感受態(tài)細(xì)胞的制備

實(shí)驗(yàn)三大腸桿菌感受態(tài)的制備（CaCl2法）1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理3.實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑4.實(shí)驗(yàn)步驟

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)原理

受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法、CaCl2等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑1．超凈工作臺(tái)2．低溫離心機(jī)3．恒溫?fù)u床4．恒溫培養(yǎng)箱5．-70℃冰箱6．制冰機(jī)7．移液器50ul、200ul、1000ul（二）材料大腸桿菌DH5α（Top10）。（三）試劑

1.LB液體培養(yǎng)基2.0.1mol/LCaCl2溶液實(shí)驗(yàn)步驟

1.挑取大腸桿菌DH5α（Top10）的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12hr。2.取2mL菌液加入100mlLB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)約2-3h；測(cè)OD600值，當(dāng)OD600約0.4-0.5時(shí)，停止培養(yǎng)。3.無菌條件下取1.5ml菌液冰上放置10min，4℃，3,500rpm，離心10min。4.棄上清，在冰浴上加入250ul預(yù)冷的無菌CaCl2(0.1mol/L)，輕搖使細(xì)胞懸浮。冰上放置10min。5.4℃，3,500rpm離心10min。6.棄上清，用150ul預(yù)冷的無菌CaCl2(0.1mol/L)重新懸浮細(xì)胞，保存?zhèn)溆谩＃尤?5%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。注意事項(xiàng)1．細(xì)菌的生長狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測(cè)OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3．經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24小時(shí)達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長而減少造成的）；4．化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6．質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；7．一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為宜，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107

個(gè)/mL左右，這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要格外小心，懸浮細(xì)胞時(shí)要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化。1.在制備感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中要注意哪些

細(xì)節(jié)？2.影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？思考題實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論