實驗二血紅蛋白測定白細(xì)胞計數(shù)實驗

實驗二血紅蛋白測定白細(xì)胞計數(shù)實驗第一頁，共二十三頁，2022年，8月28日實驗二血紅蛋白測定和白細(xì)胞計數(shù)【目的要求】教學(xué)目的：通過實驗使學(xué)生鞏固血液學(xué)常見檢測項目（主要是血紅蛋白、白細(xì)胞計數(shù)）的檢測方法和原理。教學(xué)要求：1.掌握血紅蛋白、白細(xì)胞計數(shù)的檢測原理；2.熟悉血紅蛋白、白細(xì)胞計數(shù)的檢測方法；3.了解血紅蛋白、白細(xì)胞計數(shù)檢測的注意事項。第二頁，共二十三頁，2022年，8月28日實驗內(nèi)容一血紅蛋白測定【原理】在血紅蛋白轉(zhuǎn)化液中，除硫化血紅蛋白外，其余血紅蛋白均可被高鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白，再與氰離子（CN-）結(jié)合，生成穩(wěn)定的復(fù)合物氰化高鐵血紅蛋白（hemoglobincyanide，HiCN）。棕紅色的氰化高鐵血紅蛋白在波長540nm處有吸收峰，可用校準(zhǔn)的高精度分光光度計進(jìn)行直接測定，或用HiCN參考液進(jìn)行比色法測定，根據(jù)標(biāo)本的吸光度即可求出血紅蛋白濃度。第三頁，共二十三頁，2022年，8月28日【材料】1．器材：采血針、試管、刻度吸管、微量吸管、吸頭、分光光度計。

2．試劑：氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)轉(zhuǎn)化液（文齊液）第四頁，共二十三頁，2022年，8月28日【實驗方法】（1）取血20μl，加入5ml轉(zhuǎn)化液中充分混勻，靜置5min。（2）分光光度計，波長540nm處，光徑（比色杯內(nèi)徑）1.0厘米，HiCN轉(zhuǎn)化液或蒸餾水調(diào)零，測定吸光度（A）。（3）計算：Hb（g／L）＝測定管吸光度×64458／44000×251＝測定管吸光度×367.7。

注：式中：64458是國際公認(rèn)的血紅蛋白分子量，64458mg/L即為1mmol/L血紅蛋白的物質(zhì)濃度，除以1000換算為g/L。

44是1mmol/L血紅蛋白在1.00cm光徑，540nm條件下的吸光系數(shù)。251是稀釋倍數(shù)。實驗內(nèi)容第五頁，共二十三頁，2022年，8月28日實驗內(nèi)容分光光度計使用：

1．打開722分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預(yù)熱。以722型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：2．將波長旋至測定的波長。第六頁，共二十三頁，2022年，8月28日第七頁，共二十三頁，2022年，8月28日第八頁，共二十三頁，2022年，8月28日3．將空白液、校準(zhǔn)液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。

第九頁，共二十三頁，2022年，8月28日4．將開關(guān)置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T為0.0，關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)T為100.0。

第十頁，共二十三頁，2022年，8月28日第十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日第十二頁，共二十三頁，2022年，8月28日5．將開關(guān)置于A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A為0.0。6．將校準(zhǔn)液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A）。第十三頁，共二十三頁，2022年，8月28日實驗內(nèi)容二白細(xì)胞測定【原理】用白細(xì)胞稀釋液將血液稀釋一定的倍數(shù)，同時破壞溶解紅細(xì)胞。將稀釋的血液注入血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下計數(shù)一定體積內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)，經(jīng)換算即可求出每升血液中的白細(xì)胞數(shù)量。第十四頁，共二十三頁，2022年，8月28日【材料】1．器材（1）采血針、微量吸管、吸頭、試管、5ml吸管（2）普通光學(xué)顯微鏡（3）計數(shù)板、蓋玻片（專用）改良Neubauer計數(shù)板，有兩個計數(shù)池。每個計數(shù)池分為九個大方格。每個大方格的邊長為1mm，高度為0.1mm，面積為1mm2,容積為0.1mm3。四角的每個大方格被分為16個中方格；中央大方格被分為25個中方格，而每個中方格又被分為16個小方格。第十五頁，共二十三頁，2022年，8月28日Whitecellcount(WBC)coverslip

Theareaofcountingis1mm2andthedepthofitis0.1mm,sothevolumeis0.1ul.(1mm3=1uL)CountingChamber’sstructure0.1mmdeep第十六頁，共二十三頁，2022年，8月28日第十七頁，共二十三頁，2022年，8月28日Whitecellcount(WBC)CountingareaCountingruler1mm1mm第十八頁，共二十三頁，2022年，8月28日2．試劑白細(xì)胞稀釋液：冰乙酸2.0ml10g/L亞甲藍(lán)數(shù)滴蒸餾水加至100ml第十九頁，共二十三頁，2022年，8月28日【實驗方法】1、加白細(xì)胞稀釋液0.38ml于一小試管中。2、用微量吸管吸取20ul血液。擦去微量吸管外余血，將其插入稀釋液底部，輕輕將血放出，并吸取上清液洗滌微量吸管3次（注意每次不能沖渾稀釋液），混勻。3、用微量吸管或玻璃棒取混勻的細(xì)胞懸液1滴，充入計數(shù)池與蓋片的縫隙中，靜置2-3min，使白細(xì)胞下沉。4、低倍鏡計數(shù)四角4個大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)，數(shù)細(xì)胞規(guī)則“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”。第二十頁，共二十三頁，2022年，8月28日5、計算白細(xì)胞/L=N/4×10×20×106/L=N×0.05×109/L式中：N為4個大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)

÷4為1大方格（即0.1ul）內(nèi)白細(xì)胞記數(shù)

×101個大方格的容積為0.1ul，換算成1ul×20血液的稀釋倍數(shù)

×106

將ul換算成L第二十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日注意事項：

1計數(shù)池內(nèi)細(xì)胞分布每大方格數(shù)不能超過四大格均值的+10%，白細(xì)胞數(shù)小于3×109/L時要擴(kuò)大計數(shù)區(qū)域或重新加倍取血計數(shù)；白細(xì)胞大于15×109/L時，要增加稀釋倍數(shù)，重新計數(shù)。

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