紫外可見(jiàn)分光光度法-2015

紫外可見(jiàn)分光光度法

與熒光分光光度法藥物研究所分析室馬辰2015.3.27紫外可見(jiàn)分光光度法

1、紫外光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系2、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)3、定量測(cè)定基本原理

4、定性與定量方法5、光電比色法吸收光譜的來(lái)源

所有原子和分子均能吸收電磁波，其對(duì)吸收的波長(zhǎng)有選擇性。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是因?yàn)樵雍头肿拥哪芰烤哂辛孔踊卣髟谡顟B(tài)下的原子或分子處于一定能級(jí)即基態(tài)，經(jīng)光激發(fā)后，隨激發(fā)光子能量的大小，其能級(jí)提高一級(jí)或數(shù)級(jí)，即分子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。當(dāng)以某一范圍的光波連續(xù)照射分子或原子時(shí)，有些波長(zhǎng)的光被吸收，產(chǎn)生被吸收譜線(xiàn)所組成的吸收光譜分子的吸收光譜分為三類(lèi)轉(zhuǎn)動(dòng)：只涉及分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的改變，能級(jí)間距離很小，吸收光子的波長(zhǎng)長(zhǎng)，頻率低。能級(jí)相差10-3~10-2kcal/mol，單純的轉(zhuǎn)動(dòng)光譜發(fā)生在遠(yuǎn)紅外區(qū)和微波區(qū)振動(dòng)：振動(dòng)光譜反映分子轉(zhuǎn)動(dòng)和振動(dòng)能級(jí)改變，引起這種改變的光子能量比第一種高，兩個(gè)振動(dòng)能級(jí)相距0.1~10kcal/mol，產(chǎn)生于波長(zhǎng)較短，頻率較高的近紅外區(qū)，主要在1~30μ的波長(zhǎng)區(qū)。電子光譜：吸收光子后使電子躍遷，產(chǎn)生電子能級(jí)的改變，即為電子光譜。能量為20~300kcal/mol。電子光譜位于紫外區(qū)和可見(jiàn)區(qū)，其波長(zhǎng)和能量的關(guān)系波長(zhǎng)(nm)180200300400波數(shù)(cm-1)55555500003000025000能量1591439572(kcal/mol)紫外區(qū)與可見(jiàn)區(qū)波長(zhǎng)(nm)真空紫外區(qū)10~185遠(yuǎn)紫外區(qū)185~200短紫外區(qū)200~300近紫外區(qū)300~380紫色380~400藍(lán)色400~500綠色500~580黃色580~600橙色600~620紅色620~780紫外吸收光譜反映分子吸收能量后所產(chǎn)生的電子躍遷，反映分子的電子結(jié)構(gòu)特征，為物質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究提供重要信息，分子的紫外光譜吸收帶的波長(zhǎng)和強(qiáng)度是化合物的常數(shù)之一。由于儀器和操作方法的限制，紫外光譜只適合于具有不飽和雙鍵系統(tǒng)的分子。電子躍遷受分子結(jié)構(gòu)的影響，所以紫外光譜能部分反映分子中電子間的相互作用。紫外光譜與紅外光譜的區(qū)別紫外光譜圖形簡(jiǎn)單，吸收峰寬且成帶狀，紅外光譜吸收峰較尖且數(shù)目多。紫外光譜主要反映分子中不飽和基團(tuán)的性質(zhì)，而不反映整個(gè)分子的結(jié)構(gòu)；紅外光譜則不僅能反映分子中功能基團(tuán)的存在，而且與整個(gè)分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)。特點(diǎn)紫外光譜不僅能識(shí)別分子中的不飽和系統(tǒng)，而且可以測(cè)定不飽和化合物的含量同一物質(zhì)相同濃度的吸收曲線(xiàn)，應(yīng)能相互重合，這是定性鑒定的依據(jù)之一。在定量分析中，可提供選擇測(cè)定的適宜波長(zhǎng)。因所需樣品量少，通常為微克級(jí)或毫克級(jí)，所以對(duì)測(cè)定微量成分，尤其是生物體內(nèi)的有機(jī)化合物更為有利。紫外光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.電子躍遷類(lèi)型2.常用術(shù)語(yǔ)3.吸收帶4.溶劑效應(yīng)電子躍遷類(lèi)型電子圍繞分子或原子運(yùn)動(dòng)的幾率分布叫軌道。軌道不同電子所具有的能量不同。紫外可見(jiàn)吸收光譜是討論分子中的價(jià)電子有處于σ軌道上的σ電子，π軌道上的π電子和未參與成鍵而仍處于原子軌道中的n電子（亦稱(chēng)p電子）。

分子軌道可以認(rèn)為是當(dāng)兩個(gè)原子靠近而結(jié)合成分子時(shí)，兩個(gè)原子的原子軌道的s電子就可以線(xiàn)性組合生成兩個(gè)分子軌道。其中一個(gè)分子軌道具有低能量稱(chēng)為成鍵軌道σ。另一個(gè)分子軌道具有高能量稱(chēng)為反鍵軌道σ*。

同樣兩個(gè)原子的π軌道平行地重疊起來(lái)，組成兩個(gè)分子軌道時(shí)，該分子軌道稱(chēng)π軌道和π*反鍵軌道。

π鍵的電子重疊比σ鍵的電子重疊少，鍵能弱，躍遷所需的能量低。分子中n電子的能級(jí)，基本上保持原來(lái)原子狀態(tài)的能級(jí)，稱(chēng)非鍵軌道。比成鍵軌道所處能級(jí)高，比反鍵軌道能級(jí)低。分子中不同軌道的價(jià)電子具有不同能量，處于低能級(jí)的價(jià)電子吸收一定能量后，會(huì)躍遷到較高能級(jí)。分子中電子躍遷有以下幾種類(lèi)型σ→σ*躍遷σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ*反鍵軌道。需較大能量，吸收峰在遠(yuǎn)紫外區(qū)，一般都小于150nm,在200nm―400nm范圍內(nèi)沒(méi)有吸收。π→π*躍遷π成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到π*反鍵軌道，所需的能量小于σ→σ*躍遷的能量。孤立的π→π*躍遷一般在200nm左右，特征是吸收系數(shù)值很大，一般ε>104,為強(qiáng)吸收。若具有共軛雙鍵化合物，相間的π鍵與π鍵相互作用形成離域鍵躍遷，電子容易激發(fā)，使π→π*躍遷所需能量減少，共軛鍵越長(zhǎng)躍遷所需能量越小。n→π*躍遷

含有雜原子不飽和基團(tuán)，如C=O,C=S,-N=N-等化合物，其非鍵軌道中孤對(duì)電子吸收能量后，向π*反鍵軌道躍遷，這種躍遷一般在近紫外區(qū)（200400nm）,吸收強(qiáng)度弱，ε小，約在10100之間。n→σ*躍遷如含有-OH，-NH2，-X，-S等基團(tuán)化合物，其雜原子中孤對(duì)電子吸收能量后向σ*反鍵軌道躍遷，這種躍遷所吸收的波長(zhǎng)在200nm左右。

上述4種類(lèi)型的電子躍遷，按照所需能量大小其順序?yàn)椋害摇?>n→σ*>π→π*>n→π*常用術(shù)語(yǔ)生色團(tuán)（chromophore）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有π→π*或n→π*躍遷的基團(tuán)，如C=C，C=O，-N=N-，-NO2，-C=S等，能在紫外可見(jiàn)光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子團(tuán)。助色團(tuán)（auxochrome）是指含有非鍵電子的雜原子飽和基團(tuán)，如-OH，-NH2，-OR，-SH，-SR，-Cl，-Br,-I等當(dāng)它們與生色團(tuán)或飽和烴相連時(shí)，能使該生色團(tuán)的吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，并使吸收強(qiáng)度增加的基團(tuán)。3．紅移(redshift)也稱(chēng)長(zhǎng)移，由于化合物結(jié)構(gòu)改變，如發(fā)生共軛作用，引入助色團(tuán)以及溶劑改變等，使吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。4．藍(lán)（紫）移(blueshift)也稱(chēng)短移。當(dāng)化合物的結(jié)構(gòu)改變時(shí)或受溶劑影響使吸收峰向短波方向移動(dòng)。增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強(qiáng)度增加。減色效應(yīng)(hypochromiceffect)使吸收強(qiáng)度減弱。強(qiáng)帶和弱帶(strongbandandweakband)化合物的紫外可見(jiàn)吸收光譜中，凡摩爾吸收系數(shù)εmax值大于104的吸收峰稱(chēng)為強(qiáng)帶；凡εmax值小于103的吸收峰稱(chēng)為弱帶。吸收帶（absorption）

R帶由n→π*躍遷引起的吸收帶。是雜原子的不飽和基團(tuán)，如C=O，-NO，-NO2，-N=N-等這一類(lèi)發(fā)色團(tuán)的特征。特點(diǎn)：1處于較長(zhǎng)波長(zhǎng)范圍（300nm）弱吸收，一般小于1002溶劑極性增加，R帶發(fā)生短移。3當(dāng)有強(qiáng)吸收峰在其附近時(shí)，R帶有時(shí)出現(xiàn)長(zhǎng)移，有時(shí)被掩蓋。因此，若測(cè)定n→π*躍遷要用較濃溶液；在非極性溶劑中吸收峰在較長(zhǎng)波長(zhǎng)處，若改用極性溶劑時(shí)，吸收峰短移，說(shuō)明R帶存在。K帶相當(dāng)于共軛雙鍵π→π*躍遷所產(chǎn)生的吸收峰。特點(diǎn)：值一般大于104，為強(qiáng)吸收帶。B帶芳香族（包括雜芳香族）化合物的特征吸收帶。E帶也是芳香族化合物特征吸收，認(rèn)為是由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中三個(gè)乙烯的環(huán)狀共軛體系的π→π*躍遷所產(chǎn)生，分為E1和E2。E1帶的吸收峰約在180nm，為4.7104;E2帶的吸收峰約在200nm,為7000。溶劑效應(yīng)化合物在溶劑中的紫外吸收光譜受溶劑影響較大，所以一般應(yīng)注明所用溶劑。溶劑的極性不同，對(duì)n→π*躍遷和π→π*躍遷所產(chǎn)生的吸收峰位置向不同方向移動(dòng)改用極性較大的溶劑，使π→π*躍遷吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)而n→π*躍遷吸收峰藍(lán)移后者的移動(dòng)一般比前者移動(dòng)大溶劑要求不能與樣品反應(yīng)樣品溶液中能達(dá)到一定濃度在所測(cè)定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，溶劑沒(méi)有吸收常用溶劑的極限吸收波長(zhǎng)溶劑波長(zhǎng)（nm）乙腈190環(huán)己烷198水200甲醇202乙醇205異丙醇203三氯甲烷245乙酸乙酯254DMSO265吡啶305吸收強(qiáng)度當(dāng)光經(jīng)過(guò)均勻的透明介質(zhì)時(shí)，一部分在介質(zhì)的表面分散或反射，一部分為介質(zhì)所吸收，只有一部分可透過(guò)介質(zhì)，故透過(guò)光的強(qiáng)度減弱。反射光在測(cè)定中可用空白校正而忽略不計(jì)。一個(gè)透明介質(zhì)所吸收的能量和照射光的強(qiáng)度無(wú)關(guān)，與吸收光子的物質(zhì)的濃度和介質(zhì)的厚度有關(guān)。分子的紫外光譜有兩個(gè)特征：吸收帶的波長(zhǎng)決定于分子激發(fā)態(tài)和基態(tài)的能級(jí)。若兩個(gè)能級(jí)相距小，則躍遷所需的能量低，吸收帶的波長(zhǎng)長(zhǎng)。但能級(jí)相差大時(shí)，躍遷能高，吸收帶波長(zhǎng)短。吸收強(qiáng)度，一般認(rèn)為吸收強(qiáng)度決定于從基態(tài)躍遷到某一能級(jí)的幾率或吸光分子的多少。分子吸光系數(shù)可以表示為ε=kpαk為一常數(shù)，其級(jí)數(shù)為1020，p為幾率α為分子橫切面積。分子中吸收光子的有關(guān)電子躍遷部分的面積。面積大，容易被擊中，強(qiáng)度大。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)是在紫外可見(jiàn)光可任意選擇不同波長(zhǎng)的光測(cè)定吸光度的儀器。示意圖光源→單色器→吸收池→檢測(cè)器→訊號(hào)處理及顯示器光源

要求足夠發(fā)射強(qiáng)度且穩(wěn)定的具有連續(xù)光譜且發(fā)光面積小的光源。對(duì)分子吸收測(cè)定來(lái)說(shuō)，通常希望能連續(xù)改變測(cè)量波長(zhǎng)進(jìn)行掃描的測(cè)定，故分光光度計(jì)要求具有連續(xù)光譜的光源。鎢燈或鹵鎢燈固體熾熱發(fā)光，用于可見(jiàn)區(qū)光源。要求供電電壓穩(wěn)定。氫燈或氘燈氣體放電發(fā)光，發(fā)射自150nm至約400nm的連續(xù)光譜，用于紫外區(qū)光源。單色器

單色器的作用是將來(lái)自光源的連續(xù)光譜按波長(zhǎng)順序色散，并從中分離出一定寬度的譜帶。單色器由進(jìn)口狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、聚焦透鏡、出口狹縫組成。1.色散元件

使各種不同波長(zhǎng)的平行光有互不相同的投射方向（或偏轉(zhuǎn)角），是單色器中最重要的。棱鏡光柵

棱鏡

棱鏡的色散作用由于棱鏡材料對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同的折光率，因此可從混合光中所包含的各個(gè)波長(zhǎng)從長(zhǎng)波長(zhǎng)到短波長(zhǎng)依次分散成為一個(gè)連續(xù)光譜。棱鏡分光得到的光譜按波長(zhǎng)排列是疏密不均的長(zhǎng)波長(zhǎng)密，短波長(zhǎng)疏，即光距與各條波長(zhǎng)是非線(xiàn)形的棱鏡材料有玻璃和石英兩種，玻璃對(duì)可見(jiàn)區(qū)的色散率比石英大，石英對(duì)紫外光有很好的色散作用，但在可見(jiàn)區(qū)不如玻璃。

光柵是一高度拋光的表面上刻出大量平行等距離的槽。

射到每一條槽上的光被衍射或散開(kāi)成一定的角度，在其中的某些方向產(chǎn)生干涉作用，使不同波長(zhǎng)的光有不同方向，出現(xiàn)各級(jí)明暗條紋形成光柵的各級(jí)衍射光譜。光柵色散后的光譜與棱鏡不同，光柵的光譜是由紫到紅，各譜線(xiàn)間距離相等，是均勻分布的連續(xù)光譜。光柵光譜是多級(jí)光譜，各級(jí)重疊，相互干擾，需用濾光片濾去高級(jí)序光譜。2.準(zhǔn)直鏡

以狹縫為焦點(diǎn)的聚光鏡。將進(jìn)入單色器的發(fā)散光變成平行光，又用作聚光鏡，將色散后的平行單色光聚集于出口狹縫。一般用鍍鋁的拋物柱面反射鏡作為準(zhǔn)直鏡。3.狹縫狹縫寬度直接影響分光質(zhì)量，狹縫過(guò)寬，單色光不純，可使吸光度變值;狹縫過(guò)窄，光通量小，降低靈敏度，若增大放大器放大倍數(shù)而使噪音增大，影響準(zhǔn)確度。吸收池用光學(xué)玻璃制成的吸收池，只能用于可見(jiàn)光區(qū)。用熔融石英（氧化硅）制的吸收池，適用于紫外光區(qū)，也可用于可見(jiàn)光區(qū)?？瞻兹芤旱奈粘嘏c樣品溶液的吸收池應(yīng)相互匹配，即有相同的厚度與相同的透光性。檢測(cè)器

一般常用光電效應(yīng)檢測(cè)器（光電池和光電管），將接收到的輻射功率變成電流的轉(zhuǎn)換器。光電池光電管光電倍增管光二極管陣列檢測(cè)器

光電池

是一種光敏半導(dǎo)體，當(dāng)光照時(shí)就產(chǎn)生電流，在一定范圍內(nèi)光電流大小與照射光強(qiáng)成正比，可直接用微電流計(jì)測(cè)量。光電池有硒光電池和硅光電池。硒光電池只能用于可見(jiàn)光區(qū)，硅光電池同時(shí)適用于紫外區(qū)和可見(jiàn)區(qū)。

光電管

光電管是由一個(gè)陽(yáng)極和一個(gè)光敏陰極組成的真空（或充少量惰性氣體）二極管，陰極表面鍍有堿金屬或堿金屬氧化物等光敏材料，當(dāng)它被有足夠能量的光照射時(shí)，能夠發(fā)射出電子。當(dāng)兩極間有電位差時(shí)，發(fā)射出的電子向陽(yáng)極移動(dòng)而產(chǎn)生電流，電流大小決定于照射光強(qiáng)度。

光電倍增管

原理與光電管相似，結(jié)構(gòu)的差別是在涂有光敏金屬的陰極和陽(yáng)極之間還有幾個(gè)倍增級(jí)（一般是9個(gè)）。

儀器靈敏度大大提高。

光二極管陣列檢測(cè)器

在晶體硅上緊密排列一系列光電二極管檢測(cè)管，每一個(gè)二極管相當(dāng)于一個(gè)單色儀的出口狹縫。訊號(hào)處理及顯示器

光電管輸出的電訊號(hào)很弱，須經(jīng)放大才能以某種方式將測(cè)量結(jié)果顯示出來(lái)。顯示器的顯示方式一般都有透光率與吸收度，有的還可以轉(zhuǎn)換成濃度，吸光系數(shù)等顯示定量測(cè)定基本原理

Beer-Lambert定律

A=lgT=ElC說(shuō)明物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與吸光的濃度和厚度間關(guān)系的定律.T=I/I0I:透過(guò)光強(qiáng)度I0：入射光強(qiáng)度

吸光系數(shù):單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度稱(chēng)為吸光系數(shù)(absorptivity)。吸光度與濃度或厚度之間是簡(jiǎn)單的正比關(guān)系,其中E是比例常數(shù)。吸光系數(shù)有兩種常見(jiàn)的表示方式

摩爾吸光系數(shù)是指在一定波長(zhǎng)時(shí),溶液濃度為1mol/L,厚度為1cm的吸光度,用或EM標(biāo)記.

百分吸光系數(shù)，或稱(chēng)為比吸光系數(shù)，是指在一定波長(zhǎng)時(shí),溶液濃度為1%(W/V),厚度為1cm的吸光度,用E1%

1cm表示。吸光系數(shù)兩種表示方式之間的關(guān)系是：

=M/10E1%

1cm

2．影響測(cè)定的因素A=lgT=ElCT=I/I0化學(xué)因素：光學(xué)因素

化學(xué)因素：溶液中溶質(zhì)可因濃度改變，有離解，締合與溶劑間作用等因素。2）光學(xué)因素：

非單色光：Beer定律的前提是單色光，主要原因是由于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同的吸收系數(shù)。事實(shí)上真正的單色光難以得到。

雜散光：從分光器得到的單色光中，有一些不在譜帶寬范圍內(nèi)的與所需波長(zhǎng)相隔較遠(yuǎn)的光。一般來(lái)源于儀器制造過(guò)程中的瑕疵，儀器保養(yǎng)不善，光學(xué)元件受到塵染或霉蝕是雜散光增多的常見(jiàn)原因。散射光和反射光：吸光質(zhì)點(diǎn)對(duì)入射光有散射作用，入射光在吸收池內(nèi)外界面之間通過(guò)時(shí)又有反射作用。散射光和反射光都是入射光譜帶寬度內(nèi)的光，對(duì)透射光強(qiáng)度有直接影響。非平行光：斜光通過(guò)吸收池的光程比平行光的光程長(zhǎng)。定性與定量方法1、定性鑒別2、純度檢驗(yàn)3、定量測(cè)定一．定性鑒別主要依據(jù)多數(shù)有機(jī)化合物具有吸收光譜特征，如形狀，吸收峰數(shù)目，吸收峰波長(zhǎng)位置，強(qiáng)度和吸收系數(shù)值等。利用紫外可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行化合物的定性鑒別，一般采用將樣品化合物的吸收光譜特征與標(biāo)準(zhǔn)化合物的吸收光譜特征對(duì)照比較，兩者完全相同，則可能是同一化合物，兩者有明顯差別，則肯定不是同一種化合物。1、對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)最常用于鑒別的吸收光譜特征數(shù)據(jù)是吸收峰所在的波長(zhǎng)。若一個(gè)化合物有幾個(gè)吸收峰，并存在谷及肩峰，應(yīng)同時(shí)作為鑒定依據(jù)。具有相同或不同的吸收基團(tuán)的不同化合物，可有相同的吸收峰值，但它們的分子量一般不同，因此其E值有明顯不同，所以，吸光系數(shù)常用于化合物定性鑒別。2、對(duì)比吸光度（或吸收系數(shù)）的比值

吸收峰多于一個(gè)的化合物，可用在不同吸收峰處（或峰與谷）測(cè)得吸光度的比值作為鑒別的依據(jù)。A1E1ClE1——=———=——A2E2ClE23、對(duì)比吸收光譜的一致性將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品配制成相同濃度的溶液，在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對(duì)其一致性。用紫外吸收光譜數(shù)據(jù)或曲線(xiàn)進(jìn)行定性鑒別，有一定的局限性。因?yàn)樽贤馕展庾V一般只有1個(gè)或幾個(gè)寬吸收帶，曲線(xiàn)的形狀變化不多；在眾多化合物中，不相同的化合物可以有很類(lèi)似甚至雷同的吸收光譜。所以在得到相同的吸收光譜時(shí)，應(yīng)考慮到有并非同一物質(zhì)的可能性。而兩種純化合物的吸收光譜有明顯差別時(shí)，卻可以肯定不是同一化合物。二．純度檢驗(yàn)1、雜質(zhì)檢查如果化合物在紫外可見(jiàn)區(qū)無(wú)明顯吸收，雜質(zhì)有較強(qiáng)吸收，那么雜質(zhì)可用光譜檢查出來(lái)。如果化合物有較強(qiáng)的吸收峰，而雜質(zhì)在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收，或吸收很弱，雜質(zhì)的存在使化合物的吸光系數(shù)值降低；若雜質(zhì)在此波長(zhǎng)處有比化合物更強(qiáng)的吸收，將使化合物的吸光系數(shù)值增大；有吸收的雜質(zhì)也將使化合物的吸收光譜變形；這些都可作為檢查雜質(zhì)是否存在的方法。2、雜質(zhì)的限量檢查藥物中的雜質(zhì)，須制定一個(gè)容許其存在的限量。利用雜質(zhì)和化合物吸收峰的不同，測(cè)定雜質(zhì)量。利用峰谷吸收度比值控制雜質(zhì)限量。三．單組分的定量方法根據(jù)Beer定律，物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸收度與濃度之間有線(xiàn)形關(guān)系。選擇一定的波長(zhǎng)測(cè)定溶液的吸光度，即可求出濃度。

波長(zhǎng)選擇：1）光譜的最大吸收峰處；2）被測(cè)物如有幾個(gè)吸收峰，選不易有其它物質(zhì)干擾的較高的吸收峰；3）一般不選末端的吸收峰。

溶劑選擇：不干擾被測(cè)組分的測(cè)定。1吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法根據(jù)Beer定律，A=ElC，若l,E知，可根據(jù)測(cè)得的A求出被測(cè)物的濃度。

2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法先配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在測(cè)定條件相同下，分別測(cè)定其吸收度然后以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸收度為縱坐標(biāo)，繪制A―C關(guān)系圖，如果符合Beer定律，可獲得一條通過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn)。在相同條件下測(cè)定樣品的吸光度，用回歸方程計(jì)算樣品溶液的濃度。3.對(duì)照法在同樣條件下配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定波長(zhǎng)處，分別測(cè)定吸光度，根據(jù)定律：A標(biāo)=EC標(biāo)lA樣=EC樣l因是同種物質(zhì)，同臺(tái)儀器及同一波長(zhǎng)測(cè)定，故E，l相等，所以，A標(biāo)C標(biāo)=A樣C樣

A樣·C標(biāo)C樣(%)=——————A標(biāo)4．多組分的測(cè)定方法有兩種或多種組分共存時(shí)，可根據(jù)各組分吸收光譜相互重疊的程度分別考慮測(cè)定方法。最簡(jiǎn)單的情況是各組分沒(méi)有吸收峰重疊，則可按單組分的測(cè)定方法分別在各組分的最大波長(zhǎng)處測(cè)定。1.解線(xiàn)性方程組法2.雙波長(zhǎng)分光光度法等吸收雙波長(zhǎng)消去法系數(shù)倍率法3三波長(zhǎng)法4.導(dǎo)數(shù)光譜法五．光電比色法

可見(jiàn)分光光度法是對(duì)于能吸收可見(jiàn)光的有色溶液的測(cè)定方法，通常稱(chēng)為光電比色法。許多不吸收可見(jiàn)光的無(wú)色物質(zhì)可以用顯色反應(yīng)變成有色物質(zhì)，用光電比色法測(cè)定，提高測(cè)定靈敏度和選擇性。顯色反應(yīng)類(lèi)型：絡(luò)合反應(yīng)，氧化還原反應(yīng)，縮合反應(yīng)等。應(yīng)用最廣的是絡(luò)合反應(yīng)。1.顯色反應(yīng)及其條件金屬離子與配位體可形成穩(wěn)定的有色絡(luò)合物或絡(luò)離子，吸收系數(shù)值可高達(dá)105，靈敏度高，有較好的選擇性，適用于微量比色分析。1)顯色反應(yīng)需符合下述要求：被測(cè)物質(zhì)與所生成的有色物質(zhì)之間必須有確定的定量關(guān)系，才能使反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)光的吸收度準(zhǔn)確地反映被測(cè)物的含量。反應(yīng)產(chǎn)物必須有足夠地穩(wěn)定性，以保證測(cè)定的吸收度有一定的重現(xiàn)性。如試劑本身有色，則反應(yīng)產(chǎn)物的顏色與試劑的顏色須有明顯差別，即產(chǎn)物與試劑對(duì)光的最大吸收度應(yīng)有較大的差別，才能分辨產(chǎn)物的吸收與試劑的吸收。反應(yīng)產(chǎn)物的摩爾吸收系數(shù)足夠大（103-105），才能有一定的靈敏度顯色反應(yīng)須有較好的選擇性，才能減少干擾因素。2)反應(yīng)條件的影響（1）試劑與溶劑選擇試劑依據(jù)反應(yīng)的靈敏度，顯色的穩(wěn)定性和反應(yīng)的選擇性，同時(shí)應(yīng)考慮試劑的用量，為使產(chǎn)物組成一定，應(yīng)控制試劑的用量。溶劑的性質(zhì)可影響物質(zhì)對(duì)光的吸收，使之顯不同顏色。如：苦味酸在水溶液中呈黃色，而在氯仿中幾乎無(wú)色。

（2）酸堿度

許多有色物質(zhì)的顏色，隨溶液中的氫離子濃度而改變，同時(shí)，顯色反應(yīng)的歷程也多與溶液的酸堿度有關(guān)。絡(luò)合反應(yīng)中的絡(luò)合劑多為弱酸，溶液的酸度大會(huì)阻礙絡(luò)合劑離解，酸度過(guò)小又可使金屬離子水解沉淀。氧化還原反應(yīng)，縮合反應(yīng)等，溶劑的酸堿性也是重要條件之一。有些反應(yīng)對(duì)溶液的酸堿性敏感，須用緩沖溶液來(lái)保持溶液的pH值。

（3）時(shí)間由于反應(yīng)速度不同，完成反應(yīng)所需時(shí)間常有較大差異。有色產(chǎn)物也會(huì)在放置過(guò)程中發(fā)生變化，對(duì)一個(gè)顯色反應(yīng)中各個(gè)步驟所需時(shí)間和顏色所能穩(wěn)定地保持多久，須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。

（4）溫度及其它

很多反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，室溫的變動(dòng)一般對(duì)結(jié)果影響不大。有些氧化還原或縮合反應(yīng)，常須考慮溫度，提高溫度可促進(jìn)反應(yīng)，但也可產(chǎn)生副反應(yīng)，須在適當(dāng)溫度下進(jìn)行。有些反應(yīng)與溶解度有關(guān)，也要考慮溫度，提高溫度促進(jìn)溶解，有利于反應(yīng)進(jìn)行，或降低溫度以避免沉淀溶解，都應(yīng)根據(jù)具體的反應(yīng)考慮適當(dāng)?shù)臏囟?。?jiàn)光易變質(zhì)的產(chǎn)物，放置過(guò)程中應(yīng)避光。3)反應(yīng)條件的控制反應(yīng)條件的控制確定顯色反應(yīng)的最適宜條件，須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2.測(cè)定方法有色溶液的測(cè)定可用前述紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和相應(yīng)的各種方法。除此之外，可用初級(jí)的分光光度計(jì)以及以有色玻璃濾光片作為分光器的光電比色計(jì)。熒光分光光度法熒光的定義某些物質(zhì)對(duì)特定波長(zhǎng)的光有一定的吸收，從而產(chǎn)生吸收光譜有些物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某些波長(zhǎng)的光外，還會(huì)發(fā)射出比原來(lái)吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，當(dāng)激發(fā)光停止照射后，這種光線(xiàn)也隨之消失，這種光叫熒光。原子熒光：被測(cè)物質(zhì)是原子分子熒光：被測(cè)物質(zhì)是分子熒光分析一般分為三種1.X射線(xiàn)熒光分析（X射線(xiàn)）2.原子熒光分析（激光）3.分子熒光分析（汞弧燈）優(yōu)勢(shì)1）靈敏度高10-10~10-12g/ml，UV10-7g/ml2）信息多:激發(fā)分光光譜（信息同于UV）、發(fā)射光光譜的發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)光壽命、量子效率、熒光偏振等多種信息,定性更好3）工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍寬4）專(zhuān)一性強(qiáng)與UV異同點(diǎn)1)儀器構(gòu)造與UV很相似.屬于分光光度法,光源.單色器等2)組件的布置稍有不同熒光采用激發(fā)光和發(fā)射光成直角的直角光路3)原理不一樣熒光的產(chǎn)生

分子能級(jí)和電子能級(jí)的多重性

單線(xiàn)態(tài)和三線(xiàn)態(tài)分子中的電子運(yùn)動(dòng)包括分子軌道運(yùn)動(dòng)和分子自旋運(yùn)動(dòng)，分子中的電子自旋狀態(tài)，可以用多線(xiàn)態(tài)2S+1描述，S為總自旋量子數(shù)。若分子中沒(méi)有未配對(duì)的電子，即S=0，則2S+1＝1，稱(chēng)為單線(xiàn)態(tài)；若分子中有兩個(gè)自旋方向平行的未配對(duì)電子，即S=1，則2S+1＝3，稱(chēng)為三線(xiàn)態(tài)。熒光的產(chǎn)生熒光是電子由第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層之間的躍遷產(chǎn)生的磷光是電子由激發(fā)三線(xiàn)態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)各振動(dòng)能層之間的躍遷產(chǎn)生的振動(dòng)弛豫：處于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過(guò)與溶劑分子的碰撞，將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。無(wú)輻射躍遷，發(fā)生弛豫的時(shí)間約為10-12秒內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（內(nèi)轉(zhuǎn)換）：兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無(wú)輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過(guò)程。體系間跨越：處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過(guò)程。外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換）：溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或與其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，并以熱能的形式釋放能量的過(guò)程。熒光光譜熒光光譜包括激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜是熒光物質(zhì)在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下測(cè)得的某一波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度的變化情況，也就是不同波長(zhǎng)的激發(fā)光的相對(duì)效率固定發(fā)射單色器，通過(guò)激發(fā)單色器掃描，以不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，記錄熒光強(qiáng)度（F）對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)（λex）的關(guān)系曲線(xiàn)發(fā)射光譜則是某一固定波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下熒光強(qiáng)度在不同波長(zhǎng)處的分布情況，也就是所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)組成的相對(duì)強(qiáng)度使激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，通過(guò)發(fā)射單色器掃描以檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相對(duì)的熒光強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度（F）對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)（λem）的關(guān)系曲線(xiàn)熒光光譜將激發(fā)光譜與發(fā)射光譜進(jìn)行比較，可以判斷哪種吸收對(duì)發(fā)光有用。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)有相似的振動(dòng)能級(jí)分布，而且從基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率與由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率也相近，因此吸收譜與發(fā)射譜呈鏡象對(duì)稱(chēng)關(guān)系。

萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜芘的苯溶液和硫酸奎寧的稀硫酸溶液的激發(fā)光譜、熒光光譜必要條件該物質(zhì)的分子必須具有能吸收激發(fā)光的結(jié)構(gòu)，通常是共軛雙鍵結(jié)構(gòu)分子必須有強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收，ππ*躍遷長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)

該分子必須具有一定程度的熒光效率。所謂熒光效率是熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光量子數(shù)與吸收的激發(fā)光