基因診斷與基因治療

基因診斷與基因治療主要內(nèi)容

基因診斷（4-18）基因治療（4-25）2021/4/272

2013年，H7N9禽流感來襲，快速而準(zhǔn)確地對疑似患者作出診斷，能有效的增大患者的生機(jī)。

通過什么方法作出快速診斷？如何來進(jìn)行治療？2021/4/273

基因診斷能夠快速檢測出疑似患者的送檢樣品中是否含有H7N9病毒的特定基因。

2021/4/27448小時內(nèi)使用最有效2021/4/275

利用分子生物學(xué)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否異常，從而對疾病作出診斷,為治療提供依據(jù)。

特點(diǎn)：針對性強(qiáng)，特異性高實用性強(qiáng)，診斷范圍廣預(yù)見性，適應(yīng)性基因診斷2021/4/276基因診斷常用技術(shù)方法（一）核酸分子雜交技術(shù)（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（三）基因測序（四）基因芯片2021/4/277核酸分子雜交技術(shù)原理2021/4/278

Southern印跡雜交法（Southernblotting）

Northern印跡雜交法（Northernblotting）斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交法（Spot/Slotblothybridization）菌落雜交（colonyhybridization）夾心雜交法（sandwichhybridization）

原位雜交（hybridizationinsitu）常用固相核酸雜交方法2021/4/279

(1)Southern印跡雜交法限制性內(nèi)切酶酶切

檢測雜交信號

提取DNASouthern法可用于檢測特異的DNA序列片段,進(jìn)行基因定位、分子量測定等。2021/4/2710（2）Northern印跡雜交法（其基本過程類似于上述Southern法）提取RNA樣本→RNA變性→瓊脂糖凝膠電泳分離→轉(zhuǎn)移至膜→探針（標(biāo)記DNA或RNA）與之雜交→顯影或顯色→檢測信號。

Northern法可用于檢測組織細(xì)胞中總RNA或mRNA

2021/4/2711（6）原位雜交將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測特異的DNA或RNA序列。

細(xì)胞原位雜交、組織切片原位雜交

DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA優(yōu)點(diǎn)：

不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。2021/4/2712（二）聚合酶鏈反應(yīng)

（polymerasechainreactionPCR）KaryMullisresearchscientistinthe1980sataCaliforniabiotechnologycompanycalledCetusco-winnerof1993NobelPrize

2021/4/2713PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y=2nn為循環(huán)數(shù)2021/4/2714（三）基因測序技術(shù)他們給DNA的測序帶來了一場革命，分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎。后來Sanger法發(fā)展為自動化測序法，并為人類基因組測序做出了卓越貢獻(xiàn)。FredSanger發(fā)明的末端合成終止法(sanger法)WalterGilbert發(fā)明的化學(xué)裂解法Maxam-Gillbert法2021/4/2715（四）基因芯片技術(shù)快速、高通量、平行化、自動化2021/4/2716基因診斷方法經(jīng)典基因診斷.限制性內(nèi)切酶法.RFLP分析法.寡核苷酸分析法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)特異基因診斷未知基因診斷直接，過程簡單過程繁雜準(zhǔn)確性低，過程繁條件嚴(yán)格基因診斷進(jìn)展.PCR方法.PCR-序列分析法.DNA芯片技術(shù)簡單、經(jīng)濟(jì)、敏感操作直接、準(zhǔn)確集成度高、快速、并行假陽性高價格高尚無成熟產(chǎn)品問世2021/4/2717

四.基因診斷的臨床應(yīng)用遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定2021/4/2718鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析×MstⅡ酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb0.2kb正常珠蛋白基因：5’－CCTGAGG－3’鐮刀型貧血：5’－CCTGTGG－3’+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者2021/4/2719

實時熒光定量PCR技術(shù)

(RealtimeQuantitativePCR)實時監(jiān)測熒光起始模板RealTimevs.TraditionalPCRPCR2021/4/27202021/4/2721PCR分四個階段TheoreticalRealLifeLogTargetDNA2021/4/2722Ct

valueBaselineThreshold2021/4/27232021/4/2724理想的PCR反應(yīng)Xn＝X02n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理2021/4/2725非理想的PCR反應(yīng)Xn＝X0

（1＋En）n*Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0

：起始模板數(shù)量n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En：擴(kuò)增效率熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理2021/4/2726在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到熒光閾值時XCt＝X0

（1＋En）Ct＝M（1）*XCt

：熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值時擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值設(shè)定以后，它是一個常數(shù)，定為M方程式（1）兩邊同取對數(shù)得：Log2M＝Log2X0

*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0

＝Log2M－CtLog2（1＋En）熒光定量PCR原理－－Ct值定量的數(shù)學(xué)原理2021/4/27272021/4/2728SYBRGreenI

TaqManProbeMolecularBeaconTaqMan2021/4/2729SYBRGreenI

GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA2021/4/27302021/4/2731Dissociationcurve2021/4/2732TaqMan2021/4/2733ProbesandPrimers(PrimerExpress3.0software)PrimerLength:15-30bpPCRProduct:100-200bpG+C%:40～60％Tmofprimers:55-60℃Tmofprobes:>65℃(>10℃)NoGat5’2021/4/2734探針中GC含量的差異對定量PCR反應(yīng)效率的影響2021/4/27352021/4/2736MethodsofQuantification2021/4/2737AbsoluteQuantification2021/4/27382021/4/2739RelativeQuantifica