實驗一特殊顯微鏡及其使用

實驗一特殊顯微鏡及其使用第一頁，共四十七頁，2022年，8月28日本實驗課共36學(xué)時，由12個實驗組成。第二頁，共四十七頁，2022年，8月28日實驗內(nèi)容1、特殊顯微鏡及其使用2、線粒體和葉綠體的分離3、巨噬細(xì)胞的吞噬實驗4、ACP、過氧化物酶等的顯示5、小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備6、動物細(xì)胞染色體分帶技術(shù)第三頁，共四十七頁，2022年，8月28日實驗要求永久制片

—實驗開始前細(xì)查張數(shù)及有無破損清點器械實驗報告實驗室衛(wèi)生節(jié)約規(guī)范第四頁，共四十七頁，2022年，8月28日實驗一特殊顯微鏡及流式細(xì)胞儀的使用第五頁，共四十七頁，2022年，8月28日1、口腔上皮細(xì)胞2、活細(xì)胞（細(xì)胞系）3、培養(yǎng)的紫菜或小新月菱形藻4、流式細(xì)胞儀的演示實驗所需的材料：實驗所需的試劑：香柏油、乙醚:酒精=7:3第六頁，共四十七頁，2022年，8月28日第七頁，共四十七頁，2022年，8月28日暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡第八頁，共四十七頁，2022年，8月28日實驗?zāi)康模赫莆瞻狄曇帮@微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀的原理、構(gòu)造及其使用方法。學(xué)習(xí)特殊顯微鏡操作的目的：

暗視野顯微鏡：看到運動的物體，利用目標(biāo)物體的輪廓與背景區(qū)分開

熒光顯微鏡：辨別含有熒光物質(zhì)所在的位置第九頁，共四十七頁，2022年，8月28日一、暗視野顯微鏡第十頁，共四十七頁，2022年，8月28日1.原理利用暗視野聚光器（或擋板）使入射光束的中央光束被阻擋．不能由下而上地通過標(biāo)本進(jìn)入物鏡，只能傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上。標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，物鏡接觸不到入射光源的光線，只能接觸標(biāo)本的反射和散射光。因而整個視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的，使在黑暗的背景上呈現(xiàn)出明亮的像。丁達(dá)爾現(xiàn)象斜向照明第十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.操作方法（P14）安裝暗視野聚光器（或擋板），放在普通顯微鏡的聚光器下方。加香柏油：把被檢樣品的標(biāo)本置于載物臺上，并在聚光器透鏡的上表面滴香柏油。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使香柏油與載玻片下表面緩緩接觸。加香柏油的原因，避免照明光線于聚光鏡上進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體。聚光器光軸的調(diào)中：用低倍鏡對樣品聚焦，隨之用聚光器升降螺旋上下緩慢調(diào)節(jié)聚光器位置，當(dāng)暗視野中清楚地窺見一光環(huán)或圓形光點時停止什降聚光器，用聚光器調(diào)中桿推動聚光器，把光環(huán)或光點調(diào)至視野中心；調(diào)節(jié)聚光器焦點，使之位于被檢樣品處，轉(zhuǎn)動聚光器升降螺旋，使視野中光環(huán)調(diào)成一最小的圓形光點，此刻聚光器的焦點恰好位于樣品處。第十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日注意事項物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑；制作標(biāo)本時所用的載玻片和蓋玻片均應(yīng)清潔無痕；必須使用薄玻片(載玻片厚度約0.8~1.1mm，蓋玻片厚度約0.1mm)，否則會影響暗視野集光器斜射光焦點的調(diào)節(jié)，如載玻片太厚，焦點只能落在載玻片內(nèi)，就不能看到物象；標(biāo)本也不能過厚。采用的光源宜強(qiáng)，一般均用強(qiáng)光燈照明。光線暗則物象不清晰。第十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日用途：1）利用樣品的散射光和反射光進(jìn)行觀察，只能看到物體的存在和運動，不能辯其細(xì)微結(jié)構(gòu)；2）可以看到許多細(xì)胞器的明亮輪廓，如細(xì)胞核，線粒體、液泡等第十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日3.實驗內(nèi)容、材料與儀器內(nèi)容：口腔上皮細(xì)胞的觀察材料：口腔上皮細(xì)胞試劑：蒸餾水器材和儀器：載玻片、蓋玻片、顯微鏡、牙簽第十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日二、相差顯微鏡1原理光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達(dá)到的位置)的不同。當(dāng)光通過物體時，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。第十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日相差：同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相差決定于光波所通過介質(zhì)的折射率之差及其厚度，等于折射率與厚度的乘積之差（光程差），介質(zhì)越厚或折射率越大，光波減速也越大。肉眼看不到的相差，利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，就可以看到。第十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：1）用環(huán)狀光闌代替可變光闌2）用相差物鏡(通常標(biāo)有PH的標(biāo)記)代替普通物鏡；3）帶有一個合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡CT:用于環(huán)狀光闌的環(huán)孔與相差物鏡相板共軛面的環(huán)孔（暗環(huán)）在光路中準(zhǔn)確合軸，使成像的相位差變?yōu)檎穹睿?）有綠色濾色片：用于消色，可吸收紅色和藍(lán)色光，只透過綠光，使波長范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果2結(jié)構(gòu)特點第十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日1.燈箱2.濾色片座3.相襯環(huán)桿4.相襯環(huán)調(diào)節(jié)螺釘5.目鏡6.三目頭7.手輪松緊張力圈8.粗動調(diào)焦手輪9.電源插頭10.電源插座11.微動調(diào)焦手輪12.物鏡13.載物臺14.聚光鏡調(diào)節(jié)螺釘15.聚光鏡托架16.孔徑光欄調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)環(huán)17.燈座調(diào)節(jié)螺釘?shù)谑彭摚菜氖唔摚?022年，8月28日18.視場光欄調(diào)節(jié)手柄19.聚光鏡固緊螺釘

20.聚光鏡升降手輪

21.移動工作臺

22.縱向移動手輪23.橫向移動手輪24.電源開關(guān)25.亮度調(diào)節(jié)旋鈕26.移動機(jī)構(gòu)固緊螺釘27.升降限位固緊手柄28.鏡筒固緊螺釘29.觀察攝像拉桿30.集光鏡調(diào)節(jié)手柄31.聚光鏡刻度處第二十頁，共四十七頁，2022年，8月28日3使用方法：倒置相差顯微鏡（科技樓516室）的使用方法：先打開電源開關(guān)，再打開汞燈，然后光圈對準(zhǔn)最右邊的Ph模式（相差模式，其它數(shù)字表示明場），此時表示Ph模式下，光圈最大，再轉(zhuǎn)動下面的轉(zhuǎn)盤，選擇Ph0，表示放大5倍，底下物鏡相應(yīng)用5倍目鏡；選擇Ph1，表示放大10倍或20倍，底下物鏡相應(yīng)用10倍或20倍；選擇Ph2，表示放大40倍，底下用最大的40倍物鏡。拍照時，將右邊的拉桿拉出。雙擊電腦上的軟件圖標(biāo)，選擇Preview按鈕，選擇set可以拍照，選擇Autoset按鈕可以電腦自動調(diào)整照片亮度。然后點擊保存圖標(biāo)，保存在電腦上。第二十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日4用途：

用于觀察組織培養(yǎng)中活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)或未染色標(biāo)本。5、標(biāo)本

活細(xì)胞

第二十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的可見熒光，再通過物鏡和目鏡的成像、放大，以供檢視和拍攝。1、原理三、熒光顯微鏡第二十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日當(dāng)一個物體吸收了紫外光或者短波光的能量，它能發(fā)射出比原來吸收的波長更長的光。這種波長長于激發(fā)光的可見光稱為“熒光”。熒光顯微鏡具特殊光源，提供足夠強(qiáng)度和波長的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。第二十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日自發(fā)熒光（不加染色）：有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光），但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。二次熒光（用化學(xué)染色）：非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、碳水化合物）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進(jìn)行觀察。對特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細(xì)胞區(qū)別出來而可以觀察到。抗體熒光技術(shù)（用免疫染色）：利用特定的抗原必然和特定的抗體相結(jié)合這一個事實，有意識地使帶熒光標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗原進(jìn)行抗原/抗體反應(yīng)，這樣兩者的結(jié)合體就能通過抗體的熒光觀察到。熒光染色分類：第二十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日第二十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日普通光學(xué)顯微鏡加附件：

1)熒光光源

2)激發(fā)濾片

3)雙色束分離器

4)阻斷濾片等的基礎(chǔ)上組成的。2、熒光顯微鏡的基本裝置及其光路2.1基本裝置第二十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)造（反射式）第二十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日

2.2、光源：采用高壓汞燈。由于熒光和激發(fā)光相比，是非常微弱的，因此熒光顯微鏡的光源強(qiáng)度必須很高，即使在近紫外區(qū)，也必須有足夠的強(qiáng)度。為了滿足這些要求，通常采用高壓汞燈。使用中嚴(yán)禁頻繁啟閉，點亮后欲暫停使用時，不可切斷電源，可用光閥阻斷光路。

第二十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日激發(fā)濾色鏡(exciterfilter)為被檢樣品的熒光燃料提供最佳波段的激發(fā)光。加放于汞燈和二向色鏡之間，物鏡之前。2.3、濾色鏡系統(tǒng)幾種主要的激發(fā)濾色鏡第三十頁，共四十七頁，2022年，8月28日阻斷濾光鏡(barrierfilter)：

位于物鏡之上，二向色鏡與目鏡之間，用以阻斷或吸收沒有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光，以防傷害眼睛，使熒光透過。在熒光中也僅有部分波長被選擇透過。選用的原則，以能完全阻斷或吸收波長長于所需熒光的光線，并透過樣品發(fā)出的熒光。第三十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日2.4、熒光顯微鏡的光路因熒光激發(fā)的方式不同，分為：透射熒光顯微術(shù)光路反射熒光顯微術(shù)光路第三十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日透射熒光顯微鏡光路圖第三十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日反射熒光顯微鏡光路圖汞燈激發(fā)濾鏡集光鏡目鏡阻斷濾鏡二向色鏡物鏡樣品第三十四頁，共四十七頁，2022年，8月28日

3、熒光顯微鏡的分類：

3.1.透射熒光顯微鏡：

光源：高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>

聚光鏡：使用暗場聚光鏡，使激發(fā)光和熒光分離出來。

物鏡：可用任何種類的物鏡。標(biāo)本：因為是透射觀察，薄的標(biāo)本比較適合。

第三十五頁，共四十七頁，2022年，8月28日缺點：

必須正確調(diào)整聚光鏡中心和高度，否則不能獲得明亮的熒光像。

由于暗視場聚光鏡焦距限制，不能使用厚的載玻片。

視場照明區(qū)不能過大，否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰褪。

厚的或不透明的標(biāo)本不適用。

優(yōu)點：

由于用了暗場聚光鏡，激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。

由于上述同樣的原因，任何物鏡都可用于觀察。

用低倍物鏡時，比反射熒光顯微鏡更亮。

第三十六頁，共四十七頁，2022年，8月28日3.2.反射熒光顯微鏡：

光源：高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>

聚光鏡：因為物鏡作為聚光鏡，所以不需要聚光鏡。物鏡：所用的物鏡必須能透過足夠的紫外光，而且本身不產(chǎn)生熒光，對數(shù)值孔徑?jīng)]有限制。標(biāo)本：厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀察。

第三十七頁，共四十七頁，2022年，8月28日優(yōu)點：

由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調(diào)節(jié)。

采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場光闌的效果。

物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大被率時，也可以獲得高分辨率的像。

厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。

其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合。

可以避免不必要的熒光色衰褪現(xiàn)象。

第三十八頁，共四十七頁，2022年，8月28日1）打開燈源開關(guān)（汞燈及普通燈光源），超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點。2）反射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。3）放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；4）高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。5）先在普通光源下（數(shù)字調(diào)為1）用10倍物鏡調(diào)整好玻片的焦距，后轉(zhuǎn)至40倍物鏡。材料目標(biāo)與焦距調(diào)好后，關(guān)閉普通光源的電源（或用載物臺下面的擋板將來自下面的普通光源擋?。?，數(shù)字調(diào)至2-4，其中2為紅色激發(fā)光，3為藍(lán)色激發(fā)光，4為綠色激發(fā)光，藍(lán)色激發(fā)光波長最短，一般應(yīng)用藍(lán)色3，即可看到熒光照片。熒光顯微鏡主機(jī)的上部分右側(cè)分別有調(diào)整熒光光圈、光強(qiáng)的拉桿及照相拉桿。4、使用方法（反射熒光顯微鏡）第三十九頁，共四十七頁，2022年，8月28日5、用途

1)觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)胞和結(jié)構(gòu)

2)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。3)細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA含量測定。

4)熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗），用該標(biāo)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測該抗原的存在與分布。第四十頁，共四十七頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）

第四十一頁，共四十七頁，2022年，8月28日第四十二頁，共四十七頁，2022年，8月28日內(nèi)容：熒光顯微鏡下觀察單細(xì)胞藻類材料：小新月菱形藻儀器：載玻片、蓋玻片、熒光顯微鏡6、

實驗內(nèi)容、材料與儀器第四十三頁，共四十七頁，2022年，8月28日1、FCM的結(jié)構(gòu)可分為5部分：①流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；②激光光源及光速形成系統(tǒng)；③光學(xué)系統(tǒng)；④信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)；⑤細(xì)胞分選系統(tǒng)。2、FCM的工作原理：

1）將待測細(xì)胞染色后，制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓人流動室，同時，不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。四、流式細(xì)胞儀(