講動物細胞生物制藥應(yīng)用舉例

第四篇

生物制品生產(chǎn)

第8講

動物細胞生物制藥第3節(jié)

動物細胞生物制藥應(yīng)用舉例1896192019872006本講主要內(nèi)容1.雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體2.病毒疫苗生產(chǎn)3.海洋生物制藥4.動物細胞培養(yǎng)生物制藥的問題與發(fā)展方向本講關(guān)鍵問題1.雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體的制備原理與技術(shù)流程2.滅活病毒疫苗生產(chǎn)流程第一部分雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體新型人源化單克隆抗體可靶向并殺死癌細胞2013年3月26日PNAS:加州大學(xué)圣地亞哥分校研究人員研制出一種人源化單克隆抗體，可以靶向和直接殺死慢性淋巴細胞白血病（CLL）細胞。CLL細胞高水平表達一種細胞表面糖蛋白受體CD44。RG7356的單克隆抗體可以特異性靶向CD44，對癌細胞產(chǎn)生直接毒性作用，且對正常B細胞影響甚微。單抗藥物相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，單抗藥物2010年全球銷售額達480億美元，成為銷售額最高的生物制劑。至今，共有29只單抗藥物被FDA批準(zhǔn)上市，而單抗銷售額占整個生物藥物市場的35%。業(yè)內(nèi)人士預(yù)計，到2014年，全球前六大暢銷藥物將均為生物技術(shù)藥物，而全球十大暢銷藥物中將有7只是生物技術(shù)藥物，其中6只為重組抗體類藥物。然而，國產(chǎn)單抗產(chǎn)品正處在起步階段，目前已經(jīng)上市的抗體只有9只，絕大多數(shù)在臨床研究或已經(jīng)上市的品種為完全仿制國外上市的產(chǎn)品。有分析預(yù)計，未來10～20年是我國單抗藥物市場快速增長時期，單抗仿制藥物在我國面臨巨大的發(fā)展機遇。問題回顧：什么是細胞融合？有什么優(yōu)點或作用？細胞融合（Cell

fusion）是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技術(shù)。體細胞雜交：克服有性不親和性，實現(xiàn)遠源遺傳重組，在育種方面意義重大。雜交瘤細胞：具有兩親本特性，生物制藥?；A(chǔ)知識回顧（一）免疫學(xué)基礎(chǔ)1.抗原進入動物體內(nèi)對肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細菌、各種細胞等。特點：外源性、結(jié)構(gòu)性（分子具有表面具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團作為識別位點）、特異性（抗原與抗體的反應(yīng)）。2.抗體動物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的物質(zhì)，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）?；パa性決定區(qū)（Complementaritydetermining

region，CDR）

VH和VL的三個高變區(qū)共同組成Ig的抗原結(jié)合部位（Antigen-bindingsite）。該部位形成一個與抗原決定簇互補的表面，決定抗體的多樣性與特異性。多克隆抗體與單克隆抗體動物脾臟有上百萬個B淋巴細胞，一個細胞就是一個克隆，它針對抗原上的一個抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。一種抗原通常具有多個不同的抗原決定族，因此能刺激多個B淋巴細胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。問題的引出血液得到的只能是混合抗體，但是需要大量的僅針對某一個抗原決定族的單克隆抗體，幾乎是不可能的，因此必須采用其他方法。如果我們能分離得到只分泌某一種特異性抗體的B淋巴細胞，不就可以大量生產(chǎn)相關(guān)單抗了嗎？問題：可以實現(xiàn)嗎？有什么技術(shù)限制嗎？很難離體培養(yǎng)B淋巴細胞。

（一）歷史發(fā)現(xiàn)1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞與綿羊紅細胞免疫小鼠脾細胞（B淋巴細胞）進行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征：即像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。

科勒（Kohler）米爾斯坦（Milstein）（二）雜交瘤技術(shù)將骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞融合得到即能夠分泌抗體又能在體外長期繁殖的雜交瘤細胞，經(jīng)過克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)（hydridoma

technique）。（三）單克隆抗體應(yīng)用領(lǐng)域單克隆抗體的特點是：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域：1.作為生物治療的導(dǎo)向武器2.作為免疫抑制劑3.探針4.作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑5.作為親合層析的配體（四）技術(shù)流程視頻：/v_show/id_XMTY1ODg5MDI0.html1.動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備一般要經(jīng)過初次免疫、第二次免役（向動物腹腔內(nèi)注射抗體）、加強免疫（向動物靜脈內(nèi)注射抗體）三個過程。如果需要免疫脾細胞，一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液。2.骨髓瘤細胞的獲得與培養(yǎng)骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高。通常采用HPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）與TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤細胞系。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細胞。保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期。

3.細胞融合（1）取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞，離心，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。（2）將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。（3）30秒內(nèi)加入預(yù)熱的一定濃度、一定分子量的PEG，邊加邊攪拌，在室溫下融合。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用。（4）離心，棄上清，用20％小牛血清等輕輕混懸。將融合后細胞懸液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。4.融合細胞的篩選融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。剩余：脾細胞與瘤細胞的融合細胞+未融合的瘤細胞+融合的瘤細胞和瘤細胞，其中后兩種需進行特別的篩選去除。HAT培養(yǎng)基篩選法培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。篩選原理DNA的合成：正常途徑：糖、氨基酸——核苷酸——DNA

，可以被氨基蝶呤阻斷胸腺嘧啶核苷激酶（TK）補救途徑：核苷酸前體

——核苷酸——DNA

次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）需要以上兩種酶的參與（1）氨基蝶呤可阻斷細胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細胞不能采用該途徑合成DNA。（2）融合所用的瘤細胞一般是HPRT與TK缺陷型，因此也不能采用補救途徑合成DNA。兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？瘤細胞（未融合的和多聚體）命運：因不能正常合成DNA而死亡。融合細胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來自于淋巴細胞內(nèi)的HPRT與TK

，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。5.克隆化培養(yǎng)將融合的細胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數(shù)在0至數(shù)個細胞之間，培養(yǎng)一段時間后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細胞。找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細胞株，增殖后凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)生產(chǎn)抗體。6.分泌抗體的融合細胞的篩選酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）EILSA主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。7.單克隆抗體的大量生產(chǎn)（1）實體瘤法對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107cells／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2

ml。待腫瘤達到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。采血量有限。（2）腹水制備法腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5～20mg/ml，

這是目前最常用的方法。（3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗雜交瘤細胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)液離心除去細胞，收集上清液提取抗體。（五）應(yīng)用舉例問題及方向用小鼠制備的鼠源性單抗屬于異源性蛋白，在人體內(nèi)會引起排異反應(yīng)，有非常嚴(yán)重的毒副作用，制約了其在臨床的廣泛應(yīng)用。人單克隆抗體：生產(chǎn)過程和鼠的單抗一樣，只是采用認(rèn)得B細胞和人的瘤細胞。全人單克隆抗體不存在鼠源性異種蛋白的抗原性，不會被人體免疫系統(tǒng)攻擊，安全。人源化單抗：則是制作出鼠的單抗后，利用基因操作手段，置換或者切除單抗基因中鼠源性的蛋白片斷，弱化其在人體內(nèi)的抗原性，達到療效。我國首個人源化單克隆抗體藥物獲準(zhǔn)上市2006年2月24日一種既能阻止關(guān)節(jié)變形、又能有效治療重度銀屑病的新藥：上海中信國健藥業(yè)有限公司自主研發(fā)的抗體類新藥“注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白”（商品名為“益賽普”）上市。它通過特異性地與人體內(nèi)的腫瘤壞死因子（TNF）結(jié)合，對TNF的活性起負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而抑制人體骨關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，具有治療起效快、療效顯著的特點。由于采用了“全人源化”的重組融合蛋白，這一新藥不良反應(yīng)小。我國的人源化單抗藥物進展腎移植是救治終末期腎病最佳治療選擇，免疫抑制劑在腎移植中的應(yīng)用至關(guān)重要。選擇合理的免疫抑制劑方案，減少毒副反應(yīng)，改善腎移植者長期生存成為新趨勢。2011年4月，由上海中信國健藥業(yè)股份有限公司自主研發(fā)的人源化單抗健尼哌國內(nèi)正式上市，用于腎移植誘導(dǎo)治療，其可降低急性排斥發(fā)生率：將健尼哌加入基礎(chǔ)免疫抑制方案后，移植后3個月急排發(fā)生率降低了43.7%，6個月急排發(fā)生率降低了40.2%；患者1年人腎存活率分別為100%、99.46%。健尼哌上市標(biāo)志著我國抗體藥物研發(fā)水平邁上新臺階。小結(jié)單克隆抗體藥物第二部分病毒疫苗生產(chǎn)12月1日是什么節(jié)日？艾滋?。焊腥救祟惷庖呷毕莶《荆℉IV）后導(dǎo)致免疫缺陷，并發(fā)一系列機會性感染及腫瘤，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡的綜合征。RNA病毒，主要侵犯CD4T細胞、CD4單核細胞和B淋巴細胞。1959年在剛果發(fā)現(xiàn)。1981年12月1日，美國確認(rèn)發(fā)現(xiàn)一種新的傳染性疾病——艾滋?。ㄈ祟惈@得性免疫缺陷綜合征）。1984年確認(rèn)HIV是引起艾滋病的罪魁禍?zhǔn)?。截?011年，全球有HIV攜帶者3420萬人，僅2011年，就約有170萬人死于艾滋病，其中有23萬為不滿15歲的兒童。加拿大西安大略大學(xué)2012年11月6日宣布，他們研制的艾滋病疫苗在第一階段的人體臨床試驗中獲得成功。March

29,

2013Jon

Cohen.

Science

10

May

2013.340.6133.667Science：HIV疫苗

困獸之斗？

SARS事件SARS是指嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥（Severe

AcuteRespiratory

Syndrome，SARS，傳染性非典型肺炎）

。于2002年在中國廣東首發(fā)，并擴散至東南亞乃至全球，2003年中期疫情消失。2004年1月19日，SARS病毒滅活疫苗獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進入一期臨床研究，12月5日完成。但是SARS病毒滅活疫苗并沒有產(chǎn)業(yè)化。冠狀病毒（Coronaviruses）SARS——10年后卷土重來2012年6月，埃及微生物學(xué)家Ali

Mohamed

Zaki首次報告了新冠狀病毒——中東地區(qū)呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。截止到5月6日，共計30例新型冠狀病毒感染確診病例，其中18人死亡。新冠狀病毒的死亡率逼近65%，而SARS病毒雖然在全球造成775人死亡，但死亡率卻只有11%。甲型H1N1流感病毒：2009年4月墨西哥豬流感造成數(shù)150多死亡事件，并在多個國家蔓延。H5N1禽流感：2011年仍有爆發(fā)。H7N9病毒：2013年2月發(fā)現(xiàn)H7N9病毒，由禽類傳播，從上海擴散開來，受感染者中近20%會死亡。據(jù)《華爾街日報》（WSJ）報道，美國Greffex公司5月2日宣布，成功研發(fā)出了首個完整的H7N9禽流感疫苗。然而，從小鼠到人，還需經(jīng)過大動物實驗、臨床前實驗，再到三個階段的臨床試驗。獲得FDA的批準(zhǔn)。而完成初期臨床試驗過程，至少也要幾個月，長則數(shù)年。成功案例——天花疫苗天花是由天花病毒引起的傳染病。傳染性強、肆虐范圍廣、死亡率高。16-18世紀(jì)，超過60%全球人口遭受天花的威脅。1976年，全球推行天花疫苗接種。1980年5月，世界衛(wèi)生組織宣布根除天花。11月2日：世界肺炎日。全球每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌疾病。紅霉素不敏感幾乎達到100%，青霉素達86%。1983年肺炎鏈球菌夾膜多糖疫苗PPV23誕生。2000年針對2歲以下兒童肺炎鏈球菌蛋白結(jié)合疫苗PPV7問世。世界第一大單個疫苗。其它：疫苗有效控制了麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、白喉、破傷風(fēng)、黃熱病、流感和乙型肝炎等傳染性疾病。（一）分類滅活疫苗：通過化學(xué)、物理或簡單加熱的方法使病毒失去在宿主體內(nèi)生長復(fù)制的能力，但仍保留了病毒的免疫原性，接種人體后能產(chǎn)生對此病毒的抵抗力，這種將病毒殺滅后制備的疫苗被稱為滅活疫苗。常用甲醛為滅活劑，滅活病毒核酸而不影響其抗原性。例如：流行性乙型腦炎疫苗、狂犬病疫苗、流感滅活疫苗。減毒活疫苗：采用自然法或人工法通過動物傳代或細胞傳代篩選對人毒性低的變異株病毒。常見的有脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、流感溫度敏感突變株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯(lián)合疫苗（如麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗）。基因工程疫苗、DNA疫苗等。病毒滅活疫苗病毒需要在敏感細胞中才能增殖。通過動物細胞培養(yǎng)繁殖病毒。大致步驟：1.找到病毒敏感細胞2.進行病毒的分離3.病毒生產(chǎn)4.動物實驗5.I、II、III期臨床實驗6.滅活疫苗制品

（二）病毒生產(chǎn)方法1.動物接種：例如狂犬病毒，采用鼠、兔腦內(nèi)接種后收取腦組織制成懸液。2.雞胚、鴨胚接種：如馬腦炎病毒采用10D齡雞胚接種，收獲全胚體液。3.細胞培養(yǎng)法：不同的病毒采用相應(yīng)的敏感細胞，接種一定量的病毒，培養(yǎng)一段時間，凍融細胞，離心收獲上清。一般流程：流行性乙型腦炎病毒滅活疫苗制備工藝地鼠腎——剪碎，胰酶消化——地鼠腎細胞懸浮液——培養(yǎng)——接種病毒感染細胞——培養(yǎng)2-3天收獲病毒液——甲醛滅活（22度，8天）——滅活病毒液——安全及效力實驗——半成品——分裝——成品

（三）應(yīng)用舉例狂犬病毒（Rabies

Virus）疫苗生產(chǎn)狂犬病是由狂犬病毒（Rabies

Virus）

引起的人畜共患的傳染病狂犬病毒屬于彈狀病毒科彈狀病毒屬。外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內(nèi)含有單鏈RNA。是引起狂犬病的病原體。

人被患狂犬病的動物咬傷、抓傷或經(jīng)粘膜感染均可引起狂犬病。感染者發(fā)病時呈高度興奮狀態(tài)，并伴有發(fā)熱、頭痛、恐怖不安、驚風(fēng)怕聲、肢體發(fā)麻、吞咽困難，一旦喝水即引起嚴(yán)重痙攣等癥狀，出現(xiàn)恐水現(xiàn)象，故又稱“恐水癥”（hydrophobia）。路易·巴斯德路易·巴斯德（Louis

Pasteur，1822年12月27日－1895年9月28日），法國微生物學(xué)家、化學(xué)家，微生物學(xué)的奠基人之一。倡導(dǎo)疾病細菌學(xué)說（胚種學(xué)說）和發(fā)明預(yù)防接種方法而聞名，他亦是第一個創(chuàng)造狂犬病和炭疽的疫苗的科學(xué)家。被視為細菌學(xué)之祖。早在1885年，路易?巴斯德證明狂犬病毒能通過兔神經(jīng)系統(tǒng)重復(fù)傳代而減毒，并制備出有效的疫苗首次用于人體免疫，從而開創(chuàng)了人用狂犬病疫苗的發(fā)展史?？袢《疽呙绨l(fā)展史1908年Fermi通過在室溫下用1%酚處理腦組織改進了巴斯德的方法，但是液中仍有高達100MLD50的殘余毒力。1911年Semple在此基礎(chǔ)上作了進一步改進，將腦組織懸液于37℃用酚固定、滅活，制備了無毒性的Semple疫苗。1925年Hempt通過補加乙醚處理，進一步確保了疫苗的無毒性。使用Semple疫苗后嚴(yán)重的神經(jīng)麻痹事故的發(fā)生率在1/500-1/2000，這種疫苗目前在發(fā)展中國家仍在廣泛使用。我國自1949年起，一直使用由羊腦制備的Semple疫苗，直至1980年停止使用