實驗六質(zhì)粒提取及瓊脂糖凝膠電泳

實驗六質(zhì)粒提取及瓊脂糖凝膠電泳第一頁，共三十頁，2022年，8月28日DNA重組：指不同來源的DNA片段共價連接，通過重新組合，構(gòu)成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新的重組體DNA。DNA體外重組技術(shù)：是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并篩選出表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、擴(kuò)增、成為克隆，這一過程稱為DNA體外重組技術(shù)。DNA體外重組技術(shù)是基因工程的核心內(nèi)容。第二頁，共三十頁，2022年，8月28日基因克隆簡介

目的基因

載體

酶切，連接

重組基因

轉(zhuǎn)入

受體細(xì)胞篩選陽性克隆

分切、接轉(zhuǎn)篩第三頁，共三十頁，2022年，8月28日第四頁，共三十頁，2022年，8月28日分子生物學(xué)實驗流程圖第一次第二次第三次第五頁，共三十頁，2022年，8月28日載體：可容忍外源性DNA片段插入，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移并能在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有的特性：能在宿主細(xì)胞中獨立復(fù)制，并能攜帶DNA片段一同擴(kuò)增具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點,即多克隆位點(MCS,multiplecloningsites)，便于進(jìn)行克隆分子量小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制易于導(dǎo)入受體細(xì)胞具有容易操作的檢測表型。如抗生素抗性、α-互補顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子，前導(dǎo)序列，增強(qiáng)子等調(diào)控元件生物安全性好第六頁，共三十頁，2022年，8月28日載體種類：

質(zhì)粒噬菌體載體酵母人工染色體（YAC）病毒載體常用的克隆載體第七頁，共三十頁，2022年，8月28日質(zhì)粒1.定義：質(zhì)粒是獨立存在于細(xì)菌染色體外的，能獨立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子?？少x予宿主細(xì)胞一定生物學(xué)性狀，如：抗生素抗性Ampr等。第八頁，共三十頁，2022年，8月28日2．來源存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。3．分類質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒①嚴(yán)緊型質(zhì)粒(Stringentcontrol)嚴(yán)緊型質(zhì)粒只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時,它也不能復(fù)制,通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒,如F因子。②松弛型質(zhì)粒(Relaxedcontrol)松弛型質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制,在每個細(xì)胞中有許多拷貝,一般在20個以上,如Col質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。第九頁，共三十頁，2022年，8月28日4.質(zhì)粒的構(gòu)型（1）.超螺旋DNA（supercoiledDNA,scDNA）超螺旋第十頁，共三十頁，2022年，8月28日（2）.開環(huán)DNA(opencircleDNA,ocDNA)開環(huán)DNA第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日（3）.線形DNA（linearcircleDNA，lcDNA)第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日與本實驗有關(guān)的兩種質(zhì)粒1.PBR322(作為目的基因供體)4363bp第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日2.PUC18(作為載體）第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日實驗質(zhì)粒DNA提取第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日

實驗?zāi)康?.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法。2.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作技術(shù)。第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日堿裂解法提取質(zhì)粒原理堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA的分子大小和結(jié)構(gòu)不同利用二者之間變性和復(fù)性的差異來實現(xiàn)分離的。第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日強(qiáng)堿及機(jī)械剪切力①染色體DNA斷裂成小片段線性DNA（機(jī)械剪切力)②染色體氫鍵斷裂，雙鏈解離變性（強(qiáng)堿）；①質(zhì)粒DNA保持閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并未完全分離（強(qiáng)堿）。酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳分離DNA原理第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日帶電顆粒在電場中泳動的速度由于電場力的作用，使帶電顆粒在電場中向一定方向泳動；此顆粒在泳動過程中還受到一個相反方向的摩擦力(f·υ)阻擋；當(dāng)這兩種力相等時，顆粒則以均勻速度(υ)向前泳動第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日式中f為摩擦系數(shù)。根據(jù)Stoke公式，阻力大小取決于帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質(zhì)的黏度，即式中f——阻力，牛頓；r——粒子半徑，米；

η——介質(zhì)粘度，牛頓·秒/米2；第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日從公式看出，帶電顆粒在電場中泳動的速度與電場強(qiáng)度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比

第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位強(qiáng)度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。d為帶電顆粒泳動的距離(cm)；l

為支持物的有效長度(cm)；t為通電時間(秒)；V為加在支持物兩端的實際電壓(V)

單位是cm2·sec-1·V-1第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日實驗步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm×30S重復(fù)一次，最后一次將EP管放在吸水紙上扣干除去上清，加入冰的100μl溶液I，劇烈振蕩EP管

以下動作要輕柔

加入200μl溶液II，溫和顛倒數(shù)次，室溫放置3min

加入150μl冰溶液III，溫和顛倒2-3次，冰浴5min，12000rpm×10min轉(zhuǎn)移上清到新EP管（統(tǒng)一吸400μl

）加入等體積氯仿，溫和混勻，12000rpm×2min

上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管（統(tǒng)一吸300μl

）加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置5min，12000rpm5min

棄上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000rpm×2min

去上清，管平放室溫靜置20-30min，40μlTE溶解DNA

第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1%凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（取質(zhì)粒DNA樣品液10μl+2μl上樣緩沖液，輕輕混勻，避免氣泡）電泳（100V0.5小時，5V/cm）檢測（紫外燈下檢測）第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日主要試劑及作用1.solutionⅠ：①蔗糖：增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒.(保護(hù)作用)②EDTA：絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子,防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用）③Tris?HCl

：能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日2.solutionII：①SDS的作用裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）0.2mol/LNaOH1%SDS臨用前新鮮配制.第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日3.solutionIII：①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使質(zhì)粒DNA復(fù)性。②KAC會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的染色體DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與