體內(nèi)藥物分析 第七章 免疫分析法

第七章免疫分析法藥學(xué)院藥物分析教研室2/2/20231【大綱要求】1、熟悉免疫分析法的基礎(chǔ)知識(shí)2、了解放射免疫分析法、酶免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法2/2/20232第一節(jié)：概述基本原理基本條件方法分類2/2/20233免疫分析法(Immunoassay，IA)：是指以特異性抗原－抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析方法。1959年，由美國(guó)Yallow和Berson等人將放射性同位素示蹤技術(shù)的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高特異性結(jié)合起來，首先測(cè)定了糖尿病人血漿中的胰島素含量，從而創(chuàng)立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay，RIA)。酶免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、熒光免疫分析法、時(shí)間分辯免疫分析方法等。2/2/20234一、基本原理(一)競(jìng)爭(zhēng)抑制原理實(shí)質(zhì)都是抗原一抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)Ag*：標(biāo)記抗原Ag：未標(biāo)記抗原Ab：特異抗體Ag*－Ab：標(biāo)記抗原－抗體結(jié)合物，Ag－Ab代表未標(biāo)記抗原一抗體結(jié)物K：平衡常數(shù)(K=K1/K2)。2/2/20235抗原－抗體反應(yīng)須滿足以下條件：Ag*與Ag(待測(cè)物)必須是相同的生物活性物質(zhì)；所加入Ag*和Ab的量應(yīng)是固定的；Ag*與Ag的量之和應(yīng)大于Ab的結(jié)合位點(diǎn)；Ag*、Ag及Ab須處在同一反應(yīng)體系中。2/2/20236這種競(jìng)爭(zhēng)抑制的數(shù)量關(guān)系成為免疫分析的定量基礎(chǔ)2/2/20237(二)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線(劑量反應(yīng)曲線)

用待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)品配置一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入一定量的標(biāo)記抗原和抗體，待抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的Ag*－Ab的結(jié)合率。B代表結(jié)合的標(biāo)記抗原；F代表游離的標(biāo)記抗原；T代表總的標(biāo)記抗原。2/2/20238B/F-[Ag]B/(B+F)×100%-[Ag]2/2/20239(三)抗原一抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1．特異性一種抗原分子只能與由它刺激產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)?？乖奶禺愋灾饕Q于抗原決定簇(Cluster)的數(shù)量、性質(zhì)及立體構(gòu)型?？贵w的特異性則取決于抗原結(jié)合段(fragmentofantigenbinding，IgFab)與相應(yīng)抗原決定簇的結(jié)合能力。交叉反應(yīng)(crossreaction)：結(jié)構(gòu)相近似的其它藥物或化合物與抗體的結(jié)合。2/2/2023102．可逆性

抗原與抗體的特異性結(jié)合是由于兩者的分子結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型相互吻合，它僅發(fā)生在分子的表面，并依靠抗原一抗體分子間的靜電力作用、疏水作用、氫鍵作用及范德華引力等而存在。是可逆反應(yīng)，改變反應(yīng)條件可使結(jié)合物發(fā)生水解。2/2/2023113．最適比例性

抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)具有一定的量比關(guān)系。只有當(dāng)抗原抗體兩者的分子比例合適時(shí)，才能發(fā)生最強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)。以沉淀免疫反應(yīng)為例2/2/202312二、基本條件三種基本試劑：標(biāo)記抗原、未標(biāo)記抗原和特異抗體(一)抗原及其制備1．全抗原與半抗原抗原(Antigen)：能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)。物質(zhì)的抗原性包括免疫原性和抗原特異性。免疫原性(Immunogenicity)：抗原注入動(dòng)物體內(nèi)后能促使動(dòng)物產(chǎn)生特異抗體?？乖禺愋?AntigenicSpecifiety)：抗原能與特異抗體相作用的性質(zhì)。2/2/202313

1．全抗原與半抗原

全抗原：同時(shí)具有免疫原性和抗原特異性的物質(zhì)。

半抗原(Hapten)：只能與特異抗體作用但不引起機(jī)體免疫應(yīng)答的物質(zhì)。

人工完全抗原：藥物(半抗原)本身不具免疫原性，只有當(dāng)它們與某些大分子的載體物質(zhì)(如蛋白質(zhì)或多肽)共價(jià)結(jié)合后，才具有免疫原性。這種小分子半抗原和大分子載體物質(zhì)結(jié)合后所形成的全抗原。2/2/2023142．人工抗原的制備(1)載體(carrier)的選擇：作為載體應(yīng)考慮藥物與載體結(jié)合后其免疫活性是否高、溶解度是否大、對(duì)化學(xué)反應(yīng)合有機(jī)溶劑導(dǎo)致的變形作用有足夠的抵抗力、價(jià)廉易得

載體的本質(zhì)是蛋白質(zhì)－動(dòng)物血清蛋白最常用。

牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)(2)半抗原的選擇藥物本身必須具有合適的活性官能團(tuán)，如-COOH，－NH2，－OH，－C＝O等。2/2/202315(3)載體與半抗原的結(jié)合①碳二亞胺法

利用碳二亞胺為縮合劑，將藥物分子中的羧基與蛋白質(zhì)分子中的氨基相連形成肽鍵2/2/202316②混合酸酐法2/2/202317③戊二醛法④琥珀酸酐法2/2/202318⑤重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法2/2/2023193．人工抗原的鑒定鑒定的目的：測(cè)定人工抗原（藥物）與蛋白質(zhì)的結(jié)合比光譜分析法化學(xué)分析法放射性同位素法2/2/202320(1)光譜分析法

結(jié)合物水解后，光譜法測(cè)定水解藥物和蛋白質(zhì)的含量，從而推算出它們的分子結(jié)合比。(2)化學(xué)分析法利用三硝基苯磺酸鈉或二硝基酚，測(cè)定蛋白質(zhì)與半抗原結(jié)合前后游離氨基數(shù)目的差別。反應(yīng)出蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合程度，可求出結(jié)合物中藥物的含量。(3)放射性同位素標(biāo)記法在制備人工抗原時(shí)，在已知量的藥物中加入定量的放射性同位素標(biāo)記藥物，然后通過測(cè)定結(jié)合物中的放射性強(qiáng)度，便可計(jì)算出加入的標(biāo)記藥物的總量中已與蛋白質(zhì)結(jié)合的比例。2/2/2023214．標(biāo)準(zhǔn)抗原(Standardantigen)標(biāo)準(zhǔn)抗原:在免疫測(cè)定中用來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線或制備標(biāo)記抗原用的藥物標(biāo)準(zhǔn)品，是免疫分析的定量依據(jù)。蛋白質(zhì)、多肽類可使用純度較低的產(chǎn)品，但一般不應(yīng)低于90％，尤其是其中不能含有化學(xué)結(jié)構(gòu)相類似的干擾雜質(zhì)，否則會(huì)使樣品的測(cè)定結(jié)果偏高。2/2/202322(二)特異抗體的制備及鑒定1．特異抗體(SpecificAntibody)特異抗體:（高度特異性）是指抗原(免疫原)作用于機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在血清中產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。在免疫球蛋白中，免疫球蛋白G(IgG)含量最高(約占70％)，是免疫分析中最常用的抗體。2/2/2023232．抗體的制備單克隆抗體(MonoclonalAntibody，McAb)：將預(yù)先免疫過的小鼠脾細(xì)胞與體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)而得到的雜交瘤細(xì)胞。該瘤細(xì)胞通過體外培養(yǎng)，可大量復(fù)制，產(chǎn)生出特異的結(jié)構(gòu)相同的均質(zhì)抗體，此即單克隆抗體。多克隆抗體(PolyclonalAntibody)的制備是將抗原直接免疫動(dòng)物而得到?？贵w：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體(抗血清)兩大類2/2/202324(1)免疫原的制備免疫原(Immunogen)：人工將抗原制成能刺激機(jī)體引起體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)。水劑：抗原中加入一定量的無菌生理鹽水所制成的免疫原。福氏完全佐劑(Freund’sCompleteAdjuvant)：其制法是：取羊毛脂一石蠟油(1：3)混合，高壓滅菌，等體積地與一定濃度的抗原混合，按3mg/ml的量加入卡介苗，研磨或于無菌注射器中對(duì)拉，使之成為油包水的程度(放入冰水中不擴(kuò)散)即可。福氏不完全佐劑在福氏完全佐劑中去掉卡介苗。2/2/202325(2)免疫接種動(dòng)物

家兔不僅對(duì)抗原的免疫反應(yīng)較好，而且產(chǎn)生的抗體也較均一，是首選的免疫動(dòng)物。

羊、豚鼠

微量免疫法的免疫抗原量在微克級(jí)內(nèi)，常量免疫法的免疫抗原量通常在1～10mg左右，大量免疫法的免疫抗原量在50～100mg。2/2/202326(3)抗血清的獲得

采血時(shí)應(yīng)注意無菌操作，盡可能將血放人面積較大的無菌容器中，先室溫凝固30min左右，再放人30℃溫箱約2h使凝固，最后放入4℃冰箱過夜。次日吸取血清，將血塊用無菌的玻璃棒輕輕撥離并搗碎，在4000－10000r/min離心20min，即得抗血清。大動(dòng)物免疫羊部分采血家兔等小動(dòng)物殺死動(dòng)物一次性放血。2/2/2023273．抗體的鑒定(1)滴度(Titer)滴度又稱效價(jià)或工作稀釋度。滴度用免疫反應(yīng)液中抗體(實(shí)指抗血清)的稀釋度表示，稀釋倍數(shù)越大，表示滴度越高。測(cè)定滴度可采用標(biāo)記抗原法。RIA法測(cè)定抗血清的效價(jià)為例首先將抗血清用空白血清按比例稀釋，然后精密吸取各稀釋抗血清等量，分置若干支試管中，再于各試管中分別加入定量的放射性同位素標(biāo)記藥物(設(shè)放射性強(qiáng)度為T)，溫育。待反應(yīng)達(dá)到平衡后，于反應(yīng)液中加人分離劑(如沉淀劑)，分離與抗體結(jié)合的標(biāo)記藥物(沉淀部分)，測(cè)定各管中沉淀的放射性強(qiáng)度(B)，并計(jì)算各管中標(biāo)記藥物的結(jié)合百分率(B/T％)。2/2/202328當(dāng)抗血清稀釋度足夠低時(shí)，其結(jié)合率趨于極值，該值稱為“過量抗體結(jié)合率”(標(biāo)記藥物全被結(jié)合)，如圖中曲線的AB段，可用來衡量標(biāo)記藥物的質(zhì)量。自AB段以后，隨著抗血清稀釋倍數(shù)增大，其標(biāo)記藥物的結(jié)合率逐漸降低，實(shí)際工作中多采用結(jié)合率為50％時(shí)(C點(diǎn))的抗血清稀釋度(D點(diǎn))。2/2/202329(2)活度(Avidity)活度：抗體與相應(yīng)抗原的親和力(Affinity)?；疃瓤煞从吵隹贵w分子和抗原分子之間的結(jié)合能力?；疃雀?，表明形成抗原一抗體結(jié)合物的速度快而解離小?？贵w活度高低與免疫分析方法的靈敏度密切相關(guān)，它主要表現(xiàn)在劑量反應(yīng)曲線的斜率上，斜率越陡，表明活度越高，測(cè)定效果越好。2/2/202330(3)特異性(Specificity)特異性：抗原和抗體的結(jié)合能力與其它結(jié)構(gòu)相類似的干擾物的結(jié)合能力的比較。如果抗體與抗原的結(jié)合能力越強(qiáng)，而與其它類似結(jié)構(gòu)的干擾物結(jié)合能力(稱為交叉反應(yīng))越弱，則說明抗體的特異性越強(qiáng)。2/2/202331三、方法分類1．按標(biāo)記物的種類分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)(2)酶免疫分析(enzymeimmunoassay，EIA)(3)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，CIZIA)(4)熒光免疫分析法(fluorescenceimmunoassay，F(xiàn)IA)2/2/202332熒光免疫分析法底物標(biāo)記熒光免疫分析(Substratelabeledfluorescenceimmunoassay，SLFM)熒光偏振免疫分析(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)熒光淬滅免疫分析(FluorescentQuenchingImmunoassay，F(xiàn)QM)熒光增強(qiáng)免疫分析(FluorescentEnchancementImmunoassay，F(xiàn)EIA)時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolvedfluorescenceimmunoassay，TRFIA)2/2/202333

2．按是否加入分離劑分(1)均相免疫分析(Itomogeneouslmmunoassay)在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，反應(yīng)液中結(jié)合的標(biāo)記藥物與游離的標(biāo)記藥物之中有一種不產(chǎn)生信號(hào)或信號(hào)消失，因此無需將反應(yīng)液分作兩相，即可在均相溶液中進(jìn)行測(cè)定，故稱為均相免疫分析。如酶放大免疫測(cè)定技術(shù)(enzymemultipliedimmunoassaytechnique，EMIT)。(2)非均相免疫分析(heterogeneousimmunoassay)在某些免疫分析中，當(dāng)抗原一抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，只有在反應(yīng)液中加入分離劑，將游離標(biāo)記藥物和結(jié)合標(biāo)記藥物分開之后，才能測(cè)出各自部分的標(biāo)記藥物濃度。否則，測(cè)定的是兩者的總濃度。由于這種信號(hào)的測(cè)定需將反應(yīng)液分成液-固兩相后，才能分別測(cè)定，故稱為非均相免疫分析。如放射免疫測(cè)定(Radioimmunoassay，RIA)2/2/202334第二節(jié)放射免疫分析放射性同位素標(biāo)記抗原F與B的分離技術(shù)放射免疫測(cè)定儀標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與樣品測(cè)定步驟方法評(píng)價(jià)應(yīng)用舉例2/2/202335放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)：利用放射性同位素的測(cè)量方法與免疫反應(yīng)基本原理相結(jié)合的一種同位素分析技術(shù)。特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品用量少、標(biāo)記物容易制備以及放射性強(qiáng)度容易檢測(cè)2/2/202336一、放射性同位素標(biāo)記抗原

在體內(nèi)藥物分析中，常采用放射性同位素。放射性同位素是指能自發(fā)放射出射線而變成其它元素的不穩(wěn)定同位素。放射性同位素在發(fā)生核衰變時(shí)，會(huì)發(fā)射出α-射線，β-射線及γ-射線。用相關(guān)儀器檢測(cè)產(chǎn)生的射線，即可用于于定量分析。2/2/2023371．放射性強(qiáng)度放射性強(qiáng)度(嚴(yán)格說應(yīng)為放射性活度)：每秒鐘放射性同位素的原子核發(fā)生的衰變數(shù)(desintegrationper-second，dps)，其單位為貝可(Bq)。1貝可相當(dāng)于每秒1次核衰變，即lBq=1dps。1居里是指每秒鐘放射性同位素發(fā)生3.7×1010次核衰變。2/2/2023382．放射性比度放射性比度或稱比放射性或比活性：放射性同位素單位重量或體積中所含的放射性強(qiáng)度。

mci×g-1或mci×ml-12/2/2023393．放射性化學(xué)純度(放化純度)

放化純度是指供使用的放射性藥物中所需要的標(biāo)記藥物的放射性強(qiáng)度占總放射性強(qiáng)度的百分比。一般實(shí)驗(yàn)要求放化純度大于90％。2/2/202340(二)標(biāo)記抗原(IabeledAntigen)

標(biāo)記抗原又稱放射性標(biāo)記藥物，供標(biāo)記的藥物通常應(yīng)是待測(cè)藥物的純品。標(biāo)記抗原的純度決定RIA的特異性，而標(biāo)記抗原的放射性比度則決定RIA的靈敏度。因此，標(biāo)記抗原是RIA測(cè)定技術(shù)中最關(guān)鍵的成分。2/2/2023411．對(duì)標(biāo)記抗原的一般要求①有高的放射性比度；②標(biāo)記后抗原仍具有原來的抗原性；標(biāo)記物穩(wěn)定性要好，不致因輻射引起化合物分解。2/2/2023422．標(biāo)記放射性同位素的選擇125I的特點(diǎn)是：①化學(xué)性質(zhì)活潑，易于標(biāo)記；②標(biāo)記物在衰變中放出的γ－射線能量較高，易于測(cè)定；③標(biāo)記物的放射線半衰期相對(duì)較短，須經(jīng)常標(biāo)記；④碘原子的半徑較大，標(biāo)記后可改變藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或掩蓋藥物分子的特異功能基團(tuán)，易使藥物分子的抗原性受到影響。3H的特點(diǎn)是：①用3H標(biāo)記后的藥物可獲得較高的放射性比度；②標(biāo)記后的藥物的抗原性不會(huì)受到影響，因?yàn)闅湓拥陌霃捷^小，且3H只是與藥物分子的1H發(fā)生交換，不涉及化學(xué)元素的改變③3H的半衰期很長(zhǎng)，可達(dá)12～16年；④3H發(fā)射出的β射線能量較低，須采用價(jià)格較貴的液體閃爍計(jì)數(shù)器才能測(cè)定其放射性強(qiáng)度。2/2/202343(三)標(biāo)記方法1．125I標(biāo)記抗原的制備取代反應(yīng)將其標(biāo)記在藥物或藥物的衍生物上。用碘標(biāo)記時(shí)一般采用氧化法，常用的氧化劑有H2O2及氯胺T等，目前應(yīng)用最多的是氯胺T。氧化法是指先用氧化劑將放射性碘離子(I-)氧化成游離的放射性碘分子(I2)，然后再進(jìn)行標(biāo)記。大分子藥物可直接采用放射性碘標(biāo)記。小分子物質(zhì)一般先將藥物制成含酪氨酸、組氨酸或含酚基的衍生物，然后再進(jìn)行標(biāo)記，使藥物分子中的氫被帶正電荷的放射性碘取代。2/2/2023442．3H標(biāo)記抗原的制備H標(biāo)記可分為定位標(biāo)記和非定位標(biāo)記兩種方法。非定位標(biāo)記通常采用氣體曝射法，即將藥物與氚(3H)氣密封在一起，放置幾天或幾周，使3H與藥物分子的1H發(fā)生交換定位標(biāo)記采用特殊的合成路線，即先將3H引入藥物分子結(jié)構(gòu)中的指定位置，制成含有不飽和雙鍵的標(biāo)記藥物前體，然后再對(duì)雙鍵部位進(jìn)行催化加氚。這種制備3H標(biāo)記物的方法稱為定位標(biāo)記.2/2/2023452/2/202346二、F與B的分離技術(shù)游離的標(biāo)記藥物(F)和結(jié)合的標(biāo)記藥物(B)1、沉淀法2、吸附法3、固相法4、雙抗體法2/2/202347(一)沉淀法用蛋白沉淀劑將抗體沉淀，從而可使與蛋白(抗體)相結(jié)合的藥物也一起沉淀下來，而游離的藥物由于未與蛋白結(jié)合，便留在于溶液中。常用的沉淀劑：硫酸銨、亞硫酸氫鈉、乙醇、異丙醇。方法：在免疫反應(yīng)達(dá)到平衡后的反應(yīng)液中加入一定量的飽和硫酸銨溶液，使最終濃度為1.6－2.0mol/L(約40％－50％的飽和度)，立即混勻，在4℃條件下反應(yīng)20～30min后，離心，分離沉淀物，用40％的硫酸銨飽和溶液洗滌沉淀，然后測(cè)定放射性強(qiáng)度。優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、價(jià)廉。缺點(diǎn)：不能使F和B完全分離，沉淀物對(duì)放射性標(biāo)記抗原有非特異性吸附，因而空白值較高。2/2/202348(二)吸附法

吸附法是利用固體吸附劑能在反應(yīng)液中吸附游離抗原的原理而使F與B分離。常用的吸附劑：右旋糖酐包裹的活性炭(DextronCoatedCarbon，DCC)、纖維素、硅酸鹽等。2/2/202349原理：DCC是利用活性炭的強(qiáng)吸附性和右旋糖酐的分子篩作用，使小分子的游離藥物能通過分子篩的網(wǎng)眼被內(nèi)層的活性碳選擇性吸附，而與抗體相結(jié)合的藥物由于分子體積大則不能通過網(wǎng)眼而被留在液相中。方法：當(dāng)免疫反應(yīng)達(dá)到平衡后，于反應(yīng)液中加入DCC吸附劑，待吸附達(dá)平衡后，離心。離心后的結(jié)果正好與沉淀法相反，上清液中是與抗體相結(jié)合的標(biāo)記藥物(B)，而沉淀中則是游離的標(biāo)記藥物(F)。優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：如藥物一抗體結(jié)合物的離解常數(shù)較高時(shí)，測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定。2/2/202350(三)固相法原理：通過物理涂敷或化學(xué)結(jié)合方法將抗體結(jié)合在不溶性固相載體表面，待抗原與抗體形成結(jié)合物(B)后就附在固相物上，而游離的抗原(F)則仍留在反應(yīng)液中，從而實(shí)行分離。該法實(shí)質(zhì)上是一種固相免疫測(cè)定法(solid-phaseimmunoassay)，其固相本身就是一些特異的免疫吸附劑。常用的固相載體：葡聚糖凝膠、聚苯乙烯、纖維素、試管等。2/2/202351方法：采用試管固相法，即將抗體直接附著于試管底部的內(nèi)壁上，測(cè)定時(shí)于試管中加入樣品和試劑，當(dāng)放射免疫反應(yīng)達(dá)到平衡后，結(jié)合物就附在管壁上，游離抗原則留在液相中。通過離心或采用簡(jiǎn)單傾去法便可將兩相分離。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用。缺點(diǎn)：有時(shí)難以獲得重復(fù)的結(jié)合率，其次是固相載體本身也有可能吸附游離標(biāo)記藥物，導(dǎo)致結(jié)果誤差增大。2/2/202352(四)雙抗體法分離原理：藥物(半抗原)與抗體結(jié)合后，雖然分子量增大，但還不足以生成沉淀而處于“溶解”狀態(tài)，這種抗體通常被稱為第一抗體，它可通過將抗原注入家兔、豚鼠等動(dòng)物體內(nèi)免疫獲得。然后再將第一抗體作為新的抗原注入羊、馬、牛等較大動(dòng)物，則可免疫獲得第二抗體(抗一抗體)。當(dāng)往第一抗體的反應(yīng)液中加入第二抗體后，第一抗體能與第二抗體結(jié)合使分子量增大，從而生成沉淀。離心后與抗體結(jié)合的標(biāo)記藥物(抗原-第一抗體-第二抗體結(jié)合物)處在沉淀中，而游離的標(biāo)記抗原則留在上清液中。2/2/202353優(yōu)點(diǎn)：分離效果好，適用范圍廣。缺點(diǎn)：抗體的制備有一定難度，且操作流程較長(zhǎng)。2/2/202354三、放射免疫測(cè)定儀

一類是γ計(jì)數(shù)器(γ-Counter)，其所用的閃爍體是碘化鈉等固態(tài)閃爍晶體，為提高其發(fā)光效率，還在晶體內(nèi)加入有0.1％－0.5％的鉈作為激活劑，該儀器適合測(cè)定125I、131I等同位素發(fā)射出的能量較高的β-射線。

一類是液體閃爍測(cè)量?jī)x(LiquidScintillationCounter)，由于該儀器放出的β射線能量低、射程短，不可能穿人和激發(fā)固態(tài)閃爍晶體，而只能在特定的閃爍液中進(jìn)行，由β-射線激發(fā)液體閃爍劑而產(chǎn)生閃光現(xiàn)象。該儀器適合測(cè)定3H、14c等同位素發(fā)射出來的β-射線。2/2/202355(一)測(cè)量原理

液體閃爍測(cè)量?jī)x是利用放射性同位素標(biāo)記藥物所發(fā)射出的β-射線能作用于閃爍液而發(fā)出熒光(閃光)，該熒光與放射性藥物在單位時(shí)間內(nèi)的核衰變次數(shù)有關(guān)，通過檢測(cè)閃爍次數(shù)便可求出待測(cè)組分含量。2/2/2023561．溶劑作用：溶解閃爍劑和放射性樣品；同時(shí)還起著吸收和轉(zhuǎn)移β-射線能量的作用。條件：溶劑分子必須具有高度共軛的雙鍵，只要受到能量低的β-射線的輻射，其π電子就能躍遷至激發(fā)態(tài)。一類是烷基苯類，甲苯、對(duì)－二甲苯、1，2，4－三甲苯等，主要適用于脂溶性藥物的測(cè)定。另一類是醚類，1，4－二氧六環(huán)，適用于水溶性藥物的測(cè)定。種類2/2/2023572．閃爍劑作用：接受激發(fā)態(tài)溶劑分子退激時(shí)所釋放的能量→激發(fā)態(tài)→基態(tài)→發(fā)射出閃爍的熒光(光子)→光電倍增管→光電轉(zhuǎn)換測(cè)量系統(tǒng)記錄。要求：性能穩(wěn)定、閃爍效率(閃爍劑放出光子的能量)高、淬滅耐受性好、發(fā)光衰減時(shí)間短。常用的閃爍劑有：對(duì)聯(lián)三苯(TP)、2，5－二苯基噁唑(PPO)、2－苯基－5－(4－聯(lián)苯基)－1，3，4－噁－二唑(PBD)等。2/2/202358(二)儀器簡(jiǎn)介2/2/2023591．計(jì)數(shù)瓶計(jì)數(shù)瓶(或稱閃爍杯)：一個(gè)具蓋的玻璃或塑料小瓶(10～20m1)，用于盛裝樣品和閃爍液。當(dāng)放射性藥物分子與閃爍液接觸時(shí)，溶劑吸收放射能量并轉(zhuǎn)給閃爍劑，閃爍劑將吸收的能量轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽?熒光)，熒光透過計(jì)數(shù)瓶壁，進(jìn)入光電倍增管。2/2/2023602．光電倍增管光電倍增管：光陰極、倍增極和陽極構(gòu)成。進(jìn)入光電倍增管的熒光(光子)通過光陰極表面的透明面板后，直接撞擊光陰極，光陰極吸收光子能量后隨即發(fā)射出光電子，光電子經(jīng)數(shù)個(gè)倍增極依次放大，使電子數(shù)劇增。這些電子最后被陽極收集，產(chǎn)生一個(gè)電壓脈沖，并由記錄器記錄下來2/2/2023613．記錄器

用于記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的電壓脈沖數(shù)，該脈沖數(shù)反映了單位時(shí)間內(nèi)放射性藥物的核衰變次數(shù)(閃爍次數(shù))。通常采用每分鐘計(jì)數(shù)(countsperminate，cpm)，作為放射性同位素藥物的放射性強(qiáng)度。2/2/202362四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與樣品測(cè)定步驟2/2/202363(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取標(biāo)準(zhǔn)抗原，用無放射活性的空白血清或血漿稀釋成5－8個(gè)系列濃度。加入定量標(biāo)記抗原，其總放射性(T)應(yīng)能滿足準(zhǔn)確測(cè)量的需要。加入定量的已稀釋好的特異抗體，其抗體的量應(yīng)滿足靈敏度的要求。將標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)記抗原、特異抗體與緩沖液混勻后，在適當(dāng)條件下溫育，待反應(yīng)平衡后測(cè)定總計(jì)數(shù)率(T)。2/2/202364加入分離劑，使結(jié)合部分(B)與游離部分(F)分離。測(cè)定各管結(jié)合部分或游離部分的計(jì)數(shù)率。標(biāo)準(zhǔn)曲線通常以標(biāo)準(zhǔn)抗原(待測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)品)的濃度為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率(B％)為縱坐標(biāo)作圖?？v坐標(biāo)B％的計(jì)算有兩種方法：一種是將與抗體結(jié)合的標(biāo)記藥物的放射性強(qiáng)度(B)與加入的標(biāo)記藥物總放射性強(qiáng)度(T)比較，即B％=(B／T)×100％；另一種是用零標(biāo)準(zhǔn)管(不加藥物標(biāo)準(zhǔn)品)的放射性強(qiáng)度B0代替T比較，即B％=(B／B0)×100％。2/2/202365(二)樣品測(cè)定步驟下述情況樣品需進(jìn)行簡(jiǎn)單處理：測(cè)定方法不夠靈敏，可將被測(cè)物適當(dāng)濃集；測(cè)定方法不很專屬，可將被測(cè)物與其它干擾物質(zhì)分離；待測(cè)物以綴合物形式存在，可設(shè)法使其游離，然后進(jìn)行測(cè)定。2/2/202366例：125I－RIA(DCC沉淀法)測(cè)定血清中地高辛濃度待測(cè)血清樣品50μl→樣品管中;含不同濃度地高辛標(biāo)準(zhǔn)品的血清50μl→標(biāo)準(zhǔn)曲線各管中;50μl空白人血清→零標(biāo)準(zhǔn)管.各管中依次加入保溫液100μl→抗體溶液100μl→125I標(biāo)記的地高辛(溶液)100μl搖勻→在室溫(15～25℃)放置30min→γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定各管的總計(jì)數(shù)T(即加人的協(xié)I總放射性劑量)→在電磁攪拌(或手搖)下，迅速向各管內(nèi)加人1ml工作液(全部加完控制在5min內(nèi))，搖勻→離心10min(3000r/min)→傾去上清液→γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定各管中沉淀的計(jì)數(shù)F(游離協(xié)I地高辛放射性強(qiáng)度)→計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線各管和樣品各管的結(jié)合率。2/2/2023672/2/202368五、方法評(píng)價(jià)靈敏度高、特異性強(qiáng)、取樣量少、適用于大批量樣品的測(cè)定。需用放射性同位素標(biāo)記抗原，其放射性對(duì)操作人員的健康、對(duì)環(huán)境的污染都會(huì)造成危害，而且還需有專用的同位素實(shí)驗(yàn)室及免疫測(cè)定儀器，成本較高，因而使其普及受到限制。2/2/202369六、應(yīng)用示例固相放射免疫分析試劑盒測(cè)定血清中地高辛濃度的方法1．主要試劑2．測(cè)定方法2/2/2023703．結(jié)果計(jì)算(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法以地高辛標(biāo)準(zhǔn)品血清濃度為橫坐標(biāo)，B標(biāo)／T(％)為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。。以地高辛標(biāo)準(zhǔn)品血清濃度為橫坐標(biāo)，但用(B標(biāo)-BNSB)/(B0－BNSB)(％)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)測(cè)得血清樣品的(B樣－BNSB)/(B0-BNSB)(％)值后，也可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到對(duì)應(yīng)的血清藥濃2/2/202371(2)回歸方程計(jì)算法以logx為自變量(x為血清中地高辛標(biāo)準(zhǔn)品的濃度)，以logitY為因變量進(jìn)行直線回歸2/2/202372第三節(jié)酶免疫分析法酶標(biāo)記抗原均相酶免疫分析非均相酶免疫分析方法評(píng)價(jià)應(yīng)用示例2/2/202373

酶免疫分析(EnzymeImmunoassay，EIA)是以酶作為標(biāo)記物的免疫測(cè)定方法。酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基礎(chǔ)上發(fā)展產(chǎn)生起來的一種新的免疫分析方法。2/2/202374一、酶標(biāo)記抗原(一)標(biāo)記酶的選擇特異性強(qiáng)，酶蛋白分子中應(yīng)具有足夠的活性基團(tuán)，以便能與藥物結(jié)合?；钚砸?，即當(dāng)?shù)孜餄舛鹊蜁r(shí)，確有較高的催化反應(yīng)率。酶的活性不易受樣品中其它成分影響，有較好的穩(wěn)定性。酶的純度要高，且生物體液中應(yīng)無標(biāo)記酶、底物、抑制劑及其它干擾物質(zhì)存在。酶的活性測(cè)量方法應(yīng)簡(jiǎn)單、靈敏、精密和快速。酶的來源、純化、供應(yīng)等應(yīng)方便、價(jià)廉。2/2/202375最常用的標(biāo)記酶1．辣根過氧化物酶(HRP):約有50％的EIA使用此酶。2．堿性磷酸酯酶(AP):AP標(biāo)記的結(jié)合物性質(zhì)穩(wěn)定，其活性可用分光光度計(jì)或熒光計(jì)測(cè)量。3．6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD):通常用于均相EIA。4．β-半乳糖苷酶(β-Gal):適用于均相EIA和非均相EIA。5．蘋果酸脫氫酶(MDH):多用于尿樣的均相EIA。2/2/202376(二)底物的選擇①無色、無毒能溶水；②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不受光照的影響；③轉(zhuǎn)化率高，在酶催化下可產(chǎn)生大量的有色物質(zhì)；④顯色產(chǎn)物的量在一定范圍內(nèi)與酶的濃度或活性成正比；⑤應(yīng)有終止酶反應(yīng)的試劑。2/2/202377常用酶的底物1、辣根過氧化物酶的底物：鄰苯二胺（OPD）、5-氨基水楊酸（5-ASA）、四甲基聯(lián)苯胺及其硫酸鹽（TMB/TMBS）2、堿性磷酸酶底物：對(duì)硝基酚磷酸鹽溶液（p-NPP）、4-甲基傘酮基-磷酸鹽（4-MUP）3、β-D-半乳糖苷酶底物：鄰硝基苯－β-D-半乳糖吡喃苷（o-NPG）、氯酚紅-β-D-半乳糖吡喃苷（CPRG）、試鹵靈-β-D-半乳糖吡喃苷（RG）4、葡萄糖氧化酶底物：與辣根過氧化物酶底物相同2/2/202378（三）：酶標(biāo)記藥物的制備酶標(biāo)藥物的酶活性和免疫活性決定了酶免疫測(cè)定法的靈敏度，因此酶標(biāo)藥物成為EIA的關(guān)鍵。選擇制備方法應(yīng)注意以下原則：（1）對(duì)酶和抗體的活性沒有影響（2）生成的結(jié)合物是可溶的、穩(wěn)定的（3）反應(yīng)條件易控制（4）制備方法簡(jiǎn)單、能重現(xiàn)2/2/202379二、均相EIA均相酶免疫分析(HomogeneousEnzymeImmunoassay)是指酶標(biāo)抗原(AgE)同抗體(Ab)結(jié)合后，所形成的酶標(biāo)抗原一抗體結(jié)合物(AgE—Ab)可使酶的活性發(fā)生改變(增強(qiáng)或減弱)，且不需將游離的酶標(biāo)藥物(AgE)與結(jié)合的(AgE一Ab)酶標(biāo)藥物分開，就可直接通過測(cè)定酶活性的變化，求出樣品含量的方法。酶增強(qiáng)(放大)免疫測(cè)定技術(shù)(EnzymeMultipliedImnunoassay、technique，EMIT)，或稱“結(jié)合酶免疫分析法”2/2/202380(一)測(cè)定原理2/2/202381

EMIT法通常使用6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD)作標(biāo)記酶，其原理是標(biāo)記在待測(cè)藥物上的G-6-PD在輔酶I參與下能將底物6-磷酸葡萄糖(G-6-P)氧化成6-磷酸葡萄糖酸，而輔酶I本身則被還原成還原型輔酶I(NADH)。在該反應(yīng)過程中，輔酶I的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致NAD與NADH的紫外吸收光譜形狀不同，還原型輔酶I在340nm處有最大吸收，而輔酶I在此波長(zhǎng)處則吸收甚小。2/2/2023822/2/202383(二)測(cè)定方法

未標(biāo)記藥物(Ag)＋抗體＋輔酶I(NAD)＋底物(G-6-P)→抗原-抗體結(jié)合物Ag-Ab→酶標(biāo)藥物(AgE)。酶標(biāo)藥物與未標(biāo)記藥物互相競(jìng)爭(zhēng)有限量的抗體(Ab)，當(dāng)這種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡之后，則有部分酶標(biāo)藥物與抗體相結(jié)合，從而使結(jié)合酶標(biāo)藥物(AgE-Ab)上的酶活性受到抑制，不能再同底物發(fā)生作用，而只有游離酶標(biāo)藥物(AgE)上的酶才有活性，能作用于底物產(chǎn)生測(cè)定信號(hào)。如果樣品中待測(cè)藥物的濃度越高，則競(jìng)爭(zhēng)抑制的結(jié)果使游離酶標(biāo)藥物的量增多，亦即酶的活性隨著待測(cè)藥物濃度的增加而增強(qiáng)，故有“酶增強(qiáng)免疫技術(shù)”之稱。由于游離酶標(biāo)藥物量的增多，能使更多的NAD參與氧化反應(yīng)，生成更多的酶反應(yīng)產(chǎn)物NADH。根據(jù)NADH在340nm處有紫外吸收的原理，便可用分光光度計(jì)測(cè)定吸收度，求出待測(cè)藥物的含量。2/2/202384三、非均相EIA非均相免疫分析：指酶標(biāo)抗原(AgE)同抗體(Ab)結(jié)合后，形成的酶標(biāo)抗原-抗體結(jié)合物(AgE-Ab)與游離的酶標(biāo)抗原(AE)一樣，其標(biāo)記酶都具酶活性。因此必須將AgE－Ab與游離的AgE分開后，再測(cè)定酶活性的變化，以求出待測(cè)藥物的含量。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)：將一種反應(yīng)物固定在固相載體上，當(dāng)另一種反應(yīng)物與其結(jié)合后，可通過洗滌、離心等方法將液相中未結(jié)合的其它物質(zhì)傾去，然后測(cè)定結(jié)合在固相上的酶活性。2/2/202385(一)測(cè)定原理2/2/202386(二)測(cè)定步驟