高分子物理何曼君第二章4

五、分子量分布的測(cè)定

－凝膠色譜法

GelPermeationChromatography1.基本原理2.分子量標(biāo)定曲線3.普適曲線4.凝膠色譜的注意事項(xiàng)要求：重點(diǎn)掌握凝膠色譜基本原理與數(shù)據(jù)處理凝膠色譜的發(fā)展簡(jiǎn)史

凝膠色譜是十幾年前才發(fā)展起來的一種新型液體色譜，是色譜中最新的分離技術(shù)之一．它的分離基礎(chǔ)主要根據(jù)溶液中分子體積(流體力學(xué)體積)的大小．用多孔性物質(zhì)來按分子體積大小進(jìn)行分離，在五十年前就已有報(bào)道．McBain用人造沸石成功地分離氣體分子和低分子量的有機(jī)化合物．1953年wheaton和BauMan用離子交換樹脂按分于量大小分離了苷、多元醇和其它非離子物質(zhì)．1959年P(guān)orath和Flodin用交聯(lián)的縮聚葡糖制成凝膠來分離水溶液中不同分子量的試樣．這類凝膠立即以商品名稱“Sephadex”出售，在生物化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)得到非常廣泛的應(yīng)用，這是凝膠色譜技術(shù)在水溶性試樣的分離中首次取得推廣應(yīng)用，成為生物化學(xué)中一項(xiàng)常用的分離手段．在生物化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，這種分離技術(shù)被命名為凝膠過濾．有機(jī)溶劑體系的凝膠色譜首先需要解決適用于有機(jī)溶劑的凝膠的制備問題．凝膠的制備花了幾年功夫才獲得成．1964年，Moore以苯乙烯和二乙烯苯在不同的稀釋劑存在下制成一系列孔徑不同的凝膠，這些凝膠可以在有機(jī)溶劑中分離分子量從幾千到幾百萬的試樣．翌年，Maly以示差折光儀為濃度檢測(cè)器、以體積指示器為分子量檢測(cè)器制成凝膠色譜儀，這些凝波和儀器立即被制成商品出售．這樣，凝膠色譜技術(shù)很快就在高分子科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用，作為一種快速的分子量和分子量分布測(cè)定方法，取得很好結(jié)果，并被譽(yù)為近年來這方面一項(xiàng)技術(shù)上的重要突破．

優(yōu)點(diǎn)：①快速（測(cè)定周期短）②操作簡(jiǎn)便③數(shù)據(jù)可靠、重復(fù)性好，比以往的分級(jí)快十幾倍到幾十倍它已成為高化、生化、有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要的分離和分析手段由于歷史原因，凝膠色譜的理論發(fā)展、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和應(yīng)用開發(fā)主要在生物化學(xué)和高分子化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)．對(duì)這項(xiàng)新技術(shù)，不同的工作者采用了不同的命名，這就造成了文獻(xiàn)中命名方面的混亂．文獻(xiàn)中用過的名稱有：凝膠過濾(gelfiltration)，分子篩過濾(molecularsievefiltration)，分子篩色譜(molecularsievechromatography)，排除色譜(exclusionchromatography)，分子排除色譜(molecularexclusionchromatography)，凝膠排除色譜(gelexclusionchromatography)．有限擴(kuò)散色譜(restricteddiffusionchromatography)，凝膠擴(kuò)散色譜(geldiffusionchromatography)．體積色譜(stericchromatography)，凝膠滲透色譜(gelpermeationchromatography)，液體排除色譜(Liquidexclusionchromatography)，凝膠色譜(gelchromatography)和體積排除色譜(sizeexclusionchromatography)．一般來說，在生物化學(xué)界中常用的名稱是凝膠過濾，在高分子化學(xué)界中常用的名稱是凝膠滲透色譜(簡(jiǎn)稱GPC)．眾說不一，主要是體積排除法體積排除法：限制擴(kuò)散機(jī)理流動(dòng)分離機(jī)理1.基本原理基本原理①分離的核心部件是一根裝有高孔性載體的色譜柱，柱中充滿溶劑。②高孔性載體表面和內(nèi)部有著各種大小不同的空洞和通道色譜柱示意圖

（內(nèi)含載體與溶劑）多孔性載體（填料）載體顆粒形貌圖，尺寸在5um-50um左右顆粒表面形態(tài)結(jié)構(gòu)圖孔尺寸在幾-幾十納米V0：粒間體積Vi：孔內(nèi)體積柱內(nèi)全部空間體積：V0+Vi全部由溶劑充滿。③高分子試樣位于柱頂，利用溶劑進(jìn)行恒速淋洗:溶質(zhì)隨溶劑帶動(dòng)向下運(yùn)動(dòng)。最后流經(jīng)整個(gè)色譜柱被淋洗出來。柱后收集的帶溶質(zhì)的溶液稱為淋洗液從淋洗開始到溶質(zhì)分子被帶出所收集的淋洗液體積稱為該溶質(zhì)分子的淋出體積Ve

:Ve當(dāng)試樣隨溶劑進(jìn)入柱中后（1）比載體的最大的孔還要大的分子只能隨溶劑流經(jīng)載體顆粒之間，走的路徑最短，最先淋洗出。大尺寸分子的淋出體積為V0（被排除體積）Ve（2）尺寸小于所有空洞的小分子除了走顆粒間、還要進(jìn)入顆粒內(nèi)的孔，走的路徑最多，所以最后被溶劑沖洗出來，淋出體積為V0＋Vi溶劑的淋出體積Ve是V0＋Vi（3）尺寸居中的分子除了走顆粒間的路徑，還可以進(jìn)入部分孔洞，流經(jīng)路徑在大尺寸分子與小尺寸分子之間，在兩者之間被淋洗出來淋出體積：

K：分配系數(shù)，溶質(zhì)分子能夠進(jìn)入的孔體積與Vi之比。不同尺寸的分子，進(jìn)入孔洞的能力不同，K值不同。④總之，體積大小不同進(jìn)入孔洞的能力不同，流經(jīng)路徑長(zhǎng)短不同，淋洗出色譜柱的順序不同：分子量大的淋出體積小，分子量小淋出體積大由此，尺寸不同的分子得以分級(jí)。排除體積理論凝膠滲透色譜分離過程凝膠滲透過程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠凝膠色譜儀流程濃度檢測(cè)裝置橫坐標(biāo)：淋出體積縱坐標(biāo)：溶液濃度凝膠滲透色譜圖：如何轉(zhuǎn)為分子量分布曲線？（濃度、分子量）需要測(cè)量各個(gè)級(jí)分分子量的大小與含量。色譜柱的擴(kuò)展效應(yīng)凝膠滲透色譜是將各個(gè)級(jí)分按分子量大小不同分離開來，還不是分子量分布圖。⑤測(cè)定不同淋出體積高分子的分子量，將濃度-淋出體積曲線轉(zhuǎn)化為分子量分布圖

直接法：淋洗液直接經(jīng)過粘度計(jì)或光散射檢測(cè)器測(cè)量各級(jí)分的分子量間接法：求M-Ve的關(guān)系？2.分子量－淋出體積標(biāo)定曲線作法：一組分子量不等的單分散試樣作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別測(cè)量其淋出體積與相應(yīng)的分子量。凝膠色譜：測(cè)淋出體積Ve，試樣濃度（紫外、紅外、折光指數(shù)儀）其他儀器測(cè)分子量（粘度計(jì)、光散射與之聯(lián)用）Ma：滲透極限：V0的測(cè)定Mb：接近V0＋Vi分離范圍：利用標(biāo)定曲線，已知Ve則可求待測(cè)試樣的M。最終可求試樣的分子量與分子量分布結(jié)構(gòu)不同的高分子，分子量相同，在溶液中尺寸不同，淋出體積不同，lnM-Ve曲線不同，因此，不同結(jié)構(gòu)的高分子須重新標(biāo)定lnM-Ve曲線。困難：很多高分子難以獲得分子量單分散樣品，lnM-Ve曲線難以標(biāo)定

能否尋求一個(gè)與分子量相關(guān)參量，其值僅和分子的尺寸相關(guān)，那么，分子結(jié)構(gòu)不同的高分子可以適用同一條標(biāo)定曲線（不同結(jié)構(gòu)曲線重合）?3.普適標(biāo)定曲線Einstein粘度公式普適標(biāo)定曲線Universalcalibrationcurve

普適標(biāo)定曲線兩種高分子的lgM-Ve曲線不重合，但普適曲線重合利用普適曲線測(cè)分子量分布普適曲線已標(biāo)定測(cè)量待測(cè)試樣的淋出體積，利用普適曲線求出普適曲線的偏離情況原因：分離機(jī)理受到干擾。①不良溶劑②溶劑極性小于載體的極性③溶質(zhì)與載體的相容性不好對(duì)于待定體系，必須經(jīng)過證明方可使用普適曲線4.凝膠色譜注意事項(xiàng)載體、溶劑的選用分子量－淋出體積的標(biāo)定普適標(biāo)定曲線試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理（1）試驗(yàn)過程①色譜柱的制備：——②淋洗（測(cè)Ve與濃度）——③分子量的測(cè)定——④試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠是應(yīng)用最廣泛的一類凝膠，國外商品名為Sephadex。它由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，是以氫鍵交聯(lián)的。它與葡聚糖不同，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達(dá)到的。瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離操作的適宜工作條件是在pH為4.5～9，溫度0～40℃。瓊脂糖凝膠對(duì)硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。色譜柱中凝膠種類與選擇－－－一般了解即可聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的。其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時(shí)不會(huì)有凝膠物質(zhì)被洗脫下來。在pH2~11范圍穩(wěn)定。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。疏水性凝膠常用的疏水凝膠為聚甲基丙烯酸酯凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝膠?！癝tyrogel”商品有11種型號(hào)，具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測(cè)定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好。多孔玻璃珠多孔玻璃珠的化學(xué)和物理穩(wěn)定性號(hào)，機(jī)械強(qiáng)度高，不但抵御酶及微生物的作用，還能夠耐受高溫滅菌和較強(qiáng)烈的反應(yīng)條件。缺點(diǎn)是親水性不強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特性性吸附，而且可供連接的化學(xué)活性基團(tuán)也少。其他載體由聚丙稀酰胺和瓊脂糖混合組成的載體已投入應(yīng)用。它的特點(diǎn)是載體既有羥基又有酰胺基，并且都能單獨(dú)與配基使用。但這類載體不能接觸強(qiáng)堿，為了避免酰胺水解，使用溫度不能超過40℃。GPC柱，填料為苯乙烯，二乙烯基苯多孔滲水性的凝膠，其粒子的孔徑分布很寬，因此具有很寬的線形范圍。有三種尺寸