實(shí)驗(yàn)四的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)四的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日

1.掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作2.了解血紅蛋白的組成及分類一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（ExperimentalObjectives）第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日電泳：指帶電膠體粒子或分子在電場的作用下，作定向移動。由于各種物質(zhì)的等電點(diǎn)不同，在同一PＨ環(huán)境中解離后所帶電荷性質(zhì)及電量多少也各不相同,再由于其分子量、結(jié)構(gòu)、形狀大小各有差異，因此在同一電場中泳動速度也不一樣。一般來說，所帶電荷多、分子量小、形狀越接近球形者，泳動速度快，反之則慢。第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日電泳技術(shù)的分類：主要?dú)w納為；

1）顯微電泳——即在顯微鏡下觀察膠體粒子或細(xì)胞的移動度，也稱細(xì)胞電泳。2）自由電泳——即懸浮在介質(zhì)中的細(xì)胞和生物大分子，在電場作用下自由定向移動。第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日3）區(qū)域電泳（區(qū)帶電泳）：即在不同電力條件、支持物上進(jìn)行直接分離，鑒定生物物質(zhì)，促使獲得各自電荷差異的生物粒子形成各自區(qū)域以帯形停留在載體上。如：濾紙、淀粉、瓊脂、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等，此類電泳技術(shù)分離技巧簡便，運(yùn)用十分廣泛。

4）免疫電泳：即抗原與抗體在比例合適的瓊脂糖載體中相結(jié)合的一種電免疫技術(shù)，親和電泳即屬此類。

。第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日根據(jù)緩沖液的性質(zhì)不同可分為：1.連續(xù)系統(tǒng)：電泳緩沖液的離子成分、PH、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液相同，帶電顆粒電泳時僅具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。

2.不連續(xù)系統(tǒng)：電泳緩沖液離子成分、pH、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液不盡相同，帶電顆粒電泳時具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日血紅蛋白（Hb)的組成及分類：血紅蛋白（Hb)：由亞鐵血紅素、珠蛋白組成。每個珠蛋白分子由4條多肽鏈構(gòu)成，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)的不同可分為α、β、γ、δ四種類型。

第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日正常成人Hb種類：

組成百分含量pIHbAα2β295~98%6.95HbA2α2δ22~3%7.38HbFα2γ2<1%>6.95第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciples)

在pH8.6的環(huán)境中，Hb是一種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（Hb的pI〈

8.6），在電場中向正極泳動。電泳時，由于各種Hb等電點(diǎn)不同，所帶電荷量不同；分子量大小、形狀不同，導(dǎo)致各自的泳動速度不同，因而被分離。這種分離可初步鑒定不同的Hb。第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日醋酸纖維素薄膜是由纖維素的羧基進(jìn)行乙?；蠖瞥傻模窈笥芯薮蟮膹埩腿犴g性，幾乎對所有生物活性物質(zhì)均能通過電泳得到分離。醋酸纖維素薄膜電泳因設(shè)備簡單、操作方便、電泳時間短、分辨率高、區(qū)帶分離清晰、無拖尾、易定量等，已成為臨床、實(shí)驗(yàn)室首選的方法。。第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑（Equipments,MaterialsandAgents）1、試劑

0.9%的NaCl溶液；蒸餾水；四氯化碳；碘酊；75%酒精；TEB緩沖液（pH8.6）；麗春紅染液；漂洗液。2、實(shí)驗(yàn)器材

醋酸纖維薄膜；濾紙；電泳儀；一次性穿刺針；消毒棉簽。第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日四、操作步驟（OperatingProcedure）1.取血：

用2%碘酊棉球消毒受試者手指，再用75%酒精棉球脫碘，采血針穿刺，取血約50ul放入事先已加入0.9%NaCl1ml的1.5ml離心管中。如出血不暢，可對手指稍加擠壓。第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日2.制備Hb液：1）洗滌紅細(xì)胞：將上述離心管，顛倒混勻5-6次，4000rpm，離心3分鐘。棄上清，再加1ml0.9%NaCl懸浮紅細(xì)胞，相同條件重復(fù)離心一次。2）溶血：向紅細(xì)胞沉淀中加入蒸餾水1滴，搖勻，再加入四氯化碳1滴，振蕩混勻，相同條件再離心一次，取上清即得Hb液。第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.電泳1）膜條準(zhǔn)備：2）點(diǎn)樣：取出平衡好的膜條，用濾紙吸去多余的液體，然后平鋪,（毛面朝上），用小玻片沾取適量Hb液，按印于點(diǎn)樣線上，點(diǎn)樣處離膜條邊緣1.5cm左右。第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日3）電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，膜條點(diǎn)樣面向下，上樣一端靠近負(fù)極，蓋嚴(yán)電泳室。通電預(yù)電泳5-10min。調(diào)節(jié)電壓為100V，電泳30～40分鐘。4）染色：電泳完畢后關(guān)閉電源。將膜條取下，放在麗春紅染色液中染色10分鐘。5）

漂洗：取出染色膜條，放入漂洗液中漂洗至凝膠背景無色為止。第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日五、結(jié)果與分析：（ResultsandAnalysis）觀察膜條上Hb條帶的位置及顏色的深淺。繪圖紀(jì)錄之。第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日六、臨床意義Hb醋酸纖維素薄膜堿性電泳可以篩選異常血紅蛋病。異常血紅蛋白：指珠蛋白鏈中一個或數(shù)個氨基酸被置換、缺失或增加，造成血紅蛋白結(jié)構(gòu)及功能異常，導(dǎo)致一系列病理和生理改變。是常見的遺傳病之一.

人類異常血紅蛋白高達(dá)兩千多種類型，約300人中即有一人是異常血紅蛋白攜帶者。因此，在臨床上快速、早期診斷尤為重要。第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日分子病

Gene突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子質(zhì)和量異常，從而引起機(jī)體功能障礙的一類疾病，稱為分子病。

第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日異常Hb?。?、基因突變導(dǎo)致珠蛋白結(jié)構(gòu)改變。

鐮狀細(xì)胞貧血2、基因突變導(dǎo)致珠蛋白肽鏈合成缺乏或合成量異常。

地中海貧血：α、β地貧第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日鐮狀細(xì)胞病

形成原因：鏈第6位谷氨酸被纈氨酸取代，形成HbS（鐮狀Hb)。在缺氧情況下，HbS聚合形成長棒狀聚合物，使紅細(xì)胞鐮變,變形能力低，導(dǎo)致溶血、貧血，引起血粘度增高，血管梗阻性繼發(fā)癥狀。發(fā)病的分子基礎(chǔ)是：

β鏈基因的一個堿基對GAG(A)變?yōu)镚TG(T)，致使血紅蛋白的β鏈N端第6位的谷氨酸被纈氨酸取代形成HbS。第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日臨床癥狀：血管阻塞的繼發(fā)癥狀：一過性劇痛（腹痛、關(guān)節(jié)痛）,腦血管意外急性大面積組織損傷：心梗，肺、腎臟損傷；慢性溶血性貧血

患者多在成年以前死亡

第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日β地中海貧血——由于珠蛋白基因的缺失或缺陷使鏈的合成受到抑制而引起的溶血性貧血。

特點(diǎn)：ＨbＡ↓都表現(xiàn)為低色素性貧血α地中海貧血——由于珠蛋白基因的缺失或缺陷使鏈的合成受到抑制而引起的溶血性貧血。地中海貧血第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日最初發(fā)現(xiàn)在地中海地區(qū)居住的人群發(fā)病率特別高，因而稱為地中海貧血。實(shí)際上世界各地都有發(fā)生，非洲和東南亞也比較常見。我國東南沿海地區(qū)高發(fā)。第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日

血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模‥xperimentalObjectives）：1.掌握血清脂蛋白電泳的基本原理及操作方法2.了解血清脂蛋白測定的臨床意義

第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日

血清中的脂類物質(zhì)均以不同的比例與載脂蛋白結(jié)合成水溶性的脂蛋白。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數(shù)量不同，其顆粒大小相差也很大。

第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日血漿脂蛋白的分類*

1．電泳分類法：2．超速離心法：乳糜微粒CM

β-脂蛋白

VLDL

前β-脂蛋白

LDLα-脂蛋白HDL第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日功能48~5080~9550~7050轉(zhuǎn)運(yùn)外源性三酰甘油和膽固醇到全身轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性三酰甘油到全身轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性膽固醇到全身逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇肝臟分類CMVLDL(Preβ-LP)LDL(β-LP)HDL(α-LP)表10-1血漿脂蛋白的分類、組成、性質(zhì)、功能第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日血漿脂蛋白的組成特點(diǎn)及功能*密度法電泳法密度CMCM最小VLDL前β-脂蛋白LDLβ-脂蛋白HDLα-脂蛋白最大組成特點(diǎn)①含TG最多80~95

；②含Apo最少；①含TG第二多50~70②含Apo第二少含Ch最多48~50①含Apo最多,50含pL最多；②含TG最少，含Ch第二多。功能轉(zhuǎn)運(yùn)外源性TG和Ch由腸

全身轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性TG由肝

全身轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性Ch由肝全身轉(zhuǎn)運(yùn)外源性Ch逆向轉(zhuǎn)運(yùn)Ch由全身肝合成部位小腸內(nèi)膜上皮細(xì)胞肝細(xì)胞血漿中VLDL轉(zhuǎn)變而來肝細(xì)胞、小腸粘膜細(xì)胞第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理

(ExperimentalPrinciples)：在pH8.6的緩沖液中，脂蛋白帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。用瓊脂糖凝膠作支持物進(jìn)行電泳，各種脂蛋白因其所帶的負(fù)電荷量及顆粒大小、形狀等不同，在電場中的泳動速度也不一樣，故可將其分離，用不同方法顯色便可進(jìn)行定性、定量分析。第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、主要設(shè)備、實(shí)驗(yàn)材料和試劑

（Equipments,MaterialsandAgents）（一）試劑巴比妥緩沖液（PH8.6I=0.05）；制膠緩沖液（PH8.6I=0.05）；0.45%瓊脂糖凝膠；蘇丹黑B染色液：制膠緩沖液（PH8.6I=0.05）（二）設(shè)備電泳儀和電泳槽；普通離心機(jī)；水浴箱；微量加樣器等第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日四、操作步驟

（OperatingProcedure）1．預(yù)染血清：

取Eppendof管一支，加入血清0.2ml及蘇丹黑B染料液0.02ml，混勻后置于37°C水浴中預(yù)染30分鐘，2000rpm離心5分鐘，取上清液備用。第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日2.制備瓊脂糖膠板：將0.45%的瓊脂糖凝膠，經(jīng)高溫溶化后，將膠模水平放置，插入上樣梳。待瓊脂糖凝膠液冷卻至65℃左右時，小心倒入膠模中，使膠液緩慢、均勻展開，厚約0.5cm，室溫下靜置30min，待凝固完全后，輕輕拔出上樣梳，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日第三十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.點(diǎn)樣：用微量加樣器吸取預(yù)染血清約15μl，加入凝膠樣品槽內(nèi)。4.電泳：加完樣品后的凝膠板，立即通電。點(diǎn)樣端置于負(fù)極。調(diào)電壓100V，電泳約45分鐘，觀察到分開的電泳條帶后關(guān)閉電源，取出凝膠板觀察結(jié)果。第三十六頁，共四十二頁，20