增區(qū)無同源序列這樣可以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性引物長度：15－40bp，常用為２０bp左右引物過短或過長均可使反應(yīng)的特異性下降。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計原則(Cont.)引物的堿基盡可能隨機發(fā)布避免出現(xiàn)數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在40％－６０％之間，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu)特別是引物的末端應(yīng)避免有回文結(jié)構(gòu)。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計原則(Cont.)二個引物不應(yīng)有互補序列特別是3’端應(yīng)避免互補，以免形成“引物二聚體”，浪費引物。引物5’末端堿基無嚴格限制在與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠的條件下，其5’端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態(tài)，因此可在引物5’端加上限制性內(nèi)切酶位點、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆等，引物的5’端最多可加10個堿基而對PCR反應(yīng)無影響。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計原則(Cont.)3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記引物擴增跨度以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。四、關(guān)于引物－引物的設(shè)計原則(Cont.)PCR擴增條件變性退火延伸始變性９４度５分鐘主循環(huán)９４度１分鐘５０度１分鐘７２度１分鐘終延伸７２度１０分鐘一、PCR熱循環(huán)中的標準參數(shù)主循環(huán)周期通常選定為25～30個循環(huán)。循環(huán)周期較多，可能獲得較多的產(chǎn)物，但隨之而來的堿基錯配的概率也會增大，故在要求高保真擴增的實驗中，應(yīng)盡可能用較少的循環(huán)周期。1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍試驗者應(yīng)根據(jù)自己的引物Tm值及實驗?zāi)康倪M行設(shè)定退火溫度，退火時間選擇范圍是３０秒到１分鐘。延伸溫度通常變化不大，延伸時間應(yīng)該根據(jù)欲擴增的靶序列的長度進行調(diào)整，一般按每分鐘合成１０００個堿基的速率來計算，二、關(guān)于退火和延伸分析PCR擴增產(chǎn)物的最常用方法是凝膠電泳分析法。帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動，這種現(xiàn)象稱之為電泳(electrophoresis，簡稱EP)。凝膠電泳分析包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳靈敏度高，但操作復(fù)雜。PCR擴增產(chǎn)物分析電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進行分離的一類實驗技術(shù)。帶電顆粒在電場中移動是物質(zhì)的一種運動現(xiàn)象。移動的速度與顆粒帶電的強弱、分離介質(zhì)的阻力、電極液的粘度和電場強度等因素有關(guān)。生物大分子在電場中移動的速度除上述因素外還與分子形狀、相對分子質(zhì)量大小、分子的帶電性質(zhì)及數(shù)目等因素有關(guān)。一、電泳的原理核酸分子中的糖-磷酸骨架中的磷酸基團帶有負電荷，因此當核酸分子被放置在電場當中時，它們就會向正電極的方向遷移。在凝膠濃度和電場強度一定的情況下，DNA分子的這種遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移快，雙鏈環(huán)狀DNA比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些，這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。一、電泳的原理二、瓊脂糖濃度的選擇片斷大小瓊脂濃度（％）５０～５００2.0５００～１０００1.5１０００～５０００1.0>５０００0.6三、關(guān)于EBEB是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)瓊脂糖凝膠中的核酸分子。當把含有DNA分子的凝膠浸泡在EB的溶液中，或是將EB直接加到DNA的凝膠介質(zhì)中，此種染料便會在一切可能的部位同DNA分子結(jié)合，然而卻不能同瓊脂糖凝膠結(jié)合，因此在紫外光的照射下，只有DNA分子通過放射熒光而變成可見的譜帶。而且在適當?shù)娜旧珬l件下，熒光的強度是同DNA片段的大?。ɑ驍?shù)量）成正比。在包含有數(shù)種DNA片段的電泳譜帶中，每一條帶的熒光強度是隨著從最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐漸降低的。換言之，在一定程度上，電泳譜帶的熒光強度是同DNA片段的大小成正比的。EB染色原理四、電泳系統(tǒng)—電泳儀四、電泳系統(tǒng)—電泳槽垂直電泳槽水平電泳槽PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP

引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP

引物Buffer94oC5’基本過程PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)PCR常見問題問題一：無擴增產(chǎn)物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０錎NA或加大模板的用量更換Buffer或調(diào)整濃度重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無；問題二：非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)問題二：非特異性擴增問題三：拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。M12模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ呒兓０甯鼡QBuffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)問題三：拖尾問題四：假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物

對策：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。問題四：假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況)PCR反應(yīng)的類型一、錨定PCR（anchoredPCR）用于在體外擴增未知序列的DNA片段的方法，而一般的PCR必須預(yù)先知道欲擴增DNA片段兩側(cè)的序列，但人們經(jīng)常需要分析一段序列未知的基因片段，可利用錨定PCR。一、錨定PCR（anchoredPCR）PCR的局限：需了解靶基因片段兩測的序列

對于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補的引物作為錨定引物，在與基因另一側(cè)配對的特異引物參與下，擴增帶有同聚物尾的序列。錨定引物PCR對分析未知序列基因有特殊價值一、錨定PCR（anchoredPCR）cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA在擴增循環(huán)中引入不同引物濃度，一般用二種不同濃度的引物，50－100：1比例的引物濃度，在最初10－15個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA，但當?shù)蜐舛纫锉幌谋M后，高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈DNA。單鏈DNA可用作雜交探針或DNA測序。二、不對稱PCR（asymmetricPCR）

高濃度引物低濃度引物常規(guī)PCR可擴增位于二個引物之間的DNA片段，但不能擴增引物外側(cè)的DNA序列，反向PCR則可擴增引物外側(cè)的DNA片段，對已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增和研究。三、反向PCR（inversePCR）已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶連接酶限制酶多重PCR是在同一反應(yīng)中采用多對引物同時擴增幾個不同的DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴增產(chǎn)物長度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常。多重PCR具有靈敏快速特點，特別適用檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結(jié)果與Southernblotting一樣可靠，但多重PCR會檢測小片段缺失四、多重PCR（multiplexPCR）電泳引物用于檢測特定基因序列的存在或缺失或稱熒光PCR(fluorescentPCR)

在多重PCR試驗中，一次試驗還不容易區(qū)分長短相近的多種基因成分。熒光PCR可用于解決這一問題。原理：用不同的熒光染料（如紅色的羅丹明、綠色的熒光素）標記不同的引物的5’端，同時擴增多個DNA區(qū)段，反應(yīng)完畢后，凝膠過濾除去多余的引物進行電泳。用紫外線照射擴增產(chǎn)物，就能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會缺乏相應(yīng)的顏色，據(jù)此可以很快診斷是否某種基因缺失，或是發(fā)現(xiàn)某些感染的病毒等。五、著色互補PCR（colorcomplementationPCR）病毒1病毒2病毒3病毒4

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進行標記，用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標本的基因診斷可同時檢測多種基因成分標記引物ＰＣＲ觀察先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴增。應(yīng)用：①分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

②克隆cDNA及合成cDNA探針，改造cDNA序列等六、反轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈七、原位PCR

原位聚合酶鏈式反應(yīng)（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。

直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行ＰＣＲ擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列

原位PCR的作用既往鑒定細胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個細胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標準的PCR則可擴增出細胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細胞形態(tài)學研究相結(jié)合。

ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來，成為細胞學診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細胞內(nèi)病毒感染、細胞內(nèi)基因重排、以及分析細胞內(nèi)RNA表達產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細胞的潛在感染方面也具有重要意義。操作步驟細胞或組織的固定

PCR擴增細胞內(nèi)目的片段原位雜交檢測擴增產(chǎn)物人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片實時熒光定量PCR技術(shù)

(RealtimeQuantitativePCR)

實時熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法常規(guī)vs實時常規(guī)PCR：借助電泳對擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行半定量及定性分析實時熒光定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析優(yōu)缺點比較常規(guī)vs實時實時熒光定量PCR常規(guī)PCR熒光實時分析每一次循環(huán)產(chǎn)物凝膠電泳分析終產(chǎn)物精確計算初始模板濃度，靈敏度高，檢測單拷貝模板通過終產(chǎn)物定性分析模板濃度計算機自動紀錄分析檢測方法費時費力優(yōu)勢來自：實驗數(shù)據(jù)及定量分析方法熒光實時監(jiān)測產(chǎn)物濃度常規(guī)vs實時Real-timePCR的定量原理介紹四個概念：

擴增曲線、熒光閾值、

Ct值、標準曲線擴增曲線圖：

橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；

縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件一、擴增曲線熒光信號閾值（threshold）：

以PCR反應(yīng)前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值

熒光域值定義為3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍真正的信號:熒光信號超過域值二、熒光閾值Ct值的定義：含義為在PCR循環(huán)過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。實際應(yīng)用中，即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)三、Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）C(t)valueCt值的確定：閾值所在的橫線與PCR擴增曲線的交點所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，盡管平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，CT值卻極具重現(xiàn)性是相對固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR，DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。理想的PCR反應(yīng)：

X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

X=X0(1+Ex)nn：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴增效率四、Ct值與模板起始拷貝數(shù)的關(guān)系在擴增產(chǎn)物達到閾值線時:

XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)

XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量四、Ct值與模板起始拷貝數(shù)的關(guān)系五、標準曲線每個模板的Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系利用已知拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線獲得未知樣品的Ct值，可從標準曲線得到模板的起始拷貝數(shù)將標準品稀釋幾個濃度，Real-timePCR后得到標準曲線確定未知樣品的C(t)值通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量六、絕對定量Sample25SYBRGreen法TaqMan法Molecularbeacon法(分子信標)Real-timePCR的幾種方法介紹DNA產(chǎn)物的熒光標記非特異性熒光標記：

1、SYBRGreen特異性熒光標記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

實時熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreen一、工作原理

SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen5’3’5’3’SGNoEmissionSGSG