RNA干擾技術(shù)在生物醫(yī)藥發(fā)展的意義與前景

RNA干擾技術(shù)在生物醫(yī)藥發(fā)展的意義與前景梅洛(CraigMello)生于1960年，是被恐龍骨引入科學(xué)世界的。梅洛童年時(shí)經(jīng)常跟著父親在美國(guó)西部尋找化石。從那時(shí)起，他就迷上了遠(yuǎn)古時(shí)代、地球歷史和人類生命的起源等問題。高中時(shí)代，梅洛的興趣逐漸轉(zhuǎn)移到了基因工程方面。法爾(Andrew

Fire)1959年出生在美國(guó)加利福尼亞州，本科在加利福尼亞大學(xué)伯克利分校主修數(shù)學(xué)，僅用3年時(shí)間就拿到學(xué)位。與梅洛類似，他逐漸對(duì)涉及生命奧秘的遺傳學(xué)產(chǎn)生興趣，并將其作為自己終身的學(xué)術(shù)追求。2006年10月2日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院宣布將2006年度諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)授予兩名美國(guó)科學(xué)家CraigMello和Andrew

Fire，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了“RNA（核糖核酸）干擾”機(jī)制。1.RNAi的發(fā)現(xiàn)90年代初，美國(guó)和荷蘭的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組RichJorgensen和同事在對(duì)矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究，發(fā)現(xiàn)一個(gè)奇怪的現(xiàn)象：共抑制(cosuppression)

野生型

試驗(yàn)預(yù)測(cè)1995年，康乃爾大學(xué)的SuGuo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)，但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這個(gè)意外以合理解釋。1.RNAi的發(fā)現(xiàn)1998年，fire和mello對(duì)以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究：1.RNAi的發(fā)現(xiàn)正義RNA，反義RNA對(duì)unc-22基因的表達(dá)表現(xiàn)輕微的干涉作用，而二者混合物卻引起了高效的沉默作用——基因沉默。正義RNA、反義RNA、二者混合物——C.elegans，以干涉unc-22基因的表達(dá)電泳結(jié)果顯示上述的正義和反義RNA混合物的主要成分是dsRNA。進(jìn)一步研究表明只有與靶基因mRNA有同源序列的dsRNA才具有干涉作用。由此他們認(rèn)為，Guo實(shí)驗(yàn)中令人意想不到的結(jié)果是由于對(duì)照組正義RNA中混有少量dsRNA的緣故。于是，F(xiàn)ire和mello提出在C．elegans體內(nèi)dsRNA對(duì)有其同源序列的mRNA表達(dá)具有高效的干涉作用。并將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。1.RNAi的發(fā)現(xiàn)1.RNAi的發(fā)現(xiàn)在1999年短短的一年間,發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細(xì)胞中。2000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在RNA干擾現(xiàn)象。推測(cè)RNA干擾是自然界中生物體抵抗外源基因或病毒侵入、抑制轉(zhuǎn)座子活性，保持基因自穩(wěn)的一種方式。2.RNAi的機(jī)制RNAi：RNAinterference（RNA干擾）；dsRNA：double-strandedRNA(雙鏈RNA)，包含正義鏈和反義鏈；Dicer：RNaseⅢ家族成員，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶siRNA：SmallinterferingRNA(小干擾性RNA)，RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23nt大小的雙鏈RNA；RISC：

RNA-inducedsilencingcomplex（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物），具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性；RdRP：RNA-dependentRNApolymerases，依賴RNA的RNA聚合酶，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞；2.RNAi的機(jī)制RISCRNAi：是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，也就是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。2.RNAi的機(jī)制2.RNAi的機(jī)制轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)TGS是轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞核內(nèi)RNA合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。這種類型的基因沉默，可能是因?yàn)榛蛱禺惖募谆鴮?dǎo)致；PTGS則是指基因能夠在細(xì)胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞質(zhì)里卻無(wú)相應(yīng)的mRNA存在這一現(xiàn)象?；虺聊?、siRNA的形成2.RNAi的機(jī)制

siRNAs（21-23nt）longdsRNADicer2、siRNA介導(dǎo)的mRNA降解3、RNAi效應(yīng)的放大2.RNAi的機(jī)制RISC:RNA-InducedSilencingComplexExdonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P形成RISC復(fù)合物，降解目的mRNACapAAAAAACapAAAAAACapAAAAAA循環(huán)復(fù)制酶Dicer切割3.RNAi在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用12333在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用在基因治療中的應(yīng)用在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用3.RNAi在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用目的：確定特定基因的功能方法：使其功能喪失或降低應(yīng)用：利用RNAi技術(shù)證明ag-1基因與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)（1）在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用AIDS（獲得性免疫缺陷綜合征）HIV（人體免疫缺陷病毒）Corecepter—CCR-5設(shè)計(jì)合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi抑制了coreceptor-CCR5進(jìn)入人體外周Ｔ淋巴細(xì)胞。由此治療HIV-1病毒感染性疾病的可行性大大增加。（2）在基因治療中的應(yīng)用（AIDS）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用LiebermanJ成功地利用RNAi技術(shù)治愈了實(shí)驗(yàn)鼠的肝炎HBV（乙型肝炎病毒）Fas基因?qū)嶒?yàn)：給實(shí)驗(yàn)鼠尾部靜脈注入siRNA，以“沉默”Fas基因結(jié)果：90%肝細(xì)胞接受這種RNA分子，并且使得Fas蛋白含量降低到10%；接受治療的小鼠成活率為82.5%；而未接受治療的小鼠有40%在3d內(nèi)死亡。不能用于人類。（2）在基因治療中的應(yīng)用（HBV）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用腫瘤傳統(tǒng)技術(shù)：?jiǎn)蝹€(gè)癌基因RNAi：針對(duì)具有同源性的多個(gè)基因Kras基因抑制血管生成（2）在基因治療中的應(yīng)用（腫瘤）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用用RNAi特異性地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過(guò)度表達(dá)，使這類基因保持在靜默或休眠狀態(tài)，從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤。慢性疼痛RNAi是一種有潛力的新方法，通過(guò)導(dǎo)入可選擇性降解疼痛相關(guān)蛋白的siRNA，從而解除疼痛，而且作為新的基因敲除手段，可用于發(fā)現(xiàn)疼痛通路中的新基因。2003年，有人向鞘內(nèi)注射靶向P2X3受體siRNA，有效降低了機(jī)械性痛覺過(guò)敏和觸覺超敏。這個(gè)結(jié)果表明RNAi可作為慢性疼痛研究與治療一條新的途徑。（3）在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用（慢性疼痛）3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用3.RNAi在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用阿爾茨海默?。ˋD）淀粉樣前體蛋白基因(App)、早老素1基因(PS1)、早老素2基因(PS2)、載脂蛋白E4基因(apoE4)；通過(guò)RNAi阻斷與AD發(fā)病有關(guān)的基因，可達(dá)到防治和治療AD的目的（3）在神經(jīng)性疾病中的應(yīng)用（阿爾茨海默?。┮话慵夹g(shù)路線4.RNAi的研究方法4.RNAi的研究方法siRNA序列的設(shè)計(jì)siRNA的一般結(jié)構(gòu)：21-23ntdsRNA

dTdT（UU）（UU）dTdT（1）siRNA的序列應(yīng)當(dāng)選擇靶基因的外顯子序列，而且要避免距離起始密碼和終止密碼很近的地方；（2）避免連續(xù)的3個(gè)G；（3）不要針對(duì)5’和3’端的非編碼區(qū)；（4）GC含量最好在45~55%之間；4.RNAi的研究方法siRNA序列的設(shè)計(jì)siRNA設(shè)計(jì)的原則：4.RNAi的研究方法序列同源性分析：將siRNA序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。陰性對(duì)照：通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。siRNA序列的設(shè)計(jì)4.RNAi的研究方法以核苷酸單體為原料，通過(guò)化學(xué)方法合成兩條互補(bǔ)的長(zhǎng)約21~23nt的RNA單鏈，然后退火形成雙鏈復(fù)合體，這種方法所獲得的產(chǎn)物純度、干擾效率高，合成簡(jiǎn)單，但是制備周期長(zhǎng)，作用時(shí)間短，而且價(jià)格昂貴，限制了其應(yīng)用和推廣。是最貴的方法，但是卻是最方便的。許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究；不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究。化學(xué)合成siRNA4.RNAi的研究方法體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAT7聚合酶和目標(biāo)序列正反兩條鏈退火DNA雙鏈正、反兩條RNA鏈轉(zhuǎn)錄雜交后用RNA酶消化siRNA4.RNAi的研究方法siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNAs以PCR制備的siRNA表達(dá)框進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成siRNAsiRNA表達(dá)載體

BDClontech公司推出的RNAi-ReadypSIREN載體選用RNA聚合酶III家族的啟動(dòng)子，可在其下游插入一小段編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA的DNA模板構(gòu)建成表達(dá)載體。siRNA表達(dá)框架(siRNAexpresioncasetes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模板，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。siRNA表達(dá)框表達(dá)框架包括：一個(gè)RNApolIII啟動(dòng)子一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA一個(gè)RNApolIII終止位點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR