定點(diǎn)突變與重組蛋白表達(dá)

定點(diǎn)突變與重組蛋白表達(dá)第一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日DNArecombination,

將不同來源的DNA片段通過末端共價(jià)連接形成重新組合的DNA分子的過程。Genecloning,在體外對DNA分子按照既定的目的分離，剪切和重新連接，構(gòu)成重組的DNA分子，并在特定的受體細(xì)胞中，與載體一起得到復(fù)制和表達(dá)，從而獲得該分子的大量拷貝。第二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日AspecificDNAfragmentisisolatedfromlarge

genomicDNAandligatedtoavectorDNA(relativelysmall)byusingrestrictionenzymesandligases;Therecombinant(hybrid)DNAmoleculeisthendeliveredintoahostcell(oftenbeingE.colicells)andamplifiedaccompanyingcellpropagation.第三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日

第一節(jié)工具酶及載體限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonucleases）Restrictionenzymes(通常是二聚體)能識別并且切割特定的具有回文結(jié)構(gòu)的序列(HamiltonSmith,1970);能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)并且裂解磷酸二酯健。第四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日根據(jù)酶結(jié)構(gòu)，識別切割序列上的特異性，催化條件及修飾活性等分為：

I型多亞基蛋白復(fù)合物，兼具限制酶甲基化酶活性，需Mg,ATP,SAMII型識別切割具極強(qiáng)特異性。由兩個(gè)亞基組成，需MgIII型相當(dāng)少，有兩個(gè)亞基，切割缺乏特異性第五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日SometypeIIrestrictionenzymescleavebothDNAstrandsatthesamesiteleavingtwobluntendswithoutunpairedbasepairs,OthertypeIIrestrictionenzymesmakestaggeredcutsonthetwoDNAstrandsleavingtwocohesiveends(withprotrudingsinglestrand)whichcanformbasepairwitheachotherorwithanyotherDNAfragmentswithcomplementarycohesiveends;PstI5-CTGCAG-35-CTGCAG－33-GACGTC-53-GACGTC－5第六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日限制酶反應(yīng)的影響因素

1.溫度一般37℃，也有例外SmaI為25℃。

2.緩沖液不同的酶對離子強(qiáng)度，pH有不同要求

3.時(shí)間通常1－1.5hr4.反應(yīng)體積加酶體積一般為總反應(yīng)體積1／105.DNA的純度和結(jié)構(gòu)第七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日二.連接酶和末端轉(zhuǎn)移酶TwodifferentDNAmoleculescutwiththesameorcompatiblerestrictionenzymescanbeligatedintoonerecombinantDNAmoleculebyusingDNAligases;T4-DNAligaseThefirstrecombinantDNAmoleculewasmadewithlphageandSV40DNAmoleculesbyusingterminaltransferasetomakestickyendsontwodifferentDNAmolecules(PaulBerg,1972).第八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日三.載體（vector)質(zhì)粒

染色體外能自主復(fù)制的共價(jià)雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，廣泛存在于原核細(xì)胞內(nèi)。質(zhì)粒DNA的大?。?—200kb

小的能編碼2－3種中等大小的蛋白質(zhì)，其分子量約為106dal，而大的質(zhì)粒分子量則可高達(dá)108dal

第十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日

分子量相對較小具有可供選擇的遺傳標(biāo)志有盡可能多的限制酶切點(diǎn)具復(fù)制起點(diǎn)，能自主復(fù)制Plasmidvectorsmustatleastcontain:areplicationorigin,anantibioticresistancegene(functionasaselectablemarker),andarestrictionsitewhereforeignDNAcanbeinserted(upto15kbcanbecloned);

第十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2.噬菌體BacteriophagelcloningvectorscanbeusedtoclonelargerDNAfragments,wheretherecombinantDNAispackedintophageparticlesinvitroandthenbedeliveredintoE.colicellswithhighefficiency(upto23kbcanbecloned);插入型載體,容量較小，gt11

具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)可供外源DNA片段插入；容量為0～12kb。置換型載體

具有成對的限制酶位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代；容量為9～23kb第十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日UsingbacteriophagelDNAascloningvectorinE.colicells.OnlyrecombinantofappropriatesizeandhavingthetwoessentialphageDNAfragmentswillbepackedintophageparticlesEnterE.colicells第十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日ADVANTAGESOFTHElSYSTEM1.Largeinsertspossible(upto20kb).2.Stablepropagation(C.F.plasmidswherelargeinsertsmaygetdeleted).3.Efficiententryintocellusingin

vitropackaging.4.Multiplecopiesofinsertandstrongpromoters.DISADVANTAGESOFTHElSYSTEM1.Plaquesareproducednotcolonies.UsefulforcloningDNAbutnouseforgeneexpression,ductionofgeneproductsinbiotechnology.2.20kbisstillnotlargeenoughformanyeukaryoticgenes.Forlargerinsertscosmidsoreukaryoticvectorscanbeused.第十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日3.黏性質(zhì)粒

含有l(wèi)噬菌體的黏性末端有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記特點(diǎn)具多個(gè)MCS

本身分子量小，可容納45kbDNA

體外包裝主要是重組體，利于篩選CosmidvectorscontainfeaturesofbothplasmidandphageacceptingevenlargerDNAfragments(upto45kb).第十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Artificialconstructions.ConsistofthecosendsofphagewithplasmidDNA.InvitropackagingisusedtointroducetheDNAintoahostcell.AnyDNAbetween2cossiteswillbepackagedinthephagehead.PhageinjectstheDNAwhichthenbehaveslikeaplasmidonceinsidethehostcell.Butsuch"phages"arenotvirulentanddonotcauselysisorproduceplaques.Coloniesareproduced.Thereforegeneexpressionandproductionispossible.Insertsupto40kbcanbeinserted.Selectioncanbebyaddingampicillinresistancegenetoinsert-positiveselectiononampicillinplates.However,cosmidscanbeunstable.第十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日ThecosmidDNApropagatesasaplasmidinE.colicellsLargeoneswillbepackedintophageparticlesSmalloneswillbetransformedintoE.colicells.Forpackagingintolphageparticles第十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日4.表達(dá)載體（expressingvector)

用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體，除具有克隆載體的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。原核細(xì)胞表達(dá)載體，E.coli

真核細(xì)胞表達(dá)載體

yeast,mammaliancell第二十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日

制備目的基因構(gòu)建重組體將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞重組體的篩選和鑒定重組體的擴(kuò)增和表達(dá)基因克隆的基本程序第二節(jié)基因重組第二十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日一.目的基因的制備1.Genesareisolatedfromagenomiclibrary基因文庫

是收集來源于某種有機(jī)體基因組DNA的所有片斷(通過某種限制性內(nèi)切酶切割后,e.g.,Sau3A)，分別將這些片斷連接到克隆載體中(質(zhì)粒,l噬菌體,cosmid,orYAC);第二十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日基因文庫要包含所有的編碼和非編碼DNA序列.侵染E.coli

細(xì)胞獲得嗜菌斑由l

載體構(gòu)建基因文庫第二十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2.GenesareisolatedfromacDNAlibrarycDNA文庫是收集所有來源于某種有機(jī)體、某種細(xì)胞或組織mRNAs的DNA分子片斷(用反轉(zhuǎn)錄酶從互補(bǔ)DNA轉(zhuǎn)化而來,亦稱cDNA,)而建立起來的。

AcDNAlibraryisa(complete)collectionofDNAfragmentsderivedfromthemRNAs(convertedtotheircomplementaryDNA,orcDNA,usingreversetranscriptase)ofaparticularorganism,certaincellsortissuesofanorganism.第二十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日AcDNAlibraryisgeneratedfromamRNA“l(fā)ibrary”fromacertainsource.InsertintoacloningvectortomakeacDNAlibrary.第二十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日3.SpecificDNAsequencescanbeamplifiedusingpolymerasechainreaction(PCR)ApairofoligonucleotideprimerscomplementarytotheflankingregionsofthetargetDNAhavetobesynthesizedRepeated(usuallyabout30cycles)chainseparationandDNAsynthesis(usingthethermostableTaqDNApolymerase)willamplifythetargetDNAmillionsoffold;ThePCRtechnique,inventedbyKaryMullisin1984,causedarevolutionforDNAdetectionandmanipulation.第二十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第二十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日4.Genearesynthesizedbychemicalmethod第二十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日二.目的基因與載體重組黏性末端連接平端連接人工頭連接同聚物加尾連接第二十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第三十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日三.重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞Transformation轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒及重組體導(dǎo)入細(xì)菌Transfection轉(zhuǎn)染，病毒及重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞Transduction轉(zhuǎn)導(dǎo)，噬菌體及重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞第三十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日1.氯化鈣法特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率低2.電穿孔法特點(diǎn)：操作簡單，轉(zhuǎn)化率高；穿孔條件難掌握，細(xì)胞殺傷率高3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率最高，但脂質(zhì)體昂貴4.顯微注射法特點(diǎn)：儀器昂貴，操作需熟練第三十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日四.重組體的篩選和鑒定1.遺傳學(xué)方法插入失活,藍(lán)－白篩選2.限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定3.核酸雜交法－原位雜交4.PCR篩選法5.免疫化學(xué)篩選法第三十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第三十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第三節(jié)定點(diǎn)突變寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變盒式突變或片段取代突變PCR定點(diǎn)突變隨機(jī)突變基因突變位點(diǎn)特異性突變第三十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)在體外特異性改變某個(gè)堿基的技術(shù)第三十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule.

第三十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日site-directedmutagenesistheresearcherscanstudyindetailhowproteinsfunctionandhowtheyinteractwithotherbiologicalmolecules.Site-directedmutagenesiscanbeused,forexample,tosystematicallychangeaminoacidsinenzymes,inordertobetterunderstandthefunctionoftheseimportantbiocatalysts.Theresearcherscanalsoanalysehowaproteinisfoldedintoitsbiologicallyactivethree-dimensionalstructure.Themethodcanalsobeusedtostudythecomplexcellularregulationofthegenesandtoincreaseourunderstandingofthemechanismbehindgeneticandinfectiousdiseases,includingcancer.第三十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日

第三十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日1.影響的各種因素一.寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變1）DNA模板的制備2）引物的設(shè)計(jì)和選擇引物的特性引物的設(shè)計(jì)3）突變引物與模板DNA的退火和引物延伸條件4）關(guān)于DNA聚合酶的選擇5）受體細(xì)胞對突變體產(chǎn)率的影響第四十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2.幾種寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變方法Kunkel突變法第四十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日1)將待突變的基因克隆到質(zhì)粒中，導(dǎo)入具有ung-dut-

雙缺陷的E.coli

中.dut-(缺少dUTPase，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)dUTP水平上升)細(xì)菌聚集dUTP，并在DNA復(fù)制時(shí)，部分取代dTTP進(jìn)入DNA新生鏈。ung-(缺少尿嘧啶脫糖苷酶)細(xì)菌不能去除摻入的dUTP，最終的結(jié)果是，轉(zhuǎn)入到細(xì)菌中的質(zhì)粒DNA中，大約由1％的T被U所取代。第四十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Figure1.

dsDNAplasmidistransformedintoung-bacteriawhichconvertstheT's

toU's.Inthisexample,theGCbasepairwillbetargetedformutagenesis.

ThisU-containingplasmidisconvertedtosingle-strandedDNA.第四十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2)含有U的目標(biāo)DNA與含有突變的寡核甘酸片斷孵育，該寡核甘酸片斷除了需要的突變點(diǎn)外，都與目標(biāo)DNA配對。這種突變可以是一個(gè)或幾個(gè)核甘酸的插入、刪除和堿基替換。然后該混合物與Klenow,dNTP‘s孵育，接著加入連接酶和ATP產(chǎn)生雙鏈的質(zhì)粒，其中一條鏈含有U，而新合成的鏈只含有T。需要注意的是突變的核甘酸與舊的模板鏈?zhǔn)遣慌鋵Φ?。第四十四頁，共一百三十二頁?022年，8月28日Figure2.Targetplasmidisusedasatemplatetoproduceasecondstrand

ofDNAthatcontainsthedesiredmutationandonlyT's第四十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日3)最后，雜交的雙鏈DNA被轉(zhuǎn)入到正常的細(xì)菌中，其尿嘧啶－糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基，原來的模板鏈被降解，只有突變鏈因不含U，被保留下來。再以此突變鏈為模板合成出來的新鏈都含有突變堿基。最終所有的質(zhì)粒都含有新的突變堿基。第四十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Figure3.

Hybridplasmidistransformedintowild-typebacteriathatconverttheoriginalU-containingstrandofDNAintoastrandofT-containingDNAthatiscomplementofthemutatedsequence(ingreen).TheoriginalGC

basepairhasbeenconvertedtoanewTAbasepair.第四十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日抗生素抗性回復(fù)突變法此體系利用pALTER-1噬菌粒為突變載體。Thesystemsuseantibioticselectionasameanstoobtainahighfrequencyofmutants.

特點(diǎn)：1.有MCS2.含Amps,Tetr3.利用Helperphage第四十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日

?previousPromegaCorporation~2800WoodsHollowRoad~Madison,WIUSA

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printfigure0578va第四十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日pALTER?-1載體含氨芐青霉素和四環(huán)素兩個(gè)抗性基因,但是氨芐青霉素的抗性基因是沒有活性的。氨芐修復(fù)寡核甘酸可以在突變反應(yīng)中恢復(fù)突變鏈的氨芐的抗性。ThepALTER?-1Vectorcontainsgenesforampicillinandtetracyclineresistance,buttheampicillinresistancegenehasbeeninactivated.TheAmpicillinRepairOligonucleotiderestoresampicillinresistancetothemutantstrandduringthemutagenesisreaction.

第五十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第五十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第五十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第五十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第五十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日適合的寡核甘酸片斷可以同時(shí)用在突變反應(yīng)中，去除一個(gè)抗生素活性的同時(shí)而修復(fù)另一種抗生素活性。用這種方法隨后的突變和選擇可以在同一質(zhì)粒上進(jìn)行，而不需要亞克隆。Theappropriateoligonucleotidescanbeusedsimultaneouslyinthemutagenesisreactiontoinactivateoneresistancegenewhilerepairingtheother.Inthisway,subsequentroundsofmutagenesisandselectioncanbeperformedonthesameplasmidwithoutsubcloning.

第五十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日特點(diǎn)：多克隆位點(diǎn)，用以對目標(biāo)基因的克隆。含有四環(huán)素(Tetr)和氨芐青霉素(Amps)的抗性基因,在突變中用氨芐青霉素抗性修復(fù)寡核甘酸使AmpsAmpr,用于對陽性克隆的篩選。利用輔助噬菌體超感染，制備含目標(biāo)基因的單鏈DNA作為突變模板DNA。為提高突變效率，受體菌應(yīng)是點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)缺失的菌株。第五十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日基于去除特定限制酶切位點(diǎn)的突變法在突變載體DNA上除了有克隆外源基因的克隆位點(diǎn)外，還有一獨(dú)特的限制酶切位點(diǎn)。第五十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日該該位點(diǎn)也不存在目標(biāo)基因上第五十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日突變時(shí)用兩個(gè)引物：一是突變引物；二是獨(dú)特限制酶切位點(diǎn)去除的選擇性引物。第五十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：不需制備單鏈DNA;不需輔助噬菌體；不需進(jìn)行亞克隆。第六十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：方便、快捷、不受限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的限制二.利用PCR產(chǎn)生定點(diǎn)突變

利用PCR法在基因5’末端區(qū)或

3’末端區(qū)產(chǎn)生突變2.重疊延伸(overlapextension)和基因突變

第六十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日5Add-onmutagenesis

Thisisacommonlyusedpracticeinwhichanewsequenceorchemicalgroupisaddedtothe5’endofaPCRproductbydesigningprimerswhichhavethedesiredspecificsequenceforthe3’partoftheprimerwhilethe5’partoftheprimercontainsthenovelsequenceorasequencewithanattachedchemicalgroup.Theextra5’sequencedoesnotparticipateinthefirstannealingstepofthePCRreaction(onlythe3’partoftheprimerisspecificforthetargetsequence),butitsubsequentlybecomesincorporatedintotheamplifiedproduct,therebygeneratingarecombinantproduct,第六十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日(A)5

add-onmutagenesis.Primerscanbemodifiedatthe5endtointroduce第六十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日加到PCR引物5‘端的序列摻入到PCR產(chǎn)物的末端。一個(gè)PCR擴(kuò)增片段可與另一個(gè)PCR擴(kuò)增片段上的序列相重疊，其后的反應(yīng)中，這段重疊序列可以作為引物被DNA聚合酶所延伸，由此產(chǎn)生一個(gè)新的重組分子。非生產(chǎn)鏈生產(chǎn)鏈第六十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日取代突變第六十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日缺失突變第六十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日插入突變第六十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第六十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日幾點(diǎn)補(bǔ)充：重疊延伸反應(yīng)中非生產(chǎn)鏈的命運(yùn)？重疊延伸反應(yīng)進(jìn)行基因剪接，其不同部位在反應(yīng)中執(zhí)行不同功能引導(dǎo)區(qū)(primingregion):寡核苷酸3’端重疊區(qū)(overlapregion):寡核苷酸5’端插入?yún)^(qū)：重疊區(qū)和引導(dǎo)區(qū)之間第六十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日盒式突變（cassettemutagenesis),

又稱片段取代法（DNAfragmentreplacement)關(guān)鍵1.目標(biāo)基因序列中有適當(dāng)限制酶切位點(diǎn)

2.如何得到各種合適的用以取代目標(biāo)基因中特定DNA片段的突變DNA片段三.區(qū)域性定向突變第七十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日四.隨機(jī)突變（randommutagenesis)當(dāng)缺乏目的基因序列的詳盡資料時(shí)，定點(diǎn)突變就受到限制，此時(shí)可利用隨機(jī)突變。第七十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第七十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日待突變基因克隆到載體上，其下游緊接兩個(gè)限制酶切位點(diǎn)。前一酶切位點(diǎn)是5‘突出，后一酶切位點(diǎn)是3’突出第七十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日ExoIII催化線性雙鏈DNA或有缺口環(huán)狀DNA自3‘-OH端逐一釋放5’單核甘酸。適當(dāng)時(shí)機(jī)終止酶切反應(yīng)缺口填補(bǔ)，類似物摻入DNA鏈的一處或多處第七十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日S1核酸酶處理單鏈末端，形成平末端50％基因攜帶有錯(cuò)配的堿基，導(dǎo)致位點(diǎn)變異第七十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)第七十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第七十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日一.目標(biāo)蛋白在E.coli中的表達(dá)在E.coli

中表達(dá)蛋白是非常簡單,快速和便宜的。有很多商品化和非商品化的載體，在N-末端或C-末端有標(biāo)簽（tag),并有很多菌株供使用者選擇。TheexpressionofproteinsinE.coliistheeasiest,quickestandcheapestmethod.Therearemanycommercialandnon-commercialexpressionvectorsavailablewithdifferentN-andC-terminaltagsandmanydifferentstrainswhichareoptimizedforspecialapplications.第七十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)

1.遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚

2.容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵

3.外源基因常可以高效表達(dá)第七十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日不足

1.不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后修飾

2.限制二硫鍵的形成，多亞基復(fù)合體的組裝

3.外源基因易形成不溶性的包涵體第八十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日

表達(dá)載體（expressingvector)

用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體，除具有克隆載體的性質(zhì)外，還帶有轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。

原核細(xì)胞表達(dá)載體，E.coli真核細(xì)胞表達(dá)載體，yeast,mammaliancell第八十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日RecombinantproteinscanbeproducedinE.colicellsusingspecificexpressionvectors.BasicelementsformakinganE.coli

expressionvector第八十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日

表達(dá)載體的一般特點(diǎn)

復(fù)制起始點(diǎn)選擇性基因強(qiáng)的，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)合適的多克隆位點(diǎn)第八十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2.與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素1）有效的轉(zhuǎn)錄起始2）有效地翻譯3）蛋白質(zhì)水解作用4）蛋白質(zhì)的外泌第八十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日3.蛋白質(zhì)表達(dá)的方法Atypicalexpressionexperimentconsistsofthefollowingstep:Pickingofasinglecolonyfromafreshlystreakedplateoftheexpressionhostcontainingtherecombinantvector.Growingofastarterculture.Inoculate(接種)withthepickedcolonyupto50mlofrichmedium(suchasLBor2xYT)containingtheappropriateantibiotic.Whenalargerstartercultureisrequired,inoculate4mlofrichmediawiththesinglecolony;growfor4-8hoursat37°C;andusethistoinoculatethestarterculture.第八十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日InoculationofthemaincultureandincubationuntilOD600reaches0.4-1.TheoptimalODvaluedependsontheculturemethodandthemedium.ForflaskculturesusingLB-mediumanOD600

of

0.6isrecommended.Toincreasethegrowthrate,wecarryouttheculturesat37°CuntiltheODforinductionisreached.Thentheculturesarecooledtotheinductiontemperatureinice-water.Inductionofproteinexpression.Proteinexpressionisinducedbytheadditionoftheproperinducerorbychangingthegrowthconditions.Fromthispointonthecellswillusemostoftheirresourcesfortheproductionofthetargetproteinandwillnotgrowmuchfurther.第八十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Forthemostusedpromotersinductionconditionsarelistedbelow.Promoter

induction

typicalcondition

rangetrc(hybrid)additionofIPTG0.2mM0.05-2.0mMaraBADadditionofl-arabinose0.2%0.002-0.4%PL

liftingthetemperaturefrom37to42CT7-lacoperatoradditionofIPTG0.2mM0.05-2.0mM

第八十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Afterinductiontheculturesareincubatedfrom3hourstoovernightdependingontheinductiontemperature.Incubationtemperatureincubationtime15°Covernight20°Covernight25°Covernight30°C5-6h37°C3-4hHarvestingofthecellpelletbycentrifugation(20minat6000g).Cellpelletsarestoredat-20°C.第八十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日4.改善表達(dá)水平及溶解性的方法1）如何改善表達(dá)水平

誘導(dǎo)條件外源基因的編碼序列用蛋白酶缺失的宿主菌

第八十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2）如何改善外源蛋白的溶解性

Inmanycasestheexpressedproteinisinsolubleandaccumulatesinso-calledinclusionbodies(包含體).Thisisespeciallytrueunderconditionsofhighlevelexpression.Severalstrategiesareavailabletoimprovethesolubilityoftheexpressedprotein.第九十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日1.Reducingtherateofproteinsynthesis.

Thiscanbedoneby:loweringthegrowthtemperature.Thisdecreasestherateofproteinsynthesisandusuallymoresolubleproteinisobtained.usingaweakerpromoter(e.g.

trcinsteadofT7).usingalowercopynumberplasmid.loweringtheinducerconcentration.第九十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2.Changingthegrowthmedium.

additionofprostethicgroupsorco-factorswhichareessentialforproperfoldingorforproteinstability.additionofbuffertocontrolpHfluctuationinthemediumduringgrowth.additionof1%glucosetorepressinductionofthelacpromoterbylactose,whichispresentinmostrichmedia(suchasLB,2xYT).additionofpolyols(e.g.sorbitol)andsucrose.Theincreaseinosmoticpressure(滲透壓)causedbytheseadditionsleadstotheaccumulationofosmoprotectantsinthecell,whichstabilizethenativeproteinstructure.additionofethanol,lowmolecularweightthiolsanddisulfides,andNaCl.第九十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日3.Co-expressionofchaperonesand/orfoldases.Twoclassesofproteinsplayanimportantroleininvivoproteinfolding.Molecularchaperonespromotetheproperisomerizationandcellulartargetingbytransientlyinteractingwithfoldingintermediates.ThebestcharacterizedE.colisystemsare:GroES-GroEL

DnaK-DnaJ-GrpE

ClpB

第九十三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日GroEL/GroES復(fù)合物GroESGroEL第九十四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第九十五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日第九十六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Foldasesacceleraterate-limitingstepsalongthefoldingpathway.Threetypesoffoldasesplayanimportantrole:peptidylprolylcis/transisomerases(PPI's肽基脯氨酰異構(gòu)酶)disulfideoxidoreductase(DsbA)anddisulfideisomerase(DsbC)proteindisulfideisomerase(PDI)-aneukaryoticproteinthatcatalyzesbothproteincysteineoxidationanddisulfidebondisomerization.Italsoexhibitschaperoneactivity.第九十七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Co-expressionofoneormoreoftheseproteinswiththetargetproteincouldleadtohigherlevelsofsolubleprotein.Thelevelsofco-expressionofthedifferentchaperones/foldaseshavetobeoptimizedforeachindividualcase.DsbAandDsbChavealsoshownpossitiveeffectsonexpressionlevelswhenusedasafusionpartner.第九十八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日4.Periplasmicexpression.

Secretionofthetargetproteintotheperiplasmhasanumberofdistinctadvantages:theoxidizingenvironmentoftheperiplasmallowsfortheformationofdisulfidebonds,whichdoesnotoccurinthereducingenvironmentofthecytoplasm.theperiplasmcontainstwofoldases,disulfideoxidoreductase(DsbA)anddisulfideisomerase(DsbC),thatcatalyzetheformationandisomerizationofdisulfidebonds.reducedproteolysis(sincelessproteinsarepresent).allowsfortheaccumulationofproteinsthataretoxicinthecytoplasm.engineeringofanauthentic(可信的)N-terminus.第九十九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Secretionisachievedbytheadditionofaleadersequence(signalpeptide)totheN-terminusofthetargetprotein.MostusedleadersequencesarepelBandompT.Unfortunately,expressionyieldareusuallymuchlowerandnotallexpressedproteinissecretedintotheperiplasmbutisalsofoundinthemedium,thecytoplasmandthecytoplasmicmembrane.第一百頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日5.Usingspecifichoststrains.Thesolubilityofdisulfidebondcontainingproteincanbeincreasedbyusingahoststrainwithamoreoxidizingcytoplasmicenvironment.Twostrainsarecommerciallyavailable(Novagen):AD494,whichhasamutationinthioredoxinreductase(trxB).Origami,adoublemutantinthioredoxinreductase(trxB)andglutathionereductase(gor).第一百零一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日6.Additionofafusionpartner.FusionoftheN-terminusofaheterologousproteintotheC-terminusofasolublefusionpartneroftenimprovesthesolubilityofthefusionprotein.7.Expressionofafragmentoftheprotein.

E.colidoesnotexpresswellverylargeproteins(>70kDa).Choosingasmallerfragmentofthetargetproteincanimproveexpressionlevelsandsolubility.Thesolubilityofapoorlysoluble(orinsoluble)proteincanalsobeimprovedbyselectingonlyasolubledomainforexpression.第一百零二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日8.Invitrodenaturationandrefoldingoftheprotein.Whendespitealleffortsthetargetproteinstillisexpressedininclusionbodies,thenthelastresortistodenatureandrefoldtheproteininvitro.Thisprocedureiscarriedoutinthreephases:isolationoftheinclusionbodies.solubilizationanddenaturationofthetargetprotein.Thisisdonebytheadditionofadenaturingagent(usuallyguanidineorurea)underreducingconditions(e.g.20mMDTT).refoldingoftheproteinbyremovingthedenaturatingagentusingdialysis,dilutionorchromatography.Forproteinscontainingdisulfidebondsthishastobecarriedoutinthepresenceofaredoxshuttlingsysteme.g.reducedandoxidizedglutathione.第一百零三頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日3)如何改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性Ingeneralproperlyfoldedproteinarequitestable.Theprecisestructuralfeaturesthatimpartstabilitytoproteinsarenotknown.Nonetheless,somedeterminantsofproteininstabilityhavebeenelucidated.第一百零四頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日1.N-endrule.InE.coliN-terminalArg,Lys,Leu,Phe,Tyr,andTrpresiduesgreatlydecreasethehalf-lifeoftheprotein.AtestproteinwiththeseresiduesintheN-terminalpositionshowedhalf-lifesofonly2minutescomparedtomorethan10hourswithallotheraminoacids(exceptproline).

Reference:Tobiasetal.(1991)Science254,1374-1377.2.PESThypothesis.IneukaryotesproteinsaredestabilizedbyregionsenrichedinPro,Glu,Ser,andThr.

第一百零五頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日Sometimesthelevelsofproteinexpressionarelowbecauseofhighlevelofproteaolyticdegradationofthetargetprotein.Thefollowingapproachescanbeusedtoimporvetheexpressionlevel:i.Usingprotease-deficienthoststrains.Theuseofhoststrainscarryingmutationswhicheliminatetheproductionofproteasescansometimesenhanceaccumulationbyreducingproteolyticdegradation.BL21,theworkhorseofE.coliexpression,isdeficientintwoproteasesencodedbythelon(cytoplasmic)andompT(periplasmic)genes.第一百零六頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日ii.Periplasmicexpression.Intheperiplasmproteolyticdegradartionofproteinsisdecreased.Thisismainlybecausethetotalnumberofproteinsintheperiplasmislower.iii.Decreasingthegrowthtemperature.Reducingthegrowthtemperaturewillresultinslowerproteinproductionbutalsoinslowerproteolyticdegradation.Theoverallresultisoftenanincreasedexpressionlevelofthetargetprotein.第一百零七頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日4）如何減少蛋白質(zhì)的毒性Lowexpressionlevelsornoexpressionatallcanalsobecausedbytoxicityofthetargetprotein.Proteintoxicitycanmanifestitselfondifferentlevels:第一百零八頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日1.Incompleterepressionofproteinexpression.Manypromotersarenotverytightlyregulatedandshowsomedegreeofexpressionbeforetheadditionoftheinducer.Especiallylacpromotersareleaky.Oftenthisleakinessleadstoplasmidinstabilityand/orlossofplasmid.Asaconsequencetheculturewillbeovergrowbycellsthathavelosttheplasmid(especiallywhenampicillinisusedasaselectablemarker)orwillnotgrowatall.

Differentapproachescanbeusedtogiveamoretightlyregulatedexpression:第一百零九頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日constitutiveexpressionofarepressorprotein.InthecaseofthelacpromoterbytheexpressionofthelacrepressorfromthelacIorlacIqgene.FormediumcopynumberplasmidsitissufficienttouseahoststraincarryingthelacIqallele(等位基因).Highercopynumberplasmidsshouldcontaintherepressorgeneonthevector.useamoretightlyregulatedpromoter,e.g.thearabinosepromoter(PBAD).usealowercopynumberplasmid.

第一百一十頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日constitutiveexpressionofphageT7lysosymefromacompatiblepLysSorpLysEplasmid(Novagen).LysosymebindstoT7RNApolymeraseandinactivatestheenzyme.AftertheadditionofIPTGtheexpressionlevelofthepolymerasewillbemuchhigherthanthatoflysosymeandthiswillovercometherepression.additionof1%glucosetotheculturemediumtorepressinductionofthelacpromoterbylactose,whichispresentinmostrichmedia(suchasLB,2xYT).第一百一十一頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日2.Besidestighteningregulation,otherapproachesexisttopreventlosingtheexpressionvectorfromthecells.useofelevatedlevelsofantibiotics(upto200mg/ml).usethe"plating"methodforinoculatingcultures.Culturesareinoculatedbyscrapingoffagarplates第一百一十二頁，共一百三十二頁，2022年，8月28日3.Toxicityuponinduction.Someproteinsaresotoxicforthecellsthattheydonotonlyinhibitgrowthbutalsokillthem.Thus,almostimmediatelyafterinductioncellsdieandexpressionlevelswillbeverylow.Severalapproachesarepossibletodecreasetheeffectsofproteintoxicity:periplasmicexpression.Secretionofthetargetproteintotheperiplasm(orthemedium)allowsfortheaccumulationofproteinsthataretoxicinthecytoplasm.expressionininclusionbodies.Althoughdifficulttodirectitisadvantageoustoexpresstoxicproteinininclusionbodies.Inaggregates