第6章分子生物學(xué)研究法(下)

第6章分子生物學(xué)研究法(下)

——基因功能研究技術(shù)教學(xué)目的：1.熟悉基因表達(dá)研究技術(shù)的原理和流程。2.熟悉基因敲除的原理和類型。3.熟悉基因芯片技術(shù)的原理和工作流程。4.了解利用酵母來(lái)鑒定靶基因的功能。教學(xué)重點(diǎn)：各種技術(shù)的基本原理和流程。1第6章分子生物學(xué)研究法(下)

——基因功能研究技術(shù)6.1基因表達(dá)研究技術(shù)6.2基因敲除技術(shù)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析6.5利用酵母鑒定靶基因功能6.6其他分子生物學(xué)技術(shù)26.1基因表達(dá)研究技術(shù)轉(zhuǎn)錄組廣義上指在特定生理?xiàng)l件或環(huán)境下，一個(gè)細(xì)胞、組織或生物體中轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。狹義上特指細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有mRNA。通過(guò)特定生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)mRNA的豐度來(lái)描述基因表達(dá)水平并外推到最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的豐度，是目前基因表達(dá)研究的基本思路。轉(zhuǎn)錄組研究的基本方法包括基因芯片技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)。6.1.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序31)表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序(EST)原理：EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5端和3端單向一次測(cè)序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個(gè)完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫(kù)中其長(zhǎng)度一般從20到7000bp不等，平均長(zhǎng)度為360±120bp。EST來(lái)源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，因此EST也能說(shuō)明該組織中各基因的表達(dá)水平。操作流程：組織樣品mRNA的提取→逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA→構(gòu)建cDNA文庫(kù)→測(cè)序。42)基因表達(dá)系列分析(SAGE)原理:SAGE是通過(guò)快速和詳細(xì)分析成千上萬(wàn)個(gè)EST來(lái)尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列。通過(guò)限制性酶切可以產(chǎn)生非常短的cDNA標(biāo)簽，并通過(guò)PCR擴(kuò)增和連接，隨后對(duì)連接體進(jìn)行測(cè)序。操作流程：以寡聚dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用錨定酶酶切。將cDNA等分為A和B兩部分，分別連接接頭A或接頭B。每一種接頭都含有標(biāo)簽酶酶切位點(diǎn)序列.用標(biāo)簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短cDNA片段，混合并連接兩個(gè)cDNA池的短cDNA片段，構(gòu)成雙標(biāo)簽后，以引物A和B擴(kuò)增。用錨定酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，抽提雙標(biāo)簽片段并克隆、測(cè)序。對(duì)標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。563)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序(RNA-Seq)原理：所有的高通量測(cè)序技術(shù)都能進(jìn)行RNA測(cè)序。對(duì)cDNA進(jìn)行高通量測(cè)序，以獲得來(lái)不同mRNA片段在特定樣本中的含量。各種類型的轉(zhuǎn)錄本都可以進(jìn)行高通量檢測(cè)。操作流程：樣品RNA準(zhǔn)備cDNA文庫(kù)構(gòu)建DNA成簇?cái)U(kuò)增高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析76.1.2RNA的選擇性剪接技術(shù)RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個(gè)mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程。選擇性剪接可分為：平衡剪切、5選擇性剪切、3選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥型剪切。常用RT-PCR法研究某個(gè)基因是否存在選擇性剪切。89106.1.3原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)(ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織，細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。原位雜交分為RNA原位雜交和染色體原位雜交。RNA原位雜交組織切片中，對(duì)特定基因的表達(dá)產(chǎn)物(mRNA)在細(xì)胞水平上作出定性定量分析。染色體原位雜交也稱為熒光原位雜交(FISH)

可確定特定的DNA序列在染色體上的位置。11原理：利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。操作流程：以經(jīng)過(guò)標(biāo)記的已知核酸分子為探針。以細(xì)胞內(nèi)與探針序列互補(bǔ)的特異核酸分子為靶分子。在一定條件下使探針與靶核酸分子在原位發(fā)生雜交。再對(duì)其探測(cè)。1213146.1.4基因定點(diǎn)突變技術(shù)通過(guò)改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來(lái)改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個(gè)(些)氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響?；蚨c(diǎn)突變也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變指用含有突變堿基的寡聚核苷酸片斷作為引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA分子進(jìn)行復(fù)制。目前，在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法。151)寡核苷酸定點(diǎn)突變?cè)恚汉铣梢欢喂丫勖撗鹾颂呛塑账嶙鳛橐?，其中含有需要改變的堿基，使其與帶有目的基因的單鏈DNA配對(duì)。合成的寡聚核苷酸引物除短的錯(cuò)配區(qū)外，與目的基因完全互補(bǔ)。用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成單鏈DNA的復(fù)制。由此產(chǎn)生的雙鏈DNA，一條鏈為野生型親代鏈，另一條為突變型子鏈。將獲得的雙鏈分子通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并篩選出突變體，其中基因已被定向修改。16操作流程：合成一段含有需要改變堿基的寡聚核苷酸引物。構(gòu)建含靶序列的單鏈重組M13DNA。用DNA聚合酶延伸誘變寡核苷酸引物，形成雜合雙鏈M13DNA。轉(zhuǎn)染大腸桿菌，篩選攜帶突變體克隆的M13噬菌斑。純化突變體，序列序列分析驗(yàn)證。172)重疊延伸PCR誘變法原理：對(duì)于兩個(gè)具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性后，兩個(gè)DNA片段之間通過(guò)同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈。操作流程：將DNA模板分別與引物對(duì)1和引物對(duì)2退火。通過(guò)PCR1和PCR2擴(kuò)增出兩種靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重疊區(qū)發(fā)生退火。用DNA聚合酶補(bǔ)平缺口，形成長(zhǎng)鏈DNA，PCR3擴(kuò)增。用引物F2和R2擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)的全長(zhǎng)DNA片段。18193)大引物PCR誘變法首先用正向突變引物(M)和反向引物(R1)擴(kuò)增模板DNA產(chǎn)生雙鏈大引物(PCR1)。將雙鏈大引物(PCR1)與野生型DNA分子混合后退火并使之復(fù)性。第二輪PCR中加入正向引物(F2)，與PCR1中的互補(bǔ)鏈配對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈DNA。由于F2的退火溫度顯著高于M和R1，可忽略引物M和R1在本輪反應(yīng)中所造成的干擾。獲得定點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行DNA序列分析以驗(yàn)證突變位點(diǎn)。2021PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法的優(yōu)勢(shì)：突變體回收率高；能用雙鏈DNA作為模板，可在任何位點(diǎn)引入突變；可在同一試管中完成所有反應(yīng)；快速簡(jiǎn)便；PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法已成為定點(diǎn)突變的主要技術(shù)。226.2基因敲除技術(shù)經(jīng)典遺傳學(xué)是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列?，F(xiàn)代遺傳學(xué)(反向遺傳學(xué))首先從基因序列出發(fā)，推測(cè)其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能?；蚯贸址Q基因打靶，通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。6.2.1基本原理23基因敲除為完全基因敲除和條件型基因敲除。完全基因敲除指通過(guò)同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性。條件型基因敲除指通過(guò)定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)，酵母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)。Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。241)完全基因敲除采用取代型或插入型載體在胚胎干細(xì)胞中根據(jù)正-負(fù)篩選原理進(jìn)行完全基因敲除。正向選擇基因neo(新霉素抗性基因)通常被插入載體靶DNA功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過(guò)同源重組法置換靶基因的功能區(qū)。負(fù)向選擇基因HSV-tk(單純皰疹病毒胸苷激酶基因)則被置于目的片段外側(cè)，含有該基因的重組細(xì)胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。如果細(xì)胞中發(fā)生了隨機(jī)重組，負(fù)向選擇基因就可能被整合到基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用分子篩選技術(shù)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，確定是否敲除了目的基因。25262)條件型基因敲除構(gòu)建條件型基因敲除打靶載體，將正向選擇標(biāo)記neo置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域兩側(cè)內(nèi)含子中插入同向LoxP位點(diǎn)。需要消除靶基因活性時(shí)，與帶有Cre重組酶基因的ES細(xì)胞雜交，Cre可把兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的DNA片段切除，導(dǎo)致靶基因失活。Cre重組酶是細(xì)菌噬菌體P1的I型拓?fù)洚悩?gòu)酶，催化LoxP位點(diǎn)間的DNA進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組。

也可用Cre表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶ES細(xì)胞，通過(guò)重組將兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的neo抗性基因刪除。27286.2.2高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對(duì)大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。29306.2.3植物基因敲除技術(shù)T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報(bào)告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”。在該基因內(nèi)部或附近插入了一段已知序列的DNA，可設(shè)計(jì)引物將被破壞了的靶序列PCR擴(kuò)增出來(lái)。將靶基因兩端的引物L(fēng)P、RP及插入載體上的引物L(fēng)B在同一體系PCR擴(kuò)增，可得3種類型的條帶。31326.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)酵母單雜交系統(tǒng)是上世紀(jì)90年代中發(fā)展起來(lái)的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)。該技術(shù)可識(shí)別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過(guò)篩選DNA文庫(kù)直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子(Pmin)的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)33將編碼待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。34356.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)特征，這些蛋白往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。BD能與特定基因啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄，由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。先用基因重組技術(shù)將編碼已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(GAL1、GAL4)DNABD編碼區(qū)的表達(dá)載體上。36導(dǎo)入酵母細(xì)胞中使之表達(dá)帶有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合蛋白，與報(bào)告基因上游的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)相結(jié)合，將作為“誘餌”捕獲與已知蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。再將已知編碼AD的DNA分別與待篩選的cDNA文庫(kù)中不同插入片段相連，獲得“獵物”載體，轉(zhuǎn)化含有“誘餌”的酵母菌。如果酵母細(xì)胞表達(dá)的“誘餌”蛋白與“獵物”載體表達(dá)的某個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生作用，不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的AD和BD就會(huì)靠攏，激活報(bào)告基因表達(dá)。分離有報(bào)告基因活性的酵母菌，得到所需的“獵物”載體，就能得到與已知蛋白質(zhì)作用的新基因。37386.3.3蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米級(jí)厚度的金屬膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。1)等離子表面共振技術(shù)(SPR)共振角度的改變與該處蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系。由此可檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。392)免疫共沉淀技術(shù)(CoIP)將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上。再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應(yīng)體系中。用低離心力沉淀或微膜過(guò)濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。403)GST及GAD融合蛋白沉降技術(shù)GST融合蛋白是將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)與目標(biāo)蛋白做成融合蛋白的方式在外源表達(dá)。利用GST對(duì)谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。GST沉降應(yīng)用于確定探針蛋白與未知蛋白以及探針蛋白與已知蛋白間的相互作用。41GAD融合蛋白是由酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Gal4)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(GAD)與植物色素相互作用因子(PIF3)構(gòu)成。將GAD與PIF3的不同區(qū)段相接成為誘餌，研究該重組蛋白在體外與光敏素B(phyB)與缺失N-37位氨基酸的突變體或光敏素(phyA)的相互作用。光敏素B能與PIF3發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，超過(guò)30%的phyB被PIF3沉淀下來(lái)。缺失N-37位氨基酸的phyB突變體及phyA只能與PIF3發(fā)生較弱的作用，約5%的phyA或約10%的N-37位氨基酸缺失突變的phyB被沉淀下來(lái)。424)熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)FRET用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用研究。FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個(gè)基本條件：給體與受體在合適的距離(1~10nm)；給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊(這是能量匹配的條件)；給體與受體的偶極具有一定的空間取向(這是偶極-偶極耦合作用的條件)。FRET需要有兩個(gè)探針，即熒光給體和熒光受體，要求給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊，而與受體的發(fā)射光譜盡量沒(méi)有重疊。不同蛋白的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)不同，可根據(jù)需要組成不同的探針對(duì)。43常用的探針有3類：熒光蛋白一類能發(fā)射熒光的天然蛋白及其突變體。常見(jiàn)的有綠色(GFP)、藍(lán)色(BFP)、青色(CFP)和黃色(YFP)熒光蛋白等。有機(jī)染料具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機(jī)化合物組成的染料對(duì)。包括熒光素、羅丹明類化合物和青色染料Cy3、Cy5等。鑭系染料(金屬染料)一般與有機(jī)染料聯(lián)用，分別作為FRET的給體或受體，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和信噪比。446.3.4染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)

ChIP是一種在體內(nèi)研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。ChIP流程(見(jiàn)P226圖6-30)：

在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。超聲或酶切處理將其隨機(jī)切成染色質(zhì)小片段。通過(guò)抗原抗體的特異識(shí)別反應(yīng)，沉淀該復(fù)合物。富集與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段。對(duì)目的DNA片段進(jìn)行純化和PCR檢測(cè)。456.3.5RNA干涉技術(shù)及其應(yīng)用RNA干涉(RNAi)技術(shù)是利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA(ssRNA)的降解。經(jīng)過(guò)Dicer(一種具有RNAaseIII活性的核酸酶)的加工，細(xì)胞中較長(zhǎng)的雙鏈RNA(30個(gè)核苷酸以上)首先被降解形成21~25個(gè)核苷酸的小分子干擾核糖核酸(siRNA)，并有效地定位目標(biāo)mRNA。46siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中間媒介，它具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5端磷酸基團(tuán)和3端的羥基，其兩條鏈的3端各有兩個(gè)堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)的核蛋白體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，較長(zhǎng)的雙鏈RNA(dsRNA)會(huì)導(dǎo)致非特異性基因沉默，只有21~25個(gè)核苷酸的siRNA才能有效引發(fā)特異性基因沉默。非哺乳動(dòng)物可用較長(zhǎng)dsRNA直接誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi。47486.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析核酸雜交技術(shù)是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)?；蛐酒?DNAchip)，又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上。然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描。6.4.1基因芯片技術(shù)原理并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)進(jìn)行比較和檢測(cè)，而迅速得出所要的信息。496.4.2基因芯片的點(diǎn)制過(guò)程基因芯片的實(shí)質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列。制作簡(jiǎn)易基因芯片時(shí)，用機(jī)械臂把DNA片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過(guò)物理吸附作用達(dá)到固化。也可以直接在玻璃板表面進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)調(diào)控情況。1)簡(jiǎn)易基因芯片502)大規(guī)模基因芯片簡(jiǎn)易芯片一般基因數(shù)量少(一般不超過(guò)2000)，主要用于研究小部分特定基因的表達(dá)狀態(tài)。可用手工制作或者機(jī)械手點(diǎn)樣。大規(guī)?；蛐酒ǔＩ婕盎蚪M規(guī)模與數(shù)量大(一般大于10000個(gè)基因)，分別采用接觸式點(diǎn)樣，非接觸式點(diǎn)樣或者半導(dǎo)體技術(shù)制備樣品。基因芯片技術(shù)包括四個(gè)主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)、信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析。5152基因芯片的工作流程：經(jīng)大規(guī)模PCR擴(kuò)增獲得獨(dú)立cDNA片段。用機(jī)械手將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在合適的介質(zhì)上，變性、固定。從不同器官或組織中分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用不同的熒光染料標(biāo)記不同的cDNA樣本。將標(biāo)記后的cDNA與點(diǎn)好的芯片進(jìn)行雜交。激光掃描芯片雜交結(jié)果，計(jì)算機(jī)處理。分析芯片雜交數(shù)據(jù)。PCR擴(kuò)增靶基因標(biāo)記原位合成合成點(diǎn)樣芯片雜交雜交檢測(cè)數(shù)據(jù)分析實(shí)際應(yīng)用提出問(wèn)題芯片設(shè)計(jì)芯片制作試樣處理表達(dá)差異分析多態(tài)性分析再測(cè)序生物信息學(xué)數(shù)學(xué)優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化536.4.3基因芯片數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)可靠性分析：通過(guò)兩次平行雜交反應(yīng)，將每個(gè)基因在兩個(gè)反應(yīng)中的表達(dá)水平做成對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖，只要絕大多數(shù)基因的雜交結(jié)果都在45o斜線附近，就說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。用多個(gè)管家基因作為內(nèi)對(duì)照，管家基因的反應(yīng)信號(hào)在兩種組織中不變，可確定其他基因表達(dá)信號(hào)的相對(duì)值。生物學(xué)意義分析分析芯片雜交數(shù)據(jù)，研究差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義。將差異表達(dá)定位于不同的生物化學(xué)代謝途徑，研究基因芯片數(shù)據(jù)中可能具有生物學(xué)意義的代謝途徑。546.5利用酵母鑒定靶基因功能酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有與動(dòng)植物細(xì)胞相似的結(jié)構(gòu)特征。釀酒酵母有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞，是最早完成基因組DNA全序列測(cè)定的真核生物。導(dǎo)入酵母細(xì)胞中的DNA即能以自主復(fù)制的分子形式存在，也可被整合到基因組的方式存在。酵母中轉(zhuǎn)化DNA的整合重組主要通過(guò)同源重組方式進(jìn)行，整合效率較高。6.5.1酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡(jiǎn)介55酵母單倍體和二倍體的重大差異：二倍體細(xì)胞直徑大約是單倍體的1.3倍。二倍體細(xì)胞呈長(zhǎng)形或卵圓形，單倍體通常接近圓形。二倍體細(xì)胞按極性方向出芽，單倍體按軸線方向出芽。酵母細(xì)胞有三種交配型：?jiǎn)伪扼wMATa；MATα二倍體MATa/αMATa與MATα交配形成MATa/α。MATa/α不能與MATa或MATα交配。二倍體酵母細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下能通過(guò)減數(shù)分裂形成單倍體的孢子。從單個(gè)孢子來(lái)源的所有細(xì)胞都帶有一套相同的染色體DNA。56576.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與性狀互補(bǔ)利用整合型質(zhì)粒(Yip)可以對(duì)酵母基因組中的任意基因進(jìn)行精確的敲除(置換)。帶有致死位點(diǎn)和可能的外源功能互補(bǔ)基因的酵母二倍體細(xì)胞在饑餓條件下形成四分體孢子，通過(guò)四分體分析技術(shù)進(jìn)行觀測(cè)和研究。如果引入的外源基因具有互補(bǔ)突變點(diǎn)的功能，含有突變基因的單倍體可以存活，否則就不能存活。586.5.3外源基因在酵母中的功能鑒定將外源基因克隆于酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化野生型或突變酵母菌株，通過(guò)觀察酵母的表型變化或分析細(xì)胞中化學(xué)成分的變化即可推測(cè)該基因的生物學(xué)功能。酵母細(xì)胞中有與動(dòng)植物細(xì)胞接近的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，許多在大腸桿菌中不能產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)的動(dòng)植物基因在酵母中表達(dá)后往往具有生物學(xué)功能。596.6其他分子生物學(xué)技術(shù)凝膠滯緩(EMSA)技術(shù)是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。基本原理：在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比。如果DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，導(dǎo)致分子量增大，在凝膠中的遷移作用受到阻滯，在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了。6.6.1凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)60方法：同位素標(biāo)記待測(cè)的DNA片段細(xì)胞提取物DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物探針DNA溫育PAGE電泳放射自顯影進(jìn)行DNA凝膠分析616.6.2噬菌體展示技術(shù)噬菌體是細(xì)菌病毒的總稱。噬菌體可被分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體稱為烈性噬菌體。具有溶源周期的噬菌體稱為溫和噬菌體。基本原理：將編碼“誘餌”蛋白的DNA片段插入噬菌體基因組，與編碼噬菌體外殼蛋白的基因相融合。重組噬菌體侵染宿主細(xì)菌后，復(fù)制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接用于捕獲靶蛋白庫(kù)中與“誘餌”相互作用的蛋白質(zhì)。62噬菌體展示技術(shù)的基本流程：636.6.3蛋白質(zhì)磷酸化分析技術(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、周期調(diào)控、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮等都離不開(kāi)蛋白質(zhì)特異性磷酸化或去磷酸化。由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白質(zhì)可逆磷酸化過(guò)程，是生物體內(nèi)普遍而重要的調(diào)控方式，控制著眾多的生理生化反應(yīng)和生物學(xué)過(guò)程。蛋白激酶催化ATP或GTP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白的絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酰殘基上，使底物蛋白磷酸化。蛋白磷酸酯酶催化磷酸化的底物蛋白去磷酸化。6465蛋白質(zhì)磷酸化分析技術(shù)主要是對(duì)底物磷酸化和蛋白激酶活性進(jìn)行檢測(cè)。用雙向電泳及質(zhì)譜分析檢測(cè)底物蛋白磷酸化。細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶多達(dá)上千個(gè)，體內(nèi)檢測(cè)某個(gè)蛋白激酶活性非常困難。用體外激酶活性分析法檢測(cè)蛋白激酶的活性。體外激酶活性分析技術(shù)主要包括獲得底物蛋白和待測(cè)蛋白激酶，進(jìn)行蛋白質(zhì)體外磷酸化反應(yīng)。體外激酶活性分析法能可靠地鑒定某個(gè)蛋白激酶對(duì)底物的磷酸化作用，篩查激酶的特異性底物。66676.6.4蛋白質(zhì)免疫印跡與抗體制備印跡法(blotting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱Southern印跡法。后來(lái)對(duì)RNA的印跡分析稱Northern印跡法。對(duì)單向電泳后蛋白質(zhì)的印跡分析稱Western印跡法。對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)的印跡分析稱Eastern印跡法。1)蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblotting)68蛋白質(zhì)免疫印跡的基本原理：將通過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上。然后與能特異性識(shí)別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)。洗滌去除沒(méi)有結(jié)合的特異性抗體后。加入標(biāo)記的、能識(shí)別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段