第一章抗原抗體反應(yīng)

第一章抗原抗體反應(yīng)免疫學(xué)診斷技術(shù)概述(4學(xué)時(shí))檢測(cè)抗原制備技術(shù)

第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理

第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)

第三節(jié)影響抗原抗體反應(yīng)的因素

第四節(jié)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的類(lèi)型

第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理

抗原抗體反應(yīng)，主要是指抗原和抗體在體外結(jié)合所表現(xiàn)的反應(yīng)。由于抗體主要存在于血清中，并且臨床上多用血清做試驗(yàn)，所以體外實(shí)驗(yàn)中的抗原抗體反應(yīng)曾稱(chēng)作血清學(xué)反應(yīng)（serologicalreaction)。但是隨著免疫學(xué)的發(fā)展，血清學(xué)的含義已不能概括目前的研究?jī)?nèi)容，現(xiàn)在多以抗原抗體反應(yīng)代替血清學(xué)反應(yīng)一詞。Ag:AntigenAb:Antibody第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理

抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。物質(zhì)基礎(chǔ):

抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

抗原抗體結(jié)合力示意圖一、抗原抗體結(jié)合力l.靜電引力

抗原和抗體分子帶有相反電荷的氨基和羧基基團(tuán)之間相互的引力，稱(chēng)為靜電引力，又稱(chēng)庫(kù)倫引力。例如，抗體分子上帶電荷的堿性氨基酸的游離氨基(-NH3+)和酸性氨基酸的游離羧基(-COO-)可與抗原分子上帶相反電荷的對(duì)應(yīng)基團(tuán)相互吸引。這種引力的大小與兩個(gè)相互作用基團(tuán)間的距離平方成反比。

2.范德華引力

抗原和抗體相互接近時(shí)，由于分子的極化作用而出現(xiàn)的引力，稱(chēng)范德華引力。結(jié)合力的大小與兩個(gè)相互作用基團(tuán)的極化程度的乘積成正比、與它們之間距離的7次方成反比，鍵能約為4.2-12.5kJ/moL。這種引力的能量小于靜電引力。3.氫鍵結(jié)合力

供氫體上的氫原子與受氫體原子間的引力。在抗原抗體反應(yīng)中，羧基、氨基和羥基是主要供氫體，而羧基氧、羧基碳和肽鍵氧等原子是主要受氫體。氫鍵結(jié)合力與供氫體和受氫體之間距離的6次方成反比，鍵能約20.9kJ/mol。4.疏水作用力

兩個(gè)疏水基團(tuán)在水溶液中相互接觸時(shí)，由于對(duì)水分子排斥而趨向聚集的力稱(chēng)為疏水作用力，或稱(chēng)為疏水鍵。當(dāng)抗原抗體反應(yīng)時(shí)，抗原決定簇與抗體上的結(jié)合點(diǎn)靠近，互相間正、負(fù)極性消失，由靜電作用形成的親水層立即失去，從而促進(jìn)抗原與抗體的相互吸引而結(jié)合。疏水作用力在抗原抗體反應(yīng)中的結(jié)合是很重要的。提供的作用力最大，約占總結(jié)合力的50%?？贵w分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力親和力(affinity)抗原抗體親和力示意圖二、抗原抗體的親和力和親合力抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度親合力(avidity)抗原抗體親合力示意圖

抗體與抗原結(jié)合是可逆的反應(yīng)，在平衡時(shí)其

親和常數(shù)

K=抗原抗體復(fù)合物濃度游離抗原濃度×游離抗體濃度

K代表抗體結(jié)合抗原的親和力。

K值大的抗體與抗原牢固結(jié)合，不易解離，稱(chēng)該抗體有高親和力。三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗體和大多數(shù)抗原同屬蛋白質(zhì)。在通常的血清學(xué)反應(yīng)條件下均帶有負(fù)電荷，使極化的水分子在其周?chē)纬伤瘜?，成為親水膠體，因此蛋白質(zhì)不會(huì)自行凝集出現(xiàn)沉淀。當(dāng)Ag與Ab結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變?。欢矣捎贏g-Ab復(fù)合物形成后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。此時(shí)在電解質(zhì)(如NaCl)的作用下，使各疏水膠體之間進(jìn)一步靠攏、沉淀，形成可見(jiàn)的Ag-Ab復(fù)合物。

可見(jiàn)反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物

(疏水膠體)電解質(zhì)

抗原(親水膠體)

抗體(親水膠體)

+三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性可逆性比例性階段性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性一、特異性?xún)煞N不同的抗原分子具有部分相同或類(lèi)似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)交叉反應(yīng)（crossreactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖二、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響－pH、離子強(qiáng)度

Ag與Ab的結(jié)合常需適當(dāng)比例才出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)，在最適比例時(shí)反應(yīng)最明顯；這種現(xiàn)象可以用“格子學(xué)說(shuō)”來(lái)解釋?zhuān)篈b(IgG)為二價(jià)，Ag通常為多價(jià)，只有Ag，Ab結(jié)合形成大的復(fù)合物，肉眼才可見(jiàn)。三、比例性格子學(xué)說(shuō)Myoglobin：肌紅蛋白只有當(dāng)Ag與Ab比例適當(dāng)時(shí)，才能形成大的復(fù)合物，比例不適當(dāng)，就只能形成小的復(fù)合物而抑制反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn)，此所謂帶現(xiàn)象；前帶現(xiàn)象：Ab過(guò)剩，Ag過(guò)少；

稀釋Ab，凝集反應(yīng)常見(jiàn)；后帶現(xiàn)象：Ag過(guò)剩，Ab過(guò)少；

稀釋Ag、沉淀反應(yīng)常見(jiàn)。前帶現(xiàn)象后帶現(xiàn)象前帶(prezone)：抗體過(guò)量后帶(postzone)：抗原過(guò)量等價(jià)帶(equivalencezone)：

抗原抗體比例合適

抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖比例性：抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系三、比例性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見(jiàn)第二階段：反應(yīng)可見(jiàn)階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象四、階段性第三節(jié)影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原、抗體反應(yīng)物的自身因素環(huán)境因素一、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類(lèi)和數(shù)目抗體:來(lái)源、特異性、親和性、效價(jià)1、抗原

抗原的理化性狀、抗原決定簇的數(shù)目和種類(lèi)均可影響血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果

例如，可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)沉淀，而顆粒性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)則出現(xiàn)凝集；單價(jià)抗原與抗體結(jié)合不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)；粗糙型細(xì)菌在生理鹽水中易出現(xiàn)自凝；紅細(xì)胞與IgG類(lèi)抗體結(jié)合不出現(xiàn)直接凝集等。一、反應(yīng)物自身因素抗體對(duì)反應(yīng)的影響表現(xiàn)在以下三個(gè)方面:(1)來(lái)源:來(lái)自不同動(dòng)物的免疫血清，其反應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動(dòng)物的免疫血清具有較寬的等價(jià)帶，通常在抗原過(guò)量時(shí)才易出現(xiàn)可溶性免疫復(fù)合物；馬等大動(dòng)物和人的免疫血清等價(jià)帶較窄，少量的抗原或抗體過(guò)剩，均可形成可溶性免疫復(fù)合物；家禽免疫血清不能結(jié)合哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體，并且在高鹽濃度（8.5%NaCl）溶液中沉淀現(xiàn)象明顯。單克隆抗體一般不適用于沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)。

2、抗體(2)特異性與親和力:特異性和親和力是影響血清學(xué)反應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確程度。免疫動(dòng)物早期獲得的抗血清特異性較好，但親和力低；后期獲得的抗血清一般親和力較高，但長(zhǎng)期免疫易使免疫血清中抗體的類(lèi)型和反應(yīng)性變得更為復(fù)雜。因此，用于診斷的試劑必須盡量選用特異性高、親和力強(qiáng)的抗體，才能保證和提高試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。（3）濃度:

抗體的濃度往往是與抗原相對(duì)而言。合適的濃度才出現(xiàn)明顯的反應(yīng)現(xiàn)象。因此許多試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行抗體預(yù)滴定，找出最適反應(yīng)濃度。

l.電解質(zhì)

抗原抗體結(jié)合后由親水性變?yōu)槭杷?，此時(shí)易受電解質(zhì)影響，如有適當(dāng)濃度電解質(zhì)存在，就會(huì)使抗原抗體失去一部分電荷而相互凝集或沉淀，出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng);若無(wú)電解質(zhì)存在，則不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。通常在血清學(xué)試驗(yàn)中，以8.5%NaCl溶液作為抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液，其中Na+和Cl-可分別中和膠體顆粒上的電荷，使膠體顆粒的電勢(shì)下降，形成可見(jiàn)的沉淀物或凝集物。但如果電解質(zhì)濃度過(guò)高，則會(huì)出現(xiàn)非特異性蛋白質(zhì)沉淀，即鹽析。二、環(huán)境因素2.酸堿度

合適的pH是抗原抗體反應(yīng)的必要條件之一。血清學(xué)試驗(yàn)一般以pH6-9為宜，超出此范圍可影響抗原和抗體的理化性質(zhì)，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。當(dāng)pH為3左右時(shí)，接近細(xì)菌抗原的等電點(diǎn)，可出現(xiàn)非特異性酸凝集，造成假象。3.溫度

抗原抗體反應(yīng)一般在15-40℃范圍內(nèi)均可進(jìn)行，最適溫度為37℃。在此范圍內(nèi)溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，增加抗原抗體接觸機(jī)會(huì)，反應(yīng)速度越快，但亦容易引起復(fù)合物解離;溫度越低，反應(yīng)速度緩慢，但抗原抗體結(jié)合牢固，易于觀察。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)需要特定的溫度，如冷凝集素在4℃時(shí)與紅細(xì)胞結(jié)合，20℃以上反而解離。4、作用時(shí)間

抗原抗體反應(yīng)應(yīng)有足夠的時(shí)間，不同反應(yīng)時(shí)間不同。

此外，抗原抗體反應(yīng)在液相中反應(yīng)時(shí)，適當(dāng)振蕩與攪拌，也可促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。電解質(zhì):生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9溫度:15℃～40℃，37℃最適二、環(huán)境因素反應(yīng)類(lèi)型實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)觀察凝集現(xiàn)象間接凝集試驗(yàn)同上抗球蛋白試驗(yàn)同上沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗(yàn)觀察沉淀，檢測(cè)濁度免疫電泳技術(shù)觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)觀察測(cè)定溶血現(xiàn)象補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)同上第四節(jié)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的類(lèi)型反應(yīng)類(lèi)型實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)病毒感染性毒素中和試驗(yàn)檢測(cè)外毒素毒性標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)檢測(cè)熒光現(xiàn)象放射免疫技術(shù)檢測(cè)放射性強(qiáng)度酶免疫技術(shù)檢測(cè)酶底物顯色發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度金免疫技術(shù)檢測(cè)金顆粒沉淀原理：將可溶性抗原層積于抗體之上，如果二者相應(yīng)，則可在抗原、抗體兩液接觸界面形成白色的沉淀環(huán)環(huán)狀沉淀反應(yīng)試驗(yàn)組陽(yáng)性對(duì)照組陰性對(duì)照組

原理：

可溶性Ag與Ab在含有電解質(zhì)的半固體（1%）瓊脂內(nèi)進(jìn)行自由擴(kuò)散，當(dāng)兩者由高濃度向低濃度擴(kuò)散相遇時(shí)，如果二者相對(duì)應(yīng)而且比例適當(dāng)，則可在相遇處形成白色的沉淀線(xiàn)，為陽(yáng)性反應(yīng)。另外，沉淀帶對(duì)于組成它的Ag、Ab具有特異地不可透過(guò)性，而對(duì)其它的Ag與Ab是可透過(guò)的，所以一條沉淀帶僅代表一種AgAb系統(tǒng)的沉淀物。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗原制備技術(shù)抗原是一類(lèi)能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，或稱(chēng)免疫原。完全抗原:反應(yīng)原性+免疫原性半抗原(不完全抗原):只具備反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)。

來(lái)源于病原體及其病原體的代謝、分泌和排泄物等天然抗原，均可作為良好的檢測(cè)抗原。其種類(lèi)，因病原體的種株不同而異。微生物中的衣原體、支原體、細(xì)菌、螺旋體、立克次體、真菌和放線(xiàn)菌等病原體表層結(jié)構(gòu)蛋白以及各種外毒素、內(nèi)毒素和酶等毒力因子，噬菌體、病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白，如衣殼蛋白、包膜上的各種糖蛋白、基質(zhì)蛋白以及病毒編碼的復(fù)制酶等均是良好的檢測(cè)抗原。

大多數(shù)寄生蟲(chóng)是多細(xì)胞生物，其抗原具有復(fù)雜性、多源性，同時(shí)又具有種屬和生活史不同期的特異性。來(lái)源于蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)性物質(zhì)的蟲(chóng)體抗原、蟲(chóng)體排泄物和分泌物中的蛋白或多肽類(lèi)、糖脂或多糖等代謝性抗原以及生活蟲(chóng)體排放或脫落到宿主體內(nèi)可出現(xiàn)于血循環(huán)的大分子微粒性循環(huán)抗原等均可作為檢測(cè)抗原?？股氐人幬镆蚱浞肿恿枯^小，不具有抗原性。與牛血清白蛋白等大分子偶聯(lián)后才具有完全抗原的特性。

來(lái)源于自然感染或人工感染以及人工培養(yǎng)病原生物體的生物大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、酶類(lèi)等，必須進(jìn)行分離純化，才能作為特異性較好的檢測(cè)抗原。分離純化方法有選擇性沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、電泳法、超速離心法、層析法等。其中用于蛋白質(zhì)和酶的提取，多采用選擇性沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法。（一）分離純化法（1）飽和硫酸銨法：鹽析沉淀法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)和酶純化分離技術(shù)。最常用的方法是以33%~50%的飽和硫酸銨依次沉淀3次。將鹽析沉淀后的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，用蒸餾水或緩沖液，4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行透析，更換蒸餾水或緩沖液3次，直至袋內(nèi)鹽充分透析除盡為止。此外，亦可用葡聚糖凝膠層析法脫鹽。（一）分離純化法（2）有機(jī)溶劑沉淀法：常用乙醇或丙酮，加入時(shí)應(yīng)攪拌均勻，pH值大多控制在待沉淀蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，置4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行。（3）分子篩層析法：又稱(chēng)凝膠過(guò)濾法，它是利用分子篩將抗原分成大、中、小三種類(lèi)型。特別是經(jīng)過(guò)初步純化后的蛋白質(zhì)和酶抗原采用此種方法進(jìn)一步純化，效果尤為顯著。（一）分離純化法（4）親和層析法：親和層析法則是利用生物大分子的生物學(xué)特異性而設(shè)計(jì)的層析分離技術(shù)。例如抗原抗體、酶和酶抑制劑或配體、酶蛋白和輔酶、DNA和RNA、激素和受體等之間具有特殊的親和力，在一定條件下，二者能緊密結(jié)合形成復(fù)合物。如果將其中的一方面固定在載體上，則可從溶液中提取和分離相應(yīng)的另一方。親和層析可以達(dá)到很高的純度。有時(shí)僅需進(jìn)行一步純化即可達(dá)到純化的目的。（二）抗原定性鑒定純化蛋白質(zhì)抗原的定性鑒定常用的方法有：免疫電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)抗原濃度的定量測(cè)定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法。（三）抗原的濃縮

（1）純化后的抗原常用聚乙二醇（PEG）、凝膠和蔗糖等吸收劑進(jìn)行濃縮。使用PEG或蔗糖吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入透析袋里，扎緊袋口，外加吸收劑覆蓋，袋內(nèi)溶劑滲出被吸收劑吸去，吸收劑被溶劑飽和后，亦可更換，直至濃縮至所需濃度為止。吸收劑可經(jīng)加熱除去吸收的水分后再次使用。將生物大分子溶液裝入透析袋，扎緊袋口，然后將透析袋置電扇旁吹風(fēng)，促使水分緩慢蒸發(fā)，可起到濃縮作用。（三）抗原的濃縮（2）超濾濃縮是使用一種特定孔徑的濾膜對(duì)溶液中各種