食品酶學(xué)緒論

食品酶學(xué)第1章緒論主要內(nèi)容1.1酶的定義與特征1.2酶學(xué)研究簡(jiǎn)史1.3酶的分類(lèi)和命名1.4酶學(xué)對(duì)食品科學(xué)的重要性1.1酶的定義與特征1.1.1酶的定義酶是由生物活細(xì)胞所產(chǎn)生的、具有高效和專(zhuān)一催化功能的生物大分子。（1）高效性同一反應(yīng)，酶催化反應(yīng)的速度比一般催化劑催化的反應(yīng)速度要大107～1013倍。有極少量酶就可催化大量反應(yīng)物發(fā)生轉(zhuǎn)變。1.1.2酶的特征例如，鐵離子和過(guò)氧化氫酶都可以催化雙氧水（H202）分解成為水和氧氣。在一定條件下，1mol鐵離子可催化6×10-4mol雙氧水分解。在相同條件下，1mol過(guò)氧化氫酶卻可催化5×106mol的雙氧水分解。過(guò)氧化氫酶的催化效率達(dá)到鐵離子的1010倍。（2）酶的專(zhuān)一性一種酶僅能作用于一種物質(zhì)，或一類(lèi)分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，促其進(jìn)行一定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生一定的反應(yīng)產(chǎn)物，這種選擇性作用稱(chēng)為酶的專(zhuān)一性。①絕對(duì)專(zhuān)一性這類(lèi)酶對(duì)底物的要求很?chē)?yán)格，甚至有時(shí)只能催化一種底物，進(jìn)行一種化學(xué)反應(yīng)。例如：過(guò)氧化氫酶只能催化過(guò)氧化氫的分解。琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。②

相對(duì)專(zhuān)一性有些酶要求底物具有一定的化學(xué)鍵，對(duì)一類(lèi)底物起作用，催化一類(lèi)反應(yīng)。例如：淀粉酶只能催化淀粉糖苷鍵的水解；蛋白酶只能催化蛋白質(zhì)肽鍵的水解。③

立體異構(gòu)專(zhuān)一性幾乎所有的酶對(duì)于立體異構(gòu)體都具有高度的專(zhuān)一性。即酶只能催化一種立體異構(gòu)體發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)，而對(duì)另一種立體異構(gòu)體則無(wú)作用。例如：L-氨基酸氧化酶只能作用于L-氨基酸。乳酸脫氫酶能催化L-乳酸脫氫變?yōu)楸?，?duì)D-乳酸則無(wú)作用。（3）高度受控性無(wú)論在體內(nèi)或體外，酶的催化活力都受到多種因素的調(diào)節(jié)和控制。如基因表達(dá)、輔助因子、存在狀態(tài)、反饋抑制、底物水平、激素水平、激活劑、抑制劑、溫度、pH、酶原激活等。（4）易變性大多數(shù)酶是由生物活細(xì)胞產(chǎn)生的有催化能力的蛋白質(zhì)，只要不是處于變性狀態(tài)，無(wú)論是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外都可發(fā)揮催化作用。紫外線、熱、表面活性劑、重金屬鹽以及酸堿變性劑等能使蛋白質(zhì)變性的因素，往往也能使酶失效。酶本身能被水解蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解酶分解而喪失活性。（5）代謝相關(guān)性生物體內(nèi)幾乎所有的新陳代謝反應(yīng)都需要酶的參與，對(duì)酶的任何改變都會(huì)影響甚至改變?cè)撁竻⑴c的生物代謝過(guò)程。1.1.3食品酶學(xué)的定義酶學(xué)是研究酶的性質(zhì)、酶的作用規(guī)律、酶的結(jié)構(gòu)和作用原理、酶的生物學(xué)功能及酶的應(yīng)用的一門(mén)科學(xué)。食品酶學(xué)是酶學(xué)的基本理論在食品科學(xué)與技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用的科學(xué)，是酶學(xué)的重要分支學(xué)科。主要研究食品原理、食品產(chǎn)品中酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、作用規(guī)律以及對(duì)食品儲(chǔ)藏、加工和食用品質(zhì)的影響，食品級(jí)酶的生產(chǎn)及其在食品儲(chǔ)藏、加工等環(huán)節(jié)的應(yīng)用理論與技術(shù)。1.2酶學(xué)研究簡(jiǎn)史酶學(xué)重要性化學(xué)醫(yī)學(xué)生物工程生理學(xué)微生物學(xué)生物化學(xué)酶輕工、化工食品、醫(yī)藥能源、環(huán)保1.2.1人類(lèi)利用酶的催化作用的歷史悠長(zhǎng)而久遠(yuǎn)⑴遠(yuǎn)在進(jìn)入游牧生活時(shí)期，人類(lèi)已開(kāi)始利用動(dòng)物的胃液（含凝乳酶）來(lái)凝固牛乳，制造干酪。⑵中國(guó)早在4000年前的夏禹時(shí)代就已掌握了用麴和蘗釀酒的技術(shù)?！稌?shū)經(jīng)》中有“若作酒醴，爾維麴蘗”的記載。⑶在周朝（3000多年前），中國(guó)人民就會(huì)利用麥曲將淀粉降解為麥芽糖制造飴糖。(4)約2500年前的春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期，人們已懂得利用酒曲來(lái)治療腸胃病，用雞內(nèi)金（雞胃膜）治療消化不良。⑸人們還利用糞便使獸皮脫毛，制作皮革；用胰臟軟化皮革，這些都屬于酶的作用。1.2.2酶的發(fā)現(xiàn)（1）1833年法國(guó)化學(xué)家Payen和Persoz從麥芽汁提取物中首次發(fā)現(xiàn)了淀粉酶。（2）到19世紀(jì)中期，科學(xué)家們已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了胃蛋白酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和轉(zhuǎn)化酶等。

巴斯德主張：發(fā)酵和活細(xì)胞有關(guān)，酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞生活的結(jié)果。巴斯德（1822-1895）微生物學(xué)的奠基人提出分子不對(duì)稱(chēng)性理論，開(kāi)創(chuàng)了立體化學(xué)研究的途徑。創(chuàng)立了發(fā)酵的生物學(xué)理論，低溫消毒技術(shù)（巴氏殺菌）免疫學(xué)--預(yù)防接種，研制出狂犬疫苗李比希認(rèn)為：發(fā)酵及其他類(lèi)似過(guò)程，是由于化學(xué)物質(zhì)的作用，純粹是化學(xué)過(guò)程。李比希(1803—1873)德國(guó)化學(xué)家化學(xué)教育改革家有機(jī)化學(xué)創(chuàng)始人農(nóng)業(yè)化學(xué)之父（3）關(guān)于發(fā)酵本質(zhì)的長(zhǎng)期論戰(zhàn)從1901年到1910年最早的十次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者中，李比希的學(xué)生就有七位。（4）1897年，畢希納兩兄弟(EduardBuchner&HansBuchner)成功的從酵母細(xì)胞分離出具有發(fā)酵作用的物質(zhì)，能使糖發(fā)酵。這說(shuō)明巴斯德和李比希的兩種觀點(diǎn)實(shí)質(zhì)上是一致的。生物化學(xué)就是在解決發(fā)酵本質(zhì)的著名論戰(zhàn)中產(chǎn)生的。HansBuchner（1850-1902）德國(guó)細(xì)菌學(xué)家EduardBuchner(1860-1917)1907年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Enzyme的詞源1878年，德國(guó)科學(xué)家Kuhne首先提出用以表示未統(tǒng)一名稱(chēng)的已知的各種酵素——enzyme。Enzyme本身的意思是“在酵母中”，起源于希臘語(yǔ)，其中en表示“在之內(nèi)"，zyme表示酵母。1.2.3酶催化的專(zhuān)一性

1894年，F(xiàn)ischer提出了“鎖和鑰匙”模型，成功解釋了酶的催化反應(yīng)機(jī)制。1959年，Koshland提出的“誘導(dǎo)契合”理論，以解釋酶的催化理論和專(zhuān)一性，同時(shí)也搞清了某些酶的催化活性與生理?xiàng)l件變化有關(guān)。1902年，Henri提出了酶與底物作用的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)。1913年，Michaelis和Menten提出中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，推導(dǎo)出酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，即著名的米氏方程：

V=Vmax[S]/Km+[S]1.2.4酶學(xué)的理論研究1926年，美國(guó)人Sumner首先從刀豆中獲得了不負(fù)載任何其他催化劑的脲酶結(jié)晶，證明脲酶具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。1930年至1936年間，制取了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶結(jié)晶。從此確立了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的觀點(diǎn)，為酶的理化特性研究奠定了基礎(chǔ)。1960年，操縱子學(xué)說(shuō)的提出闡明了酶生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制。1965年，Philips首次用X射線晶體衍射技術(shù)闡明了雞蛋清溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)，為以后酶結(jié)構(gòu)、功能以及催化機(jī)制的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。20世紀(jì)80年代，Cech和Altman分別發(fā)現(xiàn)了具有催化功能的RNA-核酶，這一發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，開(kāi)辟了酶學(xué)研究的新領(lǐng)域。1.2.5酶的固定化1953年，德國(guó)科學(xué)家Grubhofer和Schleith首先將聚氮基苯乙烯樹(shù)脂重氮化，將淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶結(jié)合在樹(shù)脂上，制成固定化酶，有效地進(jìn)行了酶的固定化研究。1969年日本的千畑一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。美國(guó)在20世紀(jì)70年代初開(kāi)始采用固定化酶技術(shù)，使玉米淀粉經(jīng)酶法液化、糖化和異構(gòu)化后，成功地工業(yè)化生產(chǎn)第一代、第二代和第三代高果糖漿，代替蔗糖作為可口可樂(lè)和百事可樂(lè)等飲料食品的甜味劑，提高了飲料質(zhì)量，是一項(xiàng)非常成功的技術(shù)創(chuàng)新。1971年，出現(xiàn)了固定化菌體技術(shù)，70年代后期人們開(kāi)始運(yùn)用固定化細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)胞外酶。80年代中期，固定化原生質(zhì)體技術(shù)則被用于生產(chǎn)胞內(nèi)酶，以去除細(xì)胞壁擴(kuò)散的障礙。酶固定化技術(shù)的發(fā)展也引起了食品、發(fā)酵工業(yè)一場(chǎng)大變革。目前為止，已發(fā)現(xiàn)自然界存在的酶有3000多種，但真正形成工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的只有幾十種。1.2.6酶工程的發(fā)展

酶工程就是將酶或者微生物細(xì)胞，動(dòng)植物細(xì)胞，細(xì)胞器等在一定的生物反應(yīng)裝置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)并應(yīng)用于社會(huì)生活的一門(mén)科學(xué)技術(shù)。1969年，日本的千畑一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸后，學(xué)者們開(kāi)始用“酶工程”這個(gè)新名詞來(lái)代表有效地利用酶的科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。而近20多年來(lái)，在酶和細(xì)胞固定化技術(shù)發(fā)展的同時(shí)，其他酶分子修飾技術(shù)也在不斷發(fā)展進(jìn)步。此外，酶的化學(xué)合成、人工模擬，以及各種酶的應(yīng)用技術(shù)研究，使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。1.2.7基因工程技術(shù)對(duì)酶學(xué)的影響20世紀(jì)80年代基因工程技術(shù)誕生以來(lái)，對(duì)酶學(xué)的研究與應(yīng)用技術(shù)也產(chǎn)生了深刻的影響?；蚬こ碳夹g(shù)不但促進(jìn)了基礎(chǔ)酶學(xué)的研究，如酶基因的克隆、酶催化機(jī)理的研究等，同時(shí)也促進(jìn)了酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用，奠定了現(xiàn)代食品酶學(xué)的重要發(fā)展方向。1.3酶的分類(lèi)和命名1.3.1酶的命名及面臨問(wèn)題1833年P(guān)ayen和Persoz發(fā)現(xiàn)麥芽提取液的酒精沉淀物中包含一種熱敏性物質(zhì)可將淀粉水解變?yōu)樘牵捎谄淠軓牟豢扇艿牡矸垲w粒中分離出可溶性的糊精，他們將此物質(zhì)命名為“diastase”，意思是“分離”（中文現(xiàn)譯為“淀粉酶”），這樣隨意的方式成為酶命名的開(kāi)端，后來(lái)命名一種酶時(shí)常加詞尾“ase”。在隨后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，出現(xiàn)了各種各樣的命名方式。有根據(jù)純化后酶的顏色來(lái)命名的，如老黃酶（oldyellowenzyme）；有根據(jù)酶的來(lái)源命名的，如無(wú)花果蛋白酶（ficin），胃蛋白酶（pepsin）；有根據(jù)酶作用的底物來(lái)命名的，如果膠酶（pectase）。問(wèn)題：命名混亂；一酶數(shù)名或一名數(shù)酶；不能體現(xiàn)酶所催化反應(yīng)的特性；1.3.2酶學(xué)委員會(huì)提出的命名規(guī)則酶學(xué)委員會(huì)提出以酶所催化的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)作為酶的分類(lèi)和命名規(guī)則的主要依據(jù)，每一種酶都給以三個(gè)名稱(chēng)：慣用名，系統(tǒng)名和一個(gè)數(shù)字編號(hào)。慣用名不需要非常的精確，要求比較簡(jiǎn)短，使用方便；一般根據(jù)酶所作用的底物名稱(chēng)、催化的反應(yīng)性質(zhì)、酶的來(lái)源或其他特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行命名。系統(tǒng)名要求能確切地表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性質(zhì)；包括兩部分，底物名稱(chēng)及反應(yīng)類(lèi)型；若酶催化的反應(yīng)中有兩種底物起反應(yīng)，則這兩種底物均需表明，當(dāng)中用“：”隔開(kāi)。若底物之一是水時(shí)，可將水略去不寫(xiě)。例：多酚氧化酶其系統(tǒng)名稱(chēng)為：1,2-苯二酚：氧-氧化還原酶。數(shù)字編號(hào)系統(tǒng)根據(jù)酶所催化反應(yīng)的類(lèi)型將酶分為6大類(lèi)，并以4個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字來(lái)對(duì)每一種酶進(jìn)行編號(hào)。例如乙醇脫氫酶，編號(hào)為EC1.1.1.1。EC是指酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommission）。第一個(gè)數(shù)字代表酶的6個(gè)大分類(lèi)，以1，2，3，4，5，6來(lái)分別代表如下6大酶類(lèi)：（1）氧化還原酶（Oxidoreductases）催化氧化還原反應(yīng)；（2）轉(zhuǎn)移酶（Transferases）催化分子間基團(tuán)轉(zhuǎn)移的反應(yīng)；（3）水解酶（Hydrolases）催化水解反應(yīng)；（4）裂合酶（Lyases）催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)；（5）異構(gòu)酶（Isomerases）催化分子的異構(gòu)反應(yīng)；（6）合成酶（synthetases）催化兩分子連接的反應(yīng)。1.3.3同工酶的命名

同工酶是指在生物體內(nèi)或組織中催化相同反應(yīng)而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)等）的酶。國(guó)際生化協(xié)會(huì)同工酶分委員會(huì)建議同工酶的名稱(chēng)根據(jù)他們?cè)陔娪局蟹蛛x的位置確定，從電泳中向著陽(yáng)極移動(dòng)最遠(yuǎn)的酶開(kāi)始依次編號(hào)。1.4.1酶對(duì)食品加工和保藏的重要性（1）控制食品原料中的酶活力有效改善食品原料的風(fēng)味和質(zhì)地結(jié)構(gòu)（2）利用酶的催化活性進(jìn)行食品加工及保藏1.4酶學(xué)對(duì)食品科學(xué)的重要性葡萄糖氧化酶作為除氧劑普遍應(yīng)用于食品保鮮及包裝中，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。溶菌酶在食鹽、蔗糖等溶液中穩(wěn)定，耐酸耐熱性強(qiáng)，是天然安全的食品防腐劑。1.4.2酶對(duì)食品安全的重要性（1）通過(guò)基因工程手段改造部分微生物基因，改變酶蛋白的基本結(jié)構(gòu)，達(dá)到強(qiáng)化酶在某方面功能特性的做法給食品酶的應(yīng)用帶來(lái)安全隱患。（2）酶作用會(huì)使食品品質(zhì)特性發(fā)生改變，有可能會(huì)產(chǎn)生毒素和其他不利于健康的有害物質(zhì)。如果將加入食品中的酶看作為食品添加劑，那么就應(yīng)該考慮到衛(wèi)生和安全方面的問(wèn)題。（3）利用酶法解毒。例如，利用乳糖酶預(yù)先處理乳制品，可以有效緩解或消除人體因消化乳糖困難而引起的胃脹氣、腹痛、嘔吐或拉肚子等癥狀。1.4.3酶對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)的重要性（1）酶作用有可能導(dǎo)致食品中營(yíng)養(yǎng)組分的損失。（2）利用酶作用去除食品中的抗?fàn)I養(yǎng)素，提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，使食品中的營(yíng)養(yǎng)元素更利于人體的吸收利用。1.4.4酶對(duì)食品分析的重要性酶法分析具有準(zhǔn)確、快速、專(zhuān)一性和靈敏性強(qiáng)等特點(diǎn)，其中最大優(yōu)點(diǎn)就是酶的催化專(zhuān)一性強(qiáng)。酶法分析的樣品一般不需要進(jìn)行很復(fù)雜的預(yù)處理，尤其適合食品這一復(fù)雜體系。1.4.5酶與食品生物技術(shù)食品生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要分支學(xué)科，主要研究基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程在食品工業(yè)上的應(yīng)用。酶工程的主要研究?jī)?nèi)容是把游離酶固定化，或者把經(jīng)過(guò)培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生目的酶活力高峰時(shí)的整個(gè)微生物細(xì)胞再固定化，然后直接應(yīng)用于食品生產(chǎn)過(guò)程中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。酶不僅作為一類(lèi)重要的研究對(duì)象，同時(shí)也作為重要的研究工具。課后思考1、酶的特性有哪些？2、國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)推薦的分類(lèi)和命名規(guī)則的主要依據(jù)是什么？3、酶對(duì)食品科學(xué)的重要性表現(xiàn)在哪些方面？第2章酶的生產(chǎn)與分離純化主要內(nèi)容

2.1國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀

2.2酶的發(fā)酵生產(chǎn)

2.3酶的分離純化

2.4酶分離、純化的評(píng)價(jià)

2.5酶的劑型與保存

工業(yè)酶制劑的主要來(lái)源：動(dòng)物：豬胰蛋白酶、胃蛋白酶植物：木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、麥芽淀粉水解酶微生物：酶的主要來(lái)源2.1國(guó)內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀

目前工業(yè)應(yīng)用的三大主要酶制劑：淀粉酶——烘焙、釀造、淀粉糖化、紡織業(yè)蛋白酶——去污劑、奶制品業(yè)、皮革業(yè)脂肪酶——去污劑、食品、精細(xì)化工2.1.2集中壟斷，市場(chǎng)全球化規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場(chǎng)90%丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）→1978年進(jìn)入中國(guó)諾維信公司，占50%市場(chǎng)（天津）；美國(guó)杰能科公司（Genencor）→98年進(jìn)入中國(guó)，與無(wú)錫合資，控股80%（無(wú)錫），兩家公司銷(xiāo)售額占全球2/3；（2005年杰能科國(guó)際公司被丹尼斯克公司收購(gòu)）；芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務(wù)合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，日本天野2.1.3品種、規(guī)模不斷擴(kuò)大目前30多家600多個(gè)品種，應(yīng)用于18個(gè)工業(yè)領(lǐng)域;我國(guó)2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬(wàn)噸，100家，市場(chǎng)份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主;國(guó)際以液體、顆粒為主;國(guó)內(nèi)糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類(lèi)占97%;重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國(guó)內(nèi)尚未投入生產(chǎn);我國(guó)有7家上市公司介入酶制劑開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。2.1.4應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大美國(guó)酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。2.2酶的發(fā)酵生產(chǎn)用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞需具備的條件：酶產(chǎn)量高容易培養(yǎng)和管理產(chǎn)酶穩(wěn)定性好利于酶的分離純化安全可靠

利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：(1)微生物種類(lèi)多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)微生物生長(zhǎng)繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3)微生物培養(yǎng)基來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜。(4)可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。(5)可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開(kāi)發(fā)新酶種。2.2.1產(chǎn)酶微生物

菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。目前投入工業(yè)酶發(fā)酵生產(chǎn)的菌種約有50～60種，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。2.2.2酶的發(fā)酵技術(shù)2.2.2.1培養(yǎng)基培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。

（1）碳源碳源是指能夠向細(xì)胞提供碳素化合物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。也是提供能量的能源。碳素是構(gòu)成細(xì)胞成分的主要元素之一，也是各種酶的重要組成元素。所以，碳源是酶發(fā)酵生產(chǎn)乃至其他產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。碳源的選擇：不同細(xì)胞對(duì)碳源的利用情況；碳源對(duì)酶合成的調(diào)節(jié)作用；原料的供求和價(jià)格最常用的碳源：淀粉及其水解物，如糊精、麥芽糖、葡萄糖等。

（2）氮源氮是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。凡是能夠向細(xì)胞提供氮元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都稱(chēng)為氮源。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩種，有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚(yú)粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無(wú)機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3PO4、尿素等。一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞要求無(wú)機(jī)氮。異氧型微生物用有機(jī)氮，自養(yǎng)型微生物用無(wú)機(jī)氮。

（3）碳氮比在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類(lèi)、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。一般蛋白酶

(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利；淀粉酶(包括α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比略高。

以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說(shuō)都是符合上述規(guī)律的。

（4）無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽的主要作用是提供細(xì)胞生命活動(dòng)不可缺少的無(wú)機(jī)元素，并對(duì)培養(yǎng)基的pH、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)元素需要量的大小可分為主要元素和微量元素兩大類(lèi)。

（5）生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子是指細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必不可缺的微量有機(jī)化合物，主要包括各種氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長(zhǎng)因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。

（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類(lèi)物質(zhì)稱(chēng)為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：誘導(dǎo)物和表面活性劑。產(chǎn)酶誘導(dǎo)物一般是酶作用的底物或底物類(lèi)似物，或是誘導(dǎo)物的前體物質(zhì)。生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，離子型的表面活性劑對(duì)微生物有害。

2.2.2.2發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)酶的影響(1)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響溫度是影響細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時(shí)，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來(lái)的熱量，這時(shí)，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨菌種和酶的性質(zhì)不同而異，二者往往不一致。如紅曲霉生長(zhǎng)溫度35~37℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37～40℃。生長(zhǎng)階段控制在最適生長(zhǎng)溫度，以利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖；產(chǎn)酶階段，溫度控制在產(chǎn)酶最適溫度。(2)pH對(duì)產(chǎn)酶的影響種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH通常接近該酶反應(yīng)的最適pH。一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。在發(fā)酵過(guò)程中，微生物不斷分解和同化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物。這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。這些變化常常引起細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對(duì)產(chǎn)酶帶來(lái)不利的影響。

生產(chǎn)中通常采用控制pH的方法：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C/N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過(guò)高時(shí)用糖或淀粉來(lái)調(diào)節(jié)，pH過(guò)低時(shí)，通過(guò)氮調(diào)節(jié)。(3)通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)酶的影響通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來(lái)說(shuō)，在發(fā)酵初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強(qiáng)度大，耗氧多，但由于菌體少，相對(duì)通風(fēng)量可以少些；菌體生長(zhǎng)繁殖旺盛期時(shí)，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時(shí)的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強(qiáng)烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過(guò)多反而抑制酶的生成。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動(dòng)測(cè)定和記錄溶解氧的儀表。(4)攪拌的影響攪拌有利于熱交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周?chē)拇x產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時(shí)可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細(xì)胞受損。同時(shí)攪拌也帶來(lái)一定機(jī)械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。(5)中間補(bǔ)料的影響中間補(bǔ)料是在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)物料，滿足微生物的代謝活動(dòng)和合成發(fā)酵產(chǎn)品的需要。中間補(bǔ)料可促使微生物在培養(yǎng)中期的代謝活動(dòng)受到控制，延長(zhǎng)發(fā)酵產(chǎn)物的分泌期，推遲菌種的自溶期，維持較高的發(fā)酵產(chǎn)物增長(zhǎng)幅度，并增加發(fā)酵體積，從而使單罐產(chǎn)量大幅度上升。(6)泡沫的影響泡沫的存在阻礙CO2的排除，影響溶氧量，同時(shí)泡沫過(guò)多影響補(bǔ)料，也易使發(fā)酵液溢出罐外造成跑料。消泡措施：機(jī)械消泡化學(xué)消泡

消泡劑主要是一些天然的礦物油類(lèi)、醇類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、胺類(lèi)、酰胺類(lèi)、醚類(lèi)、硫酸酯類(lèi)、金屬皂類(lèi)、聚硅氧烷和聚硅酮。理想的消泡劑，其表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。(7)濕度用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時(shí)，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。2.3酶的分離純化酶的分離純化目的在于獲得一定量的、不含或少含雜質(zhì)的酶制品或者提純?yōu)榻Y(jié)晶，以利于在科學(xué)研究或生產(chǎn)中的應(yīng)用。酶的分離純化的一般步驟包括選材、細(xì)胞破碎、酶的抽提、分離、純化、結(jié)晶，以及酶的純度鑒定和保存。材料的選擇及前處理破細(xì)胞抽提濃縮與初步提純注意點(diǎn)除了少數(shù)例外，所有操作都應(yīng)在低溫下條件下進(jìn)行，尤其在有有機(jī)溶劑存在時(shí)更應(yīng)特別小心大多數(shù)酶在pH<4或pH>10的情況下不穩(wěn)定，故必須控制整個(gè)系統(tǒng)不要過(guò)酸或過(guò)堿；同時(shí)要避免在調(diào)節(jié)pH時(shí)產(chǎn)生局部酸堿過(guò)量的現(xiàn)象。酶和其它蛋白質(zhì)一樣，常易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應(yīng)盡量減少泡沫形成。重金屬、有機(jī)溶劑等能使酶變性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞，所有這些也都應(yīng)予以足夠的重視。酶原料選擇的原則：酶含量多、干擾物質(zhì)少；來(lái)源豐富、保持新鮮；容易得到、提取工藝簡(jiǎn)單；穩(wěn)定性好、安全性好；有綜合利用價(jià)值2.3.1酶原料的選擇2.3.2.1生物組織的破碎

(1)研磨法/組織搗碎法利用機(jī)械力的攪拌、剪切、研碎細(xì)胞。常用的有高速組織搗碎機(jī)、高壓勻漿泵、或直接用研缽研磨等。2.3.2酶的提取(2)超聲波法使用超聲波破碎儀所產(chǎn)生的超聲波（10-15kHz）機(jī)械震動(dòng)后對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生的空化作用使細(xì)胞破碎。主要問(wèn)題：

超聲空穴局部過(guò)熱引起酶活性喪失，所以超聲振蕩處理的時(shí)間應(yīng)盡可能短，容器周?chē)员±鋮s處理，盡量減小熱效應(yīng)引起的酶失活。(3)滲透壓法細(xì)胞在高滲溶液（如蔗糖溶液）中平衡一段時(shí)間后，突然轉(zhuǎn)入低滲溶液中，細(xì)胞壁由于滲透壓的突然變化而溶脹破碎。該方法對(duì)具有堅(jiān)韌的多糖細(xì)胞壁的細(xì)胞，如植物、細(xì)菌和霉菌不太適用，除非用其他方法先除去這些細(xì)胞外層堅(jiān)韌的細(xì)胞壁。(4)凍融法細(xì)胞在低溫冰凍后再在室溫融化，反復(fù)凍融就能使細(xì)胞壁破裂。所需設(shè)備簡(jiǎn)單，普通家用冰箱的冷凍室即可進(jìn)行凍融。一般需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、絡(luò)合劑EDTA、還原劑DTT(二硫蘇糖醇)等以防破壞目的酶。(5)酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對(duì)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的酶解作用，使細(xì)胞崩解破碎。將革蘭氏陽(yáng)性菌(如枯草桿菌)與溶菌酶一起溫育，就能得到易破碎的原生質(zhì)體；幾丁質(zhì)酶和3－葡聚糖酶則常用于水解曲霉、面包霉等的細(xì)胞壁。(6)化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。常用的化學(xué)試劑分為有機(jī)溶劑和表面活性劑兩大類(lèi)。①有機(jī)溶劑處理常用的有機(jī)溶劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿。有機(jī)溶劑可使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過(guò)性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。②表面活性劑處理表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過(guò)性。丙酮干粉的制備破細(xì)胞等處理后可將材料制成丙酮干粉(acetonepowder)，一般程序是：先將材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低溫條件下，加入5~10倍預(yù)先冷至約-20℃的丙酮。迅速攪拌均勻，隨即過(guò)濾，最后低溫干燥，研磨過(guò)篩。丙酮處理一方面能有效地破壞細(xì)胞壁，另一方面有利于除去大量的脂類(lèi)雜質(zhì)，同時(shí)還能使某些膜結(jié)合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。2.3.2.2酶的提取

酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過(guò)程，也稱(chēng)作酶的抽提。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過(guò)程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。抽提劑由于大多數(shù)酶屬于球蛋白類(lèi)，一般都溶于稀鹽、稀酸或稀堿溶液。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及如何最有利于切斷酶和其他物質(zhì)的聯(lián)系。

抽提液＝離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑十pH緩沖劑＋溫度效應(yīng)劑

(KCl、NaCl、蔗糖)(各種緩沖液)(甘油、二甲基亞砜)

＋蛋白酶抑制劑＋防氧化劑

(PMSF、DIFP)(DTT巰基乙醇)

＋重金屬絡(luò)合劑＋增溶劑

(EDTA、檸檬酸)(TritonX－100)典型的抽提液由以下幾部分組成：酶的主要提取方法(1)鹽溶液提取大多數(shù)酶溶于水，而且在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，這稱(chēng)之為鹽溶現(xiàn)象，然而鹽濃度不能太高，否則溶解度反而降低，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。一般采用稀鹽溶液進(jìn)行酶的提取，鹽濃度一般控制在0.02~0.5mol/L。α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的氯化鈉溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸緩沖液提??；酵母醇脫氫酶用0.5~0.6mol/L的磷酸氫二鈉溶液提??；6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L的碳酸鈉提?。嚎莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1mol/L的氯化鎂提取。(2)酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。例如，從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液進(jìn)行提取。

(3)堿溶液提取有些在堿性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶，應(yīng)采用堿溶液提取。例如，細(xì)菌L-天門(mén)冬酰胺酶的提取是將含酶菌體懸浮在pH11~12.5的堿溶液中，振蕩20min，即達(dá)到顯著的提取效果。(4)有機(jī)溶劑提取有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團(tuán)較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等2.3.3酶的純化

酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來(lái)或者將雜蛋白從酶溶液中除去?，F(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。

根據(jù)酶和雜蛋白的性質(zhì)差異，它們的分離方法可分為：（1）根據(jù)分子大小而設(shè)計(jì)的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過(guò)濾法等。（2）根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。（3）按分子所帶正負(fù)電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。（4）按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法等。（5）按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法、親和電泳法等。酶的分離純化方法酶的分離純化方法等電點(diǎn)沉淀法原理：在低離子強(qiáng)度下，調(diào)pH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶靜電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水能力使分子間相互吸引，形成沉淀。不同的酶和蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同，可以使pH達(dá)到某種酶的等電點(diǎn)，使其沉淀與其他物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：很多酶的等電點(diǎn)都在偏酸性范圍內(nèi)，而無(wú)機(jī)酸通常價(jià)格較廉，并且某些酸（如磷酸、鹽酸和硫酸）的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類(lèi)食品所允許。同時(shí)，也可直接進(jìn)行其他純化操作，無(wú)需將殘余的酸除去。缺點(diǎn)：酸化時(shí)易使酶失活，這是由于酶對(duì)低pH比較敏感。

鹽析法低濃度的中性鹽可增加電解質(zhì)類(lèi)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、酶及其復(fù)合物）的溶解度，被稱(chēng)為鹽溶現(xiàn)象；但當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度反而降低而沉淀出來(lái)，稱(chēng)為鹽析。原理：鹽離子與酶和蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，減弱了酶和蛋白質(zhì)的水合程度，使溶解度降低；鹽離子所帶電荷部分中和了酶和蛋白質(zhì)分子上所帶電荷，使其靜電荷減少，酶和蛋白質(zhì)也易沉淀。不同酶和蛋白質(zhì)會(huì)在不同的中性鹽濃度下析出。在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。有機(jī)溶劑沉淀法原理：

加入有機(jī)溶劑于酶溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來(lái)，使酶沉淀。其中主要效應(yīng)是水的活度的降低。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)酶分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，因而靜電吸力增大。在疏水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特別強(qiáng)的酶外，對(duì)多數(shù)酶來(lái)說(shuō)，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致酶分子聚集而沉淀。

優(yōu)點(diǎn)：

溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在成品中，因此適用于制備食品級(jí)酶。而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。缺點(diǎn)：容易使酶變性失活，且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。離心分離離心是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)，在酶的提取和分離純化過(guò)程中，細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。

按照離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速的不同可以分為常速(低速)、高速和超速三種。常速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力(RCF)在1×104g以內(nèi)，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為1×104~2.5×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1×104g~1×105g，主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.5×104~8×104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5×105g。超速離心可以采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。超速離心可用于酶分子的分離純化。透析與超過(guò)濾透析與超過(guò)濾技術(shù)是利用具有特定大小、均勻孔徑的透析膜或超濾膜的篩分機(jī)理，在不加壓（透析）或加壓（超過(guò)濾）的條件下把酶提取液通過(guò)一層只允許水和小分子物質(zhì)透過(guò)的透析膜或超濾膜，酶等大分子物質(zhì)被截流，從而達(dá)到把小分子物質(zhì)從酶提取液中除去（透析與超過(guò)濾）或同時(shí)達(dá)到濃縮酶液（超過(guò)濾）的目的。凝膠層析凝膠層析有多種名稱(chēng)，又稱(chēng)凝膠排阻層析、分子篩層析法、凝膠過(guò)濾法等。根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離的方法。根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同大小分子的排阻效應(yīng)不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離純化的技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：操作方便，不會(huì)使物質(zhì)變性，層析介質(zhì)不需再生，可反復(fù)使用等。由于凝膠層析劑的容量比較低，所以在生物大分子物質(zhì)的分離純化中，一般不作為第一步的分離方法，而往往在最后的處理中被使用。它的應(yīng)用主要包括脫鹽，生物大分子按分子大小分級(jí)分離以及分子量測(cè)定等。a.小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠內(nèi)部被截留；大分子被排阻在顆粒外，在顆粒間迅速通過(guò)。b.1.蛋白質(zhì)混合物上柱，2.洗脫開(kāi)始，小分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)大分子被排阻在顆粒外，3.小分子被截留，大分子向下移動(dòng)，大小分子分開(kāi)，4.大小分子完全分開(kāi)，5.大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進(jìn)中。（1）凝膠過(guò)濾層析的原理①聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，由丙烯酰胺與N，N－甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑共聚而成。商品名是生物膠-P（Bio－GelP），有各種型號(hào)，P－后的數(shù)字乘以1000表示其分離的最大分子量(即排阻分子量)。(2)凝膠種類(lèi)(2)凝膠種類(lèi)②交聯(lián)葡聚糖凝膠是分子量幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)的葡聚糖凝膠通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可分離分子量從l000~500000的分子。商品名是SephadexG。還有一種通過(guò)N，N－甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠（Sephacryl－S)，可適用于水、有機(jī)溶劑及高濃度解離試劑存在的系統(tǒng)。另一類(lèi)Sephadex－LH，適用于脂類(lèi)化合物的分離。③瓊脂糖凝膠瓊脂糖是瓊脂抽去瓊脂膠等之后所得D－半乳糖和3，6－脫水半乳糖，自動(dòng)締合而成的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)物質(zhì)，孔徑大小由膠的濃度決定。商品名為Sepharose.這類(lèi)凝膠孔徑都比較大，適于分離較大的物質(zhì)，如病毒、細(xì)胞顆粒和DNA等。離子交換層析離子交換層析是以纖維素或交聯(lián)葡聚糖凝膠等物的衍生物作為載體，在某一pH下，這些載體帶有正電荷或負(fù)電荷，而這時(shí)帶有相反電荷的酶分子若通過(guò)載體，由于靜電的吸引力，為載體所吸附。然后用電荷量更多，離子強(qiáng)度更高的緩沖液洗脫，通過(guò)離子交換作用使酶分子脫離載體而得以分離。離子交換劑由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成?；|(zhì)與電荷基團(tuán)以共價(jià)鍵相連，電荷基團(tuán)與反離子以離子鍵結(jié)合。根據(jù)其反離子與交換離子的不同，可以把離子交換劑分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。當(dāng)pH低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，能與陽(yáng)離子交換劑結(jié)合；當(dāng)pH高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，能與陰離子交換劑結(jié)合。常見(jiàn)的離子交換劑有DEAE-纖維素、DEAE-Sep