益生菌制劑對(duì)雛雞盲腸菌群的部分作用機(jī)制,畜牧獸醫(yī)論文

益生菌制劑對(duì)雛雞盲腸菌群的部分作用機(jī)制,畜牧獸醫(yī)論文在畜牧業(yè)生產(chǎn)經(jīng)過中,利用抗生素治療和預(yù)防疾病帶來的種種弊端逐步被人們所認(rèn)識(shí),2006年歐盟決定禁止使用任何抗生素作為飼料添加劑。益生菌作為一類能通過調(diào)控生物體微生態(tài)平衡進(jìn)而有效促進(jìn)宿主健康生長的活微生物制劑,一直被以為是抗生素的最佳替代者之一。關(guān)于對(duì)雛雞腸道菌群的研究已有較多,但是關(guān)于益生菌和抗生素對(duì)肉雛雞盲腸菌群發(fā)育規(guī)律的影響作用還鮮有報(bào)道。本研究以屎腸球菌和金霉素為試驗(yàn)材料,通過對(duì)不同日齡肉雛雞盲腸內(nèi)容物的16SrDNAV3區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE指紋圖譜比擬分析,從不同角度研究益生菌制劑的部分作用機(jī)制以及日糧中添加抗生素的可能影響。1、材料與方式方法1.1試驗(yàn)材料與試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專利菌株(專利號(hào):ZL201810452087.2)屎腸球菌HDRsEf1株,湖北華大瑞爾科技有限公司生產(chǎn),每克菌粉的活菌數(shù)30億。試驗(yàn)動(dòng)物為1日齡健康白羽肉雞科寶500,購自湖北宜昌正大有限公司。1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集1)屎腸球菌定植動(dòng)物試驗(yàn)。選用1日齡健康白羽肉雞80只隨機(jī)分成對(duì)照組(玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧)和益生組(添加300g屎腸球菌菌粉/1000kg),每組分別在1、3、5、7、9、11日齡時(shí)頸靜脈放血處死5只雛雞,在超凈臺(tái)內(nèi)快速采集盲腸內(nèi)容物并混合,置4℃冰箱備用。2)屎腸球菌和抗生素對(duì)雛雞腸道菌群的影響試驗(yàn)。試驗(yàn)選用1日齡新生白羽肉雞180只,隨機(jī)分成對(duì)照組(玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧)、益生組(添加300g屎腸球菌菌粉/1000kg)和抗生素組(添加50mg金霉素/kg)。每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20只雞。試驗(yàn)周期為42d,每組分別在7、14、21、28、35、42日齡時(shí)頸靜脈放血處死6只試驗(yàn)雞,在超凈臺(tái)內(nèi)快速采集盲腸內(nèi)容物,將每個(gè)組的6只雛雞內(nèi)容物混合,置4℃冰箱備用。1.3細(xì)菌總DNA的提取參照文獻(xiàn),采用QIAampDNAStoolMiniKit,根據(jù)操作手冊提取細(xì)菌總DNA。用核酸濃度測定儀測定總DNA濃度,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.4RT-PCR法檢測盲腸中屎腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物見表1。檢測屎腸球菌數(shù)量的熒光定量PCR反響條件:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,60℃延伸30s,40個(gè)循環(huán)。檢測大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的熒光定量PCR反響條件:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,55℃退火20s,72℃延伸30s,40個(gè)循環(huán)。每次熒光定量PCR循環(huán)結(jié)束后溶解曲線從65℃逐步升到95℃。熒光定量PCR體系的最終體積控制在20L,反響試劑均按PremixExTaqTM試劑講明書的推薦量添加。1.5基因組特異性片段V3區(qū)的擴(kuò)增為了檢測各組腸道菌群的變化情況,用引物GC341f(5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3)和519r(5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3)擴(kuò)增16SrRNA的V3區(qū)片段,擴(kuò)增條件是94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火20s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR反響體系(25L):2PCRmix12.5L,上下游引物(10pmol/L)各1L,DNA模板2L,ddH2O補(bǔ)足至25L。1.6基因組特異性片段V3區(qū)的變性梯度凝膠電泳(DGGE)使用Bio-RadDcode進(jìn)行DGGE凝膠電泳。變性劑梯度范圍為38%~55%,100%的變性劑包含7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺。電泳在恒溫60℃條件下1TAE緩沖液中進(jìn)行,先200V預(yù)電泳10min,然后65V電壓電泳16h。參照文獻(xiàn)[7]方式方法用硝酸銀染色,對(duì)完成顯色后的凝膠拍照,再用相應(yīng)軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析。1.7數(shù)據(jù)分析采用UPGMA進(jìn)行聚類分析,以香農(nóng)多樣性指數(shù)H表示菌群多樣性的高低,SPSS18.0進(jìn)行PCA分析和顯著性差異分析。2、結(jié)果與分析2.1益生性屎腸球菌HDRsEf1株在雛雞腸道菌群定植確實(shí)定如此圖1所示,隨著雛雞日齡的增加,益生菌組中雛雞盲腸中的屎腸球菌的數(shù)量逐步增加,到第5日齡時(shí)基本到達(dá)穩(wěn)定,而對(duì)照組的屎腸球菌的數(shù)量在5日齡以后逐步降低,講明該株屎腸球菌HDRsEf1能夠在雛雞盲腸內(nèi)定植,并且在5日齡時(shí)就基本到達(dá)穩(wěn)定。2.2大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的檢測由表2可見,飼料中添加屎腸球菌HDRsEF1和抗生素能夠顯著減少21日齡時(shí)雛雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量(P0.05),而在42日齡時(shí)益生菌組和抗生素組中的大腸桿菌的數(shù)量都有所下降,但差異不明顯。同時(shí),飼料中添加屎腸球菌HDRsEF1能夠顯著增加雛雞盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量,在42日齡時(shí)益生菌組與對(duì)照組和抗生素相比差異顯著(P0.05),在21日齡時(shí)差異不顯著。2.3DGGE圖譜的分析與處理1)DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果。聚類分析結(jié)果(圖2)主要有2個(gè)分支,7日齡雛雞盲腸微生物菌群與其他日齡的距離較遠(yuǎn),而從14日齡到42日齡微生物菌群比擬穩(wěn)定,講明從7日齡到14日齡時(shí)微生物菌群產(chǎn)生了明顯的變化。2)DGGE圖譜的類似性和多樣性分析結(jié)果。通過比擬各處理組雛雞在7日齡和14日齡、14日齡和21日齡、21日齡和28日齡、28日齡和35日齡以及35日齡和42日齡的盲腸微生物菌群之間的類似性,來評(píng)價(jià)腸道菌群的穩(wěn)定程度,類似度越高則講明腸道菌群的變化越小,穩(wěn)定度越高。由表3能夠看出,除了7日齡與14日齡,益生菌組的其他相鄰日齡之間的類似度指數(shù)均高于對(duì)照組和抗生素組,并且差異顯著(P0.05),講明在14日齡以后,益生菌組的腸道菌群相對(duì)于另外2組維持在比擬穩(wěn)定的狀態(tài)。在3個(gè)處理組中,抗生素組在14到35日齡時(shí)的類似性指數(shù)均低于對(duì)照組和抗生素組,講明抗生素的添加會(huì)降低腸道菌群的穩(wěn)定性。由圖3可見,3個(gè)不同處理組的雛雞盲腸微生物菌群的多樣性指數(shù)隨日齡的增加均逐步增大,各組之間的差異不顯著,講明益生菌和抗生素的添加并不會(huì)影響腸道菌群的多樣性指數(shù)。3)DGGE圖譜的主成分分析。對(duì)DGGE圖譜的主成分分析結(jié)果與聚類分析的結(jié)果一致,如此圖4所示。7日齡樣品與其他日齡樣品的距離較遠(yuǎn),位于矩形方框的下部,講明7日齡盲腸菌群與其他日齡的差異較大。而14、28日齡和35、42日齡分居矩形方框上部的左右側(cè)。3、討論3.1屎腸球菌在雛雞盲腸菌群的定植益生菌在腸道內(nèi)的粘附定植是其發(fā)揮生理作用的前提和基礎(chǔ)。本文用RT-PCR技術(shù)來檢測屎腸球菌HDRsEf1在盲腸的定植情況,檢測的結(jié)果顯示對(duì)照組在3日齡到7日齡時(shí)屎腸球菌的數(shù)量大致一樣,Lu等利用分子生物學(xué)的方式方法研究發(fā)現(xiàn),在肉雞3日齡和7日齡的盲腸菌群中檢測到的屎腸球菌拷貝數(shù)一樣,與本研究對(duì)照組的檢測結(jié)果一致。而益生菌組中的屎腸球菌的數(shù)量隨著飼喂時(shí)間的增加而逐步升高,在雛雞5日齡時(shí)數(shù)量就基本到達(dá)穩(wěn)定,講明該屎腸球菌HDRsEf1與雛雞的盲腸粘膜的粘附性好,能夠在盲腸穩(wěn)定存活。3.2益生性屎腸球菌和抗生素對(duì)雛雞盲腸大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的影響益生菌進(jìn)入動(dòng)物胃腸道后,能夠通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)或者產(chǎn)酸來抑制某些潛在有害菌和對(duì)酸性敏感的病原菌的生長,維持腸道菌群的平衡。本研究利用不需培養(yǎng)計(jì)數(shù)的RT-PCR的分子生物學(xué)方式方法定量檢測了腸道細(xì)菌的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)益生菌的添加能夠顯著降低大腸桿菌的數(shù)量,增加乳酸桿菌的數(shù)量。但是該方式方法相當(dāng)于傳統(tǒng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)法,不但省時(shí)省力,且能有效提高檢測的靈敏度,實(shí)現(xiàn)快速定量檢測。通過比擬益生菌組和抗生素組發(fā)現(xiàn),日糧中添加抗生素,在抑制大腸桿菌數(shù)量生長的同時(shí)也抑制了乳酸桿菌的生長,而益生菌的添加則會(huì)促進(jìn)乳酸桿菌的生長,從這一點(diǎn)來看益生菌組的效果要優(yōu)于抗生素組。3.3PCR-DGGE指紋圖譜的分析PCR-DGGE聚類分析的結(jié)果和主成分分析的結(jié)果一致,益生性屎腸球菌和金霉素的添加并不會(huì)影響雛雞盲腸微生物菌群的正常發(fā)育。Lu等[9]研究發(fā)現(xiàn)肉雞在3~7日齡、14~28日齡及49日齡時(shí)的盲腸腸道菌群構(gòu)造有明顯的差異。從本研究的聚類分析和主成分分析結(jié)果能夠看出,早期肉雛雞盲腸菌群在7日齡時(shí)與在14~42日齡時(shí)的差異較大,講明早期雛雞盲腸菌群從7日齡到14日齡為一個(gè)過渡期,從14日齡到42日齡為一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定期,兩者研究結(jié)果基本一致。該結(jié)果提示,假如在肉雛雞7日齡之前飼喂有利于盲腸腸道菌群健康生長的益生菌或某種物質(zhì),將有利于雛雞盲腸菌群更有效地到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài),能減少盲腸菌群在過渡時(shí)期給肉雛雞帶來的各種應(yīng)激反響。通過比擬各處理組相鄰周齡之間的PCR-DGGE指紋圖譜的類似性指數(shù)能夠看出,益生菌組在7~14日齡時(shí)最低,而在之后均高于對(duì)照組和抗生素組,講明在肉雛雞盲腸微生物菌群的發(fā)育經(jīng)過中,益生菌的添加能更有效地促進(jìn)腸道微生物菌群進(jìn)入到穩(wěn)定狀態(tài)并且維持穩(wěn)定。而抗生素組的類似性指數(shù)在過渡期7~14日齡要高于其他2組,在之后的穩(wěn)定期14~35日齡內(nèi)要低于其他2組,講明抗生素金霉素的添加并沒有有效促進(jìn)盲腸微生物菌群進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài),反而抑制了微生物菌群進(jìn)入和維持穩(wěn)態(tài)。以下為參考文獻(xiàn)：[1]王曉霞,易中華,計(jì)成,等.果寡糖和枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞腸道菌群數(shù)量、發(fā)酵糞中氨氣和硫化氫