一種測定葡萄糖的方法

一種測定葡萄糖的方法在烷基糖昔合成過程中，應(yīng)用DNS為顯色劑的分光光度法對(duì)烷基糖昔合成過程中葡萄糖的分析測定進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明：采用玻璃比色皿，在最大吸光度為510nm波長，葡萄糖濃度范圍為1.6-40.9ug?mL-i,吸光度與葡萄糖濃度滿足線性關(guān)系具有良好的線性關(guān)系，吸光度與葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.0109c,摩爾吸光系數(shù)為1962mol-i?L?cm-i，相關(guān)系數(shù)為0.9992，回收率在97%-103%之間，顯色體系中含有脂肪醇及烷基糖昔對(duì)體系吸光度沒有影響。DNS顯色分光光度法用于烷基糖昔水解體系還原糖含量的測定可行，該方法方便快捷、準(zhǔn)確度高?；瘜W(xué)分析法是應(yīng)用葡萄糖分子結(jié)構(gòu)中含有醛基的特點(diǎn)進(jìn)行分析測定，一般是采用裴林試劑測還原糖的方法，葡萄糖具有還原性，可用還原糖法的測定方法測定，但是還原糖法特異性較差，如果樣品中混有其他還原糖可使結(jié)果偏高。優(yōu)點(diǎn)是方法簡單、實(shí)用，缺點(diǎn)是通常適用于高濃度系統(tǒng)，但是體系中混有溶劑時(shí)，此方法觀察終點(diǎn)不明顯。分光光度法測定葡萄糖分為蔥酮顯色法和DNS顯色法，但是由于蔥酮顯色法實(shí)在酸性體系中顯色，而酸性體系烷基糖昔存在水解副反應(yīng)的發(fā)生，影響測定結(jié)果，也不能用于烷基糖昔合成體系中的葡萄糖測定［5,6］。而分光光度法中采用DNS顯色法在堿性體系中顯色，烷基糖昔在堿性體系中穩(wěn)定，是合適的分析測定方法。為了獲得控制萄糖直接與高碳脂肪醇進(jìn)行縮合反應(yīng)生成烷基糖昔反應(yīng)過程中葡萄糖的濃度，采用斐林試劑滴定，由于由N-甲基毗咯烷酮的存在，測定突變點(diǎn)無法確定。探討了顯色劑用量、顯色時(shí)間、顯色體系堿濃度對(duì)吸光度的影響，考察了測定系統(tǒng)中脂肪醇、烷基糖昔存在對(duì)測定經(jīng)過的干擾情況。為改善萄糖與高碳脂肪醇進(jìn)行縮合反應(yīng)過程，提高合成烷基糖昔反應(yīng)過程的速度、進(jìn)一步提高烷基糖昔產(chǎn)品的質(zhì)量，也為研發(fā)葡萄糖顆粒與脂肪醇的新工藝技術(shù)提供分析測定的可靠方法。葡萄糖具有醛基，具有還原性，堿性條件下可將3,5-二硝基水楊酸還原為3-氨基-5-硝基水楊酸，而3-氨基-5-硝基水楊酸在堿性條件下成橘紅色，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下具有最大吸收，并且在一定葡萄糖濃度范圍內(nèi)與其最大吸收波長下的吸光度成線性關(guān)系，本質(zhì)為3-氨基-5-硝基水楊酸濃度與其最大吸收波長下的吸光度成線性關(guān)系，通過吸光度與3-氨基-5-硝基水楊酸濃度線性關(guān)系以及葡萄糖濃度與產(chǎn)物3-氨基-5-硝基水楊酸濃度反應(yīng)關(guān)系的線性建立聯(lián)系，從而以葡萄糖濃度和吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測定樣品吸光度對(duì)應(yīng)算出樣品中葡萄糖濃度，此外，配方中其他成分主要是去除試劑中的游離氧和增強(qiáng)并穩(wěn)定顯色效果［⑶。利用各種糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來。對(duì)非還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成還原性單糖進(jìn)行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(常以葡萄糖含量計(jì))。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類。單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，例如乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。還原糖在堿性條件下加熱可被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，而氧化劑3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)在540nm波長下測定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以系數(shù)0.9。DNS顯色劑配制稱取6.5g的DNS溶解于加熱至約50°C的300mL水中，移入lOOOmL的容量瓶中，再稱取24.1g氫氧化鈉溶解于水300mL水中配制成2mol?L-1氫氧化鈉溶液移lOOOmL容量瓶中，之后加入丙三醇46.1g，振蕩均勻，待溶液冷卻后定容并振蕩均勻，即得DNS試劑(28.5mmol.L-1),貯于棕色試劑瓶中避光保存?zhèn)溆?。葡萄糖?biāo)準(zhǔn)溶液配制稱取一水葡萄糖1.1361g加適量水溶解后移入1000mL的容量瓶中，定容后振蕩均勻成為1.0225mg.mL-1的葡萄糖標(biāo)液(5.7mmol?L-1)。貯于試劑瓶中貼標(biāo)簽備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及葡萄糖回收率的測定用逐級(jí)稀釋方法配制不同濃度的葡萄糖溶液，分別移取2mL上述溶液于試管中，并移入氫氧化鈉溶液和顯色劑，經(jīng)顯色反應(yīng)數(shù)分鐘后靜置一段時(shí)間，后移入50mL容量瓶中定容，測定其紫外可見光譜，以吸光度A對(duì)濃度作圖即得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制不同濃度的葡萄溶液使葡萄糖濃度范圍在所做標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，分別移取2mL上述溶液于試管中，并移入氫氧化鈉溶液和顯色劑，經(jīng)顯色反應(yīng)數(shù)分鐘后靜置一段時(shí)間，后移入50mL容量瓶中定容，測定其紫外可見光譜得到吸光度，通過葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)葡萄糖濃度，即得到葡萄糖的回收率。圖1為DNS（蒸餾水為參比）的紫外可見吸收光譜，圖2為消除DNS試劑吸光度影響后不同濃度葡萄糖c對(duì)應(yīng)顯色產(chǎn)物的紫外可見吸收光譜。0.0350400 450 500Wavelength/nm0864210.0350400 450 500Wavelength/nm086421aaaaecnaDrosDA300圖1DNS的紫外可見吸收光譜Fig.1TheUVandVisspectraoftheDNS

ecnaDrosb0.000.05480 500 520 540 560 580Wavelength/nm5■2ecnaDrosb0.000.05480 500 520 540 560 580Wavelength/nm5■25Oaa600圖2消除DNS吸光度影響后不同濃度葡萄糖對(duì)應(yīng)顯色產(chǎn)物的紫外可見光譜Fig.2TheUVandVisspectraofthechromogenicproduct

c/“g?mL-l：—28.6；—.—20.4；—▲—12.2；—4.0由圖1試劑DNS的紫外吸收光譜可知，在波長為370nm處出最大吸收波長。最大吸收波長370nm為DNS的最大吸收波長。除此之外，DNS本身為黃色，在可見光區(qū)有吸收，但是未出現(xiàn)最大吸收波長。由圖2可知，在500nm左右小范圍內(nèi)不同葡萄糖濃度顯色溶液譜圖均出現(xiàn)了最大吸收波長，此處離DNS的最大吸收波長370nm較遠(yuǎn)，因此受DNS吸光度影響較小，考慮到最大吸收波長較小范圍的紅移或藍(lán)移，故選取波長510nm為氨基化合物的最大吸收波長。顯色劑的用量圖3為最大吸收波長510nm處DNS與葡萄糖摩爾比對(duì)顯色體系吸光度的影響曲線。1.80.40.21.80.40.2_ecnaDrospA,i ,i ,i ,i ,i ,i ,0.00 1 2 3 4 5 6 7Moleratio圖3DNS與葡萄糖摩爾比對(duì)顯色體系吸光度的影響曲線Fig.3TheeffectofthemoleratioofDNSandglucoseonthechromogenicsystemofabsorbance由圖3可知，隨著顯色劑DNS量的不斷增加，氨基化合物的在最大吸收波長510nm處的吸光度不斷增加并趨向平穩(wěn)，這是由于隨著DNS量的增加葡萄糖不斷反應(yīng)最終完全反應(yīng)，顯色產(chǎn)物氨基化合物的吸光度隨之不再變化，即DNS與葡萄糖摩爾比為4：1后，氨基化合物的吸光度基本不發(fā)生變化，因此DNS顯色分光光度計(jì)定量測定葡萄糖的DNS與葡萄糖摩爾不低于4：1,為了提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)中均移取DNS試劑2mL，顯色體系中DNS與葡萄糖摩爾不低于4：1，確保顯色體系中葡萄糖完全反應(yīng)。顯色反應(yīng)時(shí)間的選擇圖4為最大吸收波長510nm處顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色體系吸光度的影響曲線。ecnaDrosDA00n?1tecnaDrosDA00n?1t圖4顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色體系吸光度的影響曲線Fig.4Theeffectofthechromogenictimeonthechromogenicsystemofabsorbance由圖4可知，葡萄糖與DNS試劑在沸水浴條件下反應(yīng)很快，在沸水浴顯色反應(yīng)9min后，最大吸收波長處的吸光度不再發(fā)生變化，這是由于在DNS與葡萄糖反應(yīng)已經(jīng)充分，生成的顯色產(chǎn)物的量也不再發(fā)生變化，為確保葡萄糖反應(yīng)完全,因此可取沸水浴顯色反應(yīng)時(shí)間為9min。堿液濃度的選擇圖5為最大吸收波長510nm顯色反應(yīng)過程中不同堿液濃度勺對(duì)顯色體系吸光度的影響曲線。0.905■8ecnaDrospA757060

a2030CmmLO?4g70800.905■8ecnaDrospA757060

a2030CmmLO?4g7080圖5不同堿液濃度對(duì)顯色體系吸光度的影響曲線Fig.5Theeffectofthelyeconcentrationonthechromogenicsystemofabsorbance由圖5可知，葡萄糖與DNS試劑在沸水浴條件反應(yīng)過程中，隨著堿液量的增加，吸收波長510nm處的吸光度不斷增大，并在氫氧化鈉濃度為23mg/mL后達(dá)到平衡，隨后隨著氫氧化鈉濃度的增加，吸光度不再發(fā)生變化，即在一定氫氧化鈉濃度范圍內(nèi)體系堿溶液濃度對(duì)反應(yīng)有影響，而堿溶液達(dá)到一定濃度后對(duì)吸光度沒有影響。這是由于顯色反應(yīng)是在堿性條件下可將3,5-二硝基水楊酸還原為3-氨基-5-硝基水楊酸，堿液濃度不足葡萄糖難以反應(yīng)完全。因此顯色反應(yīng)過程中氫氧化鈉濃度應(yīng)不低于23mg/m1，在本實(shí)驗(yàn)中顯色反應(yīng)均加入ImL的4mol?L-i，確保葡萄糖完全參與反應(yīng)。顯色反應(yīng)后光照對(duì)顯色溶液吸光度的影響圖6為兩種葡萄糖濃度（36.8》g?mL-1和40.0pg?mL-i）分別在光照和避光條件下不同波長出顯色溶液吸光度隨時(shí)間的變化關(guān)系圖。0.8ecnaDrospA2030405060n?10.8ecnaDrospA2030405060n?1m圖6顯色體系吸光度隨時(shí)間變化關(guān)系圖Fig.6Thediagramofchromogenicsystemabsorbancechangewithtime-.-40.0pg/ml,光照，470nm；-40.0pg/ml,光照，510nm；-36.8pg/ml,避光，510nm.；-36.8pg/ml,避光，470nm由圖6可知，葡萄糖與DNS試劑在顯色反應(yīng)后所得的顯色溶液，在光照條件下，吸收波長510nm處的吸光度基本保持不變，此波段主要受顯色產(chǎn)物吸光度的影響，可見顯色產(chǎn)物吸光度不受光照影響。在光照條件下，吸收波長470nm處隨著時(shí)間的延長吸光度明顯減少，這是由于在DNS對(duì)光照敏感，而在此處DNS影響仍然存在。此外，在避光條件下，在吸收波長為470nm和510nm處，吸光度均沒有明顯的變化，即在避光條件下，放置時(shí)間對(duì)顯色后溶液的吸光度沒有影響。因此，在定量測定葡萄糖時(shí)，顯色反應(yīng)后的溶液最好立刻進(jìn)行光度測定，若不能及時(shí)測量，則要避光保存，以確保定量的準(zhǔn)確性。顯色反應(yīng)過程中烷基糖苷量對(duì)顯色溶液吸光度的影響表1為在體系中加入不同量的一定濃度烷基糖苷后經(jīng)顯色反應(yīng),510nm處不同烷基糖苷量VA對(duì)應(yīng)體系吸光度。表1不同烷基糖苷量下顯色溶液的吸光度Table1.TheabsorbanceofchromogenicsolutionindifferentalkylglucosidequantityVA/mL0.51.01.52.02.53.0A0.7170.7190.7130.7160.7120.714由表1可知，葡萄糖與DNS試劑在顯色反應(yīng)過程中，隨著烷基糖苷量的增加，吸收波長510nm處的吸光度基本保持不變，這是由于烷基糖苷在堿性溶液中化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性都非常好，不會(huì)因分解產(chǎn)生葡萄糖而影響最大吸收波長處的吸光度，并且烷基糖苷在可見光區(qū)沒有吸收，而在紫外區(qū)吸收很弱，因此DNS顯色分光光度計(jì)可用于含有烷基糖苷體系的還原糖的定量測定。顯色反應(yīng)過程中癸醇量對(duì)顯色溶液的影響表2為在體系中加入不同量的飽和癸醇水溶液后經(jīng)顯色反應(yīng),510nm處不同癸醇量VD對(duì)應(yīng)顯色溶液吸光度。表2不同癸醇量下顯色溶液的吸光度Table2.TheabsorbanceofchromogenicsolutionindifferentalcoholdecanolquantityVD/mL01.02.03.04.05.0A0.6980.6950.6940.6970.6930.696由表2可知，葡萄糖與DNS試劑在沸水浴條件反應(yīng)過程中，隨著癸醇飽和水溶液量的增加，最大吸收波長510nm處的吸光度基本保持不變，這是由于癸醇此過程中不參加反應(yīng)，同時(shí)體系為均相，并且癸醇在可見光區(qū)沒有吸收，而在紫外區(qū)吸收很弱，因此DNS顯色分光光度計(jì)可用于含有脂肪醇體系的還原糖的定量測定，但是要確保在測定過程中稀釋后脂肪醇完全溶解。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線選取了500nm、510nm、530nm、550nm四個(gè)波長進(jìn)行對(duì)比選擇。表3為對(duì)不同波長處的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合所得的參數(shù)，圖7為以510nm波長處為例進(jìn)行的線性擬合圖。

ecnaDrosDA表3不同波長處對(duì)應(yīng)線性擬合參數(shù)ecnaDrosDATable3.ThelinearfittingparametersofdifferentwavelengthsA/nm斜率B摩爾吸mol-1?L?cm-1光系；數(shù)i相關(guān)系數(shù)R標(biāo)準(zhǔn)偏差SD5000.010919620.99760.01205100.010218360.99920.00645300.007413320.99940.00405500.00407200.99930.00240.00 10 20 30 40 50c/|jg?mL-1圖7吸光度與葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7ThecurvesofabsorbanceAversusconcentrationcofglucose由表3可知，在四個(gè)波長下的葡萄糖濃度和對(duì)應(yīng)吸光度在葡萄糖濃度范圍為1.6-40.9》g?mL-i內(nèi)線性相關(guān)性均良好，其中吸收波長510nm和530nm處的線性相關(guān)性最好，如圖7,最大吸收波長500nm處的線性相關(guān)性比波長510nm和530nm處小的原因在于體系最大吸收波長的紅移或藍(lán)移的影響，而在波長510nm處此影響已相對(duì)減弱?？梢奃NS顯色分光光度計(jì)用烷基糖苷體系中測定還原糖在較大的波長范圍應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法都有較好的線性相關(guān)性。標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定還原糖的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定回收率同樣選取了500nm、510nm、530nm、550nm四個(gè)波長進(jìn)行對(duì)比選擇。表4為不同波長不同葡萄糖濃度下對(duì)應(yīng)的顯色溶液吸光度及計(jì)算所得回收率。表4不同波長處回收率Table4.Therecoverypercentofdifferentwaveleng