基因工程操作原理-基因工程

Geneengineering基因工程內(nèi)容簡(jiǎn)介基因工程，是生命科學(xué)的核心學(xué)科之一。它以類似于工程學(xué)的方法與技術(shù)，對(duì)生命元件進(jìn)行設(shè)計(jì)、構(gòu)建、組裝和應(yīng)用，有目的地改造生物物種生產(chǎn)出人們所期望的生命物質(zhì)?；蚬こ碳夹g(shù)的顯著特點(diǎn)是，打破了常規(guī)育種難以突破的物種界限，使原核、真核生物之間，動(dòng)植物之間，以至人與其他生物之間的遺傳信息進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)移。本課程主要介紹基因工程概述、基因工程操作原理（從基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制入手，將DNA重組技術(shù)歸納為切、接、轉(zhuǎn)、增、檢五大基本操作單元）、基因工程應(yīng)用（按照受體細(xì)胞的生物學(xué)分類，逐一展開各系統(tǒng)基因工程的原理和應(yīng)用）。基因工程的地位基因工程生命科學(xué)分子生物學(xué)生物工程FieldafteroneroundofapplicationofRoundupherbicideTransgenictomatoplantsshowresistance(left)whilenon-transformedplantsaresusceptibletocucumbermosaicvirusunderfieldconditions(right)

/online/feature/BioTechnology/Images/2.4.jpgInsectinfestationonBt(right)andnon-Bt(left)cottonbolls/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpgWild-typecornshowinginfestation-BtcornisresistanttothisPotatoesareoneofmanyplantsbeingusedtoproducevaccines/sept_issue/images/breakthrough/veggievaccine.jpgGoldenriceandnormal(white)

/wsjbiotech.html嗯？！真的？預(yù)防傳染?。∵€不快吃愣什么！DNAISEVERYWHERE植物？動(dòng)物？物種？1.基因工程概述（2）2.分子克隆工具酶（3）3.分子克隆載體（2）4.人工染色體載體（1）5.表達(dá)載體（2）6.基因工程技術(shù)（8）7.基因工程應(yīng)用（8）8.基因工程產(chǎn)品的安全及其管理（2）9.答疑及課程考核（2）授課內(nèi)容及學(xué)時(shí)安排組成部分：

平時(shí)考勤：10%

課外作業(yè)：20%

期末考查：70%作業(yè)要求：按時(shí)完成獨(dú)立思考書寫整齊成績(jī)考核第一章基因工程概述主要教學(xué)內(nèi)容1.1基因工程與基因操作的基本概念1.2基因工程的誕生與發(fā)展1.3基因工程的研究?jī)?nèi)容1.4基因操作的理論基礎(chǔ)1.5基因工程的應(yīng)用1.6基因工程的安全性掌握基因工程的基本概念；熟悉基因工程的主要研究?jī)?nèi)容，發(fā)展歷程；了解基因工程的應(yīng)用及安全性。重點(diǎn)與難點(diǎn)基因工程的概念及研究?jī)?nèi)容；基因工程技術(shù)的特點(diǎn)。教學(xué)目標(biāo)與要求教學(xué)要求與傳統(tǒng)育種相比，基因工程育種有哪些特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)？簡(jiǎn)述基因工程的主要步驟?；蚬こ碳夹g(shù)存在哪些潛在危害？簡(jiǎn)述基因的結(jié)構(gòu)組成對(duì)基因操作的影響。需掌握專業(yè)詞匯

geneengineering；clone。問題與思考1.1基因工程的基本概念1.1.1重組DNA技術(shù)的基本定義重組DNA技術(shù)是將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳，并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。(1)基因工程：通過基因操作來定向改變或修飾生物體或人類自身，并具有明確應(yīng)用目的的活動(dòng)。另:指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。(2)基因操作：指對(duì)基因進(jìn)行分離、分析、改造、檢測(cè)、表達(dá)、重組和轉(zhuǎn)移等操作的總稱。1.1.2基因工程的基本定義（1）DNA是遺傳物質(zhì)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),

1944年Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),

1952年AlfredHershy和MarshaChase進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。1.2基因工程的誕生與發(fā)展

1.2.1基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制。(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)英國(guó)《NATURE》雜志

1953年4月25日“脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)”沃森，克里克1962年12月10日諾貝爾獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)儀式中關(guān)村街頭雕塑脫氧核糖堿基磷酸AGCT基本單位－脫氧核苷酸DNA的結(jié)構(gòu)

鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸P脫氧核糖AP脫氧核糖TP脫氧核糖GP脫氧核糖C四種脫氧核苷酸：

腺嘌呤脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸

脫氧核苷酸的連接P脫氧核糖含氮堿基P脫氧核糖含氮堿基ATGCATGCDNA雙鏈的連接DNA分子的立體結(jié)構(gòu)------規(guī)則的

雙螺旋結(jié)構(gòu)1.雙鏈、反向平行2.外側(cè)：脫氧核糖和磷酸交替連接------基本骨架3.內(nèi)側(cè)：堿基對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則

G=C;A=T

1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”

DNA

RNA

protein

1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等終于破譯了64個(gè)遺傳密碼(3)中心法則和遺傳密碼遺傳物質(zhì)應(yīng)具備的特點(diǎn)：1.攜帶大量遺傳信息；2.自我復(fù)制、從親代到子代傳遞遺傳信息；3.能夠讓遺傳信息得到表達(dá)，控制細(xì)胞代謝活動(dòng)，控制生物性狀；4.能夠突變并保留突變；---------DNA分子堿基對(duì)排列順序的多樣性（1）限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）

1970年H.O.Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。WernerArber理論預(yù)見限制酶HamiltonO.Smith得到第一個(gè)限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷1.2.2基因工程誕生的技術(shù)突破1967年5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。（3）載體（vector）

1972年前后使用小分子量的細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體作載體。在細(xì)菌細(xì)胞里的大量擴(kuò)增。（4）感受態(tài)體系

1970年M.Mandel和A.Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S.Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過的細(xì)菌同樣能吸收質(zhì)粒DNA。（2）DNA連接酶（ligase）

1970年Baltimore等人和Temin等人同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。（6）瓊脂糖凝膠電泳

1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長(zhǎng)度的DNA分離開。（7）DNA測(cè)序技術(shù)

1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了DNA快速測(cè)序技術(shù)。（5）逆轉(zhuǎn)錄酶（1）Berg的開創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)

1972年斯坦福大學(xué)的PaulBerg小組完成了首次體外重組實(shí)驗(yàn)：將SV40的DNA片斷與噬菌體的DNA片斷連接起來。1.2.3基因工程的誕生

1973年斯坦福大學(xué)的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。后來又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)。（2）Boyer-Cohen實(shí)驗(yàn)pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培養(yǎng)平皿卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌四環(huán)素平板抗四環(huán)素抗卡那霉素抗四環(huán)素\抗卡那霉素（1）目的基因的獲取從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。（2）重組體的制備將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。1.3基因工程的研究?jī)?nèi)容(步驟）將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。(4)克隆鑒定挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê康幕颍?5)目的基因表達(dá)使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。(3)重組體的轉(zhuǎn)化基因工程基本過程1.4

基因的結(jié)構(gòu)-基因操作的理論基礎(chǔ)

基因是遺傳信息的基本單位?；蚴且欢魏塑账嵝蛄校豢梢允沁B續(xù)的，也可以是不連續(xù)的；可以是DNA也可以是RNA；可以存在于染色體上，也可以存在于染色體之外（如質(zhì)粒等）?；蚓哂锌煞中?、重疊性和可變性。

什么是基因？1.基因是存在于細(xì)胞內(nèi)有自我繁殖能力的遺傳單位.

2.基因是一個(gè)具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段.

3.編碼一個(gè)RNA或一條多肽鏈的DNA片段稱為一個(gè)基因.

4.基因是生物體遺傳的基本單位,存在于細(xì)胞的染色體上,作直線排列.

5.基因是生物體內(nèi)一切具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位,其物質(zhì)基礎(chǔ)是一條以直線排列具有特定核苷酸序列的核酸片段.下面收錄了對(duì)"基因"的五個(gè)定義1.4.1原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游調(diào)控遺傳信息的表達(dá)(調(diào)控序列)編碼蛋白質(zhì)(編碼序列)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶是一種蛋白質(zhì)，能識(shí)別并與調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，能催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGC原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶AGGUCACGUCG

原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)AGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCAGGUCACGUCG1.4.2真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)下游調(diào)控遺傳信息的表達(dá)(調(diào)控序列)外顯子(能編碼蛋白質(zhì))內(nèi)含子(不能編碼蛋白質(zhì))真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)和原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的異同點(diǎn)1）相同點(diǎn)：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)組成。2）不同點(diǎn)：原核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的，真核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。在真核細(xì)胞中，控制不同種類的蛋白質(zhì)的基因，所含的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目是不同的，長(zhǎng)度也有差別。注：內(nèi)含子：指真核生物基因中不能翻譯成蛋白質(zhì)的DNA片段；外顯子：能夠翻譯成蛋白質(zhì)的任一間斷的基因片段，一個(gè)基因可有多個(gè)外顯子。（1）共線性基因決定蛋白質(zhì)的序列組成，是由密碼子對(duì)應(yīng)特定氨基酸所決定的。當(dāng)一個(gè)基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列是一一對(duì)應(yīng)時(shí)，則表明它們是共線性的。（2）基因及其產(chǎn)物的非共線性

由于真核生物的斷裂基因具有內(nèi)含子，使得一個(gè)基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列不是一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，則表明基因及其產(chǎn)物是非共線性的。

ATG

GCG

GCT

GCC

GGT

GCT

CTC

TTT

TTC

CTA

TTC

TCC

TCC

TTC

TGC

MetAlaAlaAlaGlyAlaLeuPhePheLeuPheSerSerPheCysATG

GCG

GCT

GCC

GGT

GCT

CTC

TTT

TTC

CTA

TTC

TCC

TCC

TTC

TGC

MetAlaAlaAlaGlyAla…….…..PheSerSerPheCys1.4.3基因及其產(chǎn)物的共線性與非共線性DNA的復(fù)制過程1）基因制藥

通過DNA重組技術(shù)將天然存在于人體內(nèi)起著各種生理功能且含量甚少以至微量的活性多肽、蛋白質(zhì)、糖肽所編碼的基因片斷導(dǎo)入微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá),通過純化、提取制備出高純度、高活性的生物有效物質(zhì)。1.5基因工程的應(yīng)用

1.5.1基因工程在醫(yī)藥上的應(yīng)用1976年，27歲的風(fēng)險(xiǎn)投資人RobertSwanson與UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術(shù)的商業(yè)前景。討論結(jié)束時(shí)，他們決定建立一個(gè)公司，并取名為Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。1982年,首次批準(zhǔn)重組動(dòng)物疫苗----抗球蟲病疫苗。1982年,第一個(gè)基因工程藥物----人胰島素生產(chǎn)上市。生物活性多肽單克隆抗體疫苗三大類基因藥物產(chǎn)品:制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

將正常的外源基因?qū)氚屑?xì)胞中以彌補(bǔ)靶細(xì)胞所缺失或突變的基因、或抑制異常表達(dá)的基因。2）基因治療1）提高植物的光合作用效率①提高CO2的固定率改變與光合作用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)和組成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。②提高光能吸收率和轉(zhuǎn)化率改變光能交換系統(tǒng)的分子的基因結(jié)構(gòu)。1.5.2基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用使非固氮植物轉(zhuǎn)變?yōu)楣痰参锘蚰芘c根瘤菌共生固氮。3）轉(zhuǎn)基因植物是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的主要內(nèi)容。是將克隆到的特殊基因?qū)胧荏w植物，使之增加一些優(yōu)質(zhì)性狀（高產(chǎn)、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗病等）。2）提高豆科植物的固氮效率轉(zhuǎn)基因植物特性申請(qǐng)單位馬鈴薯抗病毒中科院抗病中國(guó)農(nóng)科院抗逆北京大學(xué)高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)北京大學(xué)水稻抗蟲中科院抗病毒北京大學(xué)抗病農(nóng)科院抗除草劑水稻所上市的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品棉花抗蟲中科院農(nóng)科院美國(guó)孟山都公司玉米抗蟲美國(guó)孟山都公司等大豆抗除草劑農(nóng)科院小麥抗除草劑北京農(nóng)林科學(xué)院高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)北京農(nóng)林科學(xué)院番茄抗病北京大學(xué)耐儲(chǔ)存中科院華中農(nóng)大甜椒抗病北京大學(xué)辣椒抗病毒中科院煙草抗病毒北京大學(xué)抗蟲中科院北京大學(xué)番木瓜抗病毒中國(guó)熱帶作物廣藿香抗病農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院矮牽牛改變花色北京大學(xué)楊樹抗蟲中科院微生物提高固氮效率中科院農(nóng)科院華中農(nóng)大廣東微生物所將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞，并在基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，遺傳給后代。改善子代特性；研究遺傳性疾病的動(dòng)物模型；使動(dòng)物成為生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用的活性蛋白等。4）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大鼠生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入小鼠1）纖維素的開發(fā)利用克隆各種參與纖維素降解的酶的基因，導(dǎo)入釀酒酵母，就可能利用廉價(jià)的纖維素來生產(chǎn)葡萄糖，發(fā)酵成酒。2）釀酒工業(yè)用外源基因改造釀酒酵母，產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的啤酒。或用釀酒酵母生產(chǎn)蛋白質(zhì)等。1.5.3基因工程在工業(yè)中的應(yīng)用1）檢測(cè)水污染用重組細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因魚等檢測(cè)水污染。2）生物降解用帶有重組質(zhì)粒的“超級(jí)菌”分解油（烷烴類）、有機(jī)農(nóng)藥污染。1.5.4基因工程在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用1976GenentechGenentech創(chuàng)立1977首次在微生物中生產(chǎn)了人蛋白生長(zhǎng)激素抑制素1978克隆了人胰島素基因1979克隆了人生長(zhǎng)激素基因1980公司上市，募集$35million1982第一個(gè)基因重組藥（人胰島素）上市1985第一個(gè)自己生產(chǎn)的產(chǎn)品（人生長(zhǎng)激素）1987生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑（TPA）1990生產(chǎn)interferon1Genentech的驕人業(yè)績(jī)基因工程試劑的高回報(bào)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子231元/ug紅細(xì)胞生成素1072元/ug白細(xì)胞介素-2410元/ug巨細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mg1）對(duì)環(huán)境