實驗六質粒提取及瓊脂糖凝膠電泳

實驗六質粒提取及瓊脂糖凝膠電泳第一頁，共三十頁，2022年，8月28日DNA重組：指不同來源的DNA片段共價連接，通過重新組合，構成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新的重組體DNA。DNA體外重組技術：是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組子轉入受體細胞，并篩選出表達重組DNA的活細胞，加以純化、擴增、成為克隆，這一過程稱為DNA體外重組技術。DNA體外重組技術是基因工程的核心內(nèi)容。第二頁，共三十頁，2022年，8月28日基因克隆簡介

目的基因

載體

酶切，連接

重組基因

轉入

受體細胞篩選陽性克隆

分切、接轉篩第三頁，共三十頁，2022年，8月28日第四頁，共三十頁，2022年，8月28日分子生物學實驗流程圖第一次第二次第三次第五頁，共三十頁，2022年，8月28日載體：可容忍外源性DNA片段插入，可在細胞間轉移并能在細胞內(nèi)自主復制的DNA分子。理想的質?？寺≥d體應具有的特性：能在宿主細胞中獨立復制，并能攜帶DNA片段一同擴增具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點,即多克隆位點(MCS,multiplecloningsites)，便于進行克隆分子量小，可插入較大的外源DNA而不影響復制易于導入受體細胞具有容易操作的檢測表型。如抗生素抗性、α-互補顯色反應（藍白斑篩選）表達型載體應配備與宿主細胞相適應的啟動子，前導序列，增強子等調控元件生物安全性好第六頁，共三十頁，2022年，8月28日載體種類：

質粒噬菌體載體酵母人工染色體（YAC）病毒載體常用的克隆載體第七頁，共三十頁，2022年，8月28日質粒1.定義：質粒是獨立存在于細菌染色體外的，能獨立復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子?？少x予宿主細胞一定生物學性狀，如：抗生素抗性Ampr等。第八頁，共三十頁，2022年，8月28日2．來源存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。3．分類質粒按復制方式分為兩種類型：松弛型質粒和嚴緊型質粒①嚴緊型質粒(Stringentcontrol)嚴緊型質粒只在細胞周期的一定階段進行復制,當染色體不復制時,它也不能復制,通常每個細胞內(nèi)只含有1個或幾個質粒,如F因子。②松弛型質粒(Relaxedcontrol)松弛型質粒在整個細胞周期中隨時可以復制,在每個細胞中有許多拷貝,一般在20個以上,如Col質粒。松弛型質粒的復制不需要質粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質合成受抑制，質粒的復制依然進行。當抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素等抗生素存在時，質粒的拷貝數(shù)可達2000-3000拷貝。第九頁，共三十頁，2022年，8月28日4.質粒的構型（1）.超螺旋DNA（supercoiledDNA,scDNA）超螺旋第十頁，共三十頁，2022年，8月28日（2）.開環(huán)DNA(opencircleDNA,ocDNA)開環(huán)DNA第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日（3）.線形DNA（linearcircleDNA，lcDNA)第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日與本實驗有關的兩種質粒1.PBR322(作為目的基因供體)4363bp第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日2.PUC18(作為載體）第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日實驗質粒DNA提取第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日

實驗目的1.掌握堿裂解法提取質粒的原理和方法。2.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作技術。第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日堿裂解法提取質粒原理堿裂解法提取質粒DNA的原理是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA與線性染色體DNA的分子大小和結構不同利用二者之間變性和復性的差異來實現(xiàn)分離的。第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日強堿及機械剪切力①染色體DNA斷裂成小片段線性DNA（機械剪切力)②染色體氫鍵斷裂，雙鏈解離變性（強堿）；①質粒DNA保持閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并未完全分離（強堿）。酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質以及細胞碎片凝聚成網(wǎng)絡狀大分子不溶性沉淀物質粒DNA又恢復天然構型，溶解在上清液中第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳分離DNA原理第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日帶電顆粒在電場中泳動的速度由于電場力的作用，使帶電顆粒在電場中向一定方向泳動；此顆粒在泳動過程中還受到一個相反方向的摩擦力(f·υ)阻擋；當這兩種力相等時，顆粒則以均勻速度(υ)向前泳動第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日式中f為摩擦系數(shù)。根據(jù)Stoke公式，阻力大小取決于帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質的黏度，即式中f——阻力，牛頓；r——粒子半徑，米；

η——介質粘度，牛頓·秒/米2；第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日從公式看出，帶電顆粒在電場中泳動的速度與電場強度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質黏度成反比

第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位強度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。d為帶電顆粒泳動的距離(cm)；l

為支持物的有效長度(cm)；t為通電時間(秒)；V為加在支持物兩端的實際電壓(V)

單位是cm2·sec-1·V-1第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日實驗步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm×30S重復一次，最后一次將EP管放在吸水紙上扣干除去上清，加入冰的100μl溶液I，劇烈振蕩EP管

以下動作要輕柔

加入200μl溶液II，溫和顛倒數(shù)次，室溫放置3min

加入150μl冰溶液III，溫和顛倒2-3次，冰浴5min，12000rpm×10min轉移上清到新EP管（統(tǒng)一吸400μl

）加入等體積氯仿，溫和混勻，12000rpm×2min

上層水相轉移到新EP管（統(tǒng)一吸300μl

）加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置5min，12000rpm5min

棄上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000rpm×2min

去上清，管平放室溫靜置20-30min，40μlTE溶解DNA

第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1%凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（取質粒DNA樣品液10μl+2μl上樣緩沖液，輕輕混勻，避免氣泡）電泳（100V0.5小時，5V/cm）檢測（紫外燈下檢測）第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日主要試劑及作用1.solutionⅠ：①蔗糖：增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質粒.(保護作用)②EDTA：絡合掉鎂等二價金屬離子,防止DNA酶對質粒分子的降解作用。（保護作用）③Tris?HCl

：能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日2.solutionII：①SDS的作用裂解細胞和蛋白質變性作用②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）0.2mol/LNaOH1%SDS臨用前新鮮配制.第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日3.solutionIII：①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使質粒DNA復性。②KAC會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質形成沉淀而除去；溶液中的染色體DNA也會與蛋白質-SDS復合物纏繞成大分子而與